Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4456_1.pdf: 431075 bytes, checksum: ca4fdd72243f43c081dfa7c6fc13d9f7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Os carrapatos são ectoparasitas responsáveis por severa perda econômica, principalmente no que concerne a transmissão de patógenos e toxinas, como vetores potenciais. Para se minimizar os prejuízos na bovinocultura e conseqüente ecotoxidade o uso de fungos entomopatogênicos para o controle de carrapato vêm se consolidando por sua segurança biológica. O trabalho avaliou a ação in vitro dos fungos Paecilomyces lilacinus e Paecilomyces farinosus sobre teleóginas de Boophilus microplus. As fêmeas ingurgitadas foram tratadas com suspensões fúngicas de 104 e 108 conídios/mL após serem coletadas quando da queda do corpo do animal e mantidas a temperatura ambiente. Foi realizada a infecção de 16 fêmeas para cada concentração, para as quais se tinha um grupo controle com o mesmo número de indivíduos. Avaliou-se os seguintes parâmetros biológicos: peso ínicial da fêmea; peso residual da fêmea; peso da massa de ovos; índice de produção de ovos; percentual de eclosão; período de prépostura; período de postura; período de incubação; período de eclosão e eficiência reprodutiva. Como resultado, observou-se para P. lilacinus um peso ínicial das fêmeas de (0,144tratado e 0,207controle) e para P. farinosus (0,180tratado e 0,161controle) 104 conídios/mL; o peso massa de ovos diminuiu para P. lilacinus (0,046tratado e 0,099controle) e para P. farinosus aumentou (0,087tratadoe 0,063 controle) 108 conídios/mL; índice produção de ovos diminuiu em P. lilacinus (33,70%tratado e 45,37%controle) e em P. farinosus aumentou (51,24%tratado e 39,43%controle)108 conídios/mL; o percentual de eclosão diminuiu em P. lilacinus (12,28%tratado e 84,63%controle) e em P. farinosus aumentou (71,54%tratado e 99,16%controle)108 conídios/mL; período de pré-postura aumentou em P. lilacinus (2,28diastratado e3,44diascontole)104conídios/mL e em P.farinosus aumentou (2,75diastratado e 2,31diasc) 108 conídios/mL; período de postura diminuiu em P. lilacinus (7,46diastratado e 9,19diasc) e em P.farinosus aumentou (6,81diastratado; e 5,06 diascontrole) 108 conídios/mL ; período de incubação aumentou em P. lilacinus (20,46diastratado e 20,18diascontrole) e em P.farinosus aumentou (22,98 diastratado e 22,38 diascontrole) 108 conídios/mL; período de eclosão aumentou em P. lilacinus (3,12 diastratado e 1,74diascontrole) 108 conídios/mL e em P.farinosus aumentou (3,03diastratado e 1,66diascontrole) 104conídios/mL; eficiência reprodutica em P. lilacinus (30699,16%) e em P. farinosus (570840,99%). O trabalho ainda avaliou: Germinação, Esporulação, Número e Diâmetro de colônia após a passagem no carrapato. Como resultado observou-se para P. lilacinus um aumento no percentual de germinação (12,35%tratado e 0,92%controle) e em P.farinosus diminuiu (10,72%tratado e 11,53controle) 108 conídios/mL; a esporulação aumentou para P. lilacinus (530,33%tratado e 96,26%controle) 104conídios/mL e em P.farinosus diminuiu (13,93%tratada e 65,03%controle)108 conídios/mL; o número de colônia para P. lilacinus diminuiu (78,22tratado e 79,02controle) e em P.farinosus, também (0,00tratado e 9,78 controle)104conídios/mL; o diâmetro de colônia em P. lilacinus aumentou (7,10tratado e 4,95controle) 104conídios/mL e em P. farinosus diminuiu (2,85tratado e 2,67controle) (P>0,05)

FARIAS, E. X.; Estudo do potencial citotóxico dos metabólitos secundários isolados do fungo marinho Paecilomyces lilacinus recuperado de sedimentos da costa cearense. 2014. 75 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2014-11-06T19:05:31Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_exfarias.pdf: 1698626 bytes, checksum: 3e42b969523d270d3b160dac9debf481 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-11-11T20:43:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_exfarias.pdf: 1698626 bytes, checksum: 3e42b969523d270d3b160dac9debf481 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-11T20:43:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_exfarias.pdf: 1698626 bytes, checksum: 3e42b969523d270d3b160dac9debf481 (MD5) Previous issue date: 2014 / The bioprospection of cytotoxic secondary metabolites produced by Paecilomyces lilacinus (fungal strain BRF053) recovered from sediments collected at Pecém beach, Ceará state, was investigated. First, the production of compounds by the fungal strain was performed by culturing the microorganism in potato-dextrose broth (PDB) for 7, 14, 21 and 28 days. Both HPLC analysis and cytotoxic activity (tumor cell line HCT-116) of the extracts from each period of culture revealed 14 days as the optimum time for producing cytotoxic compounds (growth inhibition 85.7 %). Bioguided fractionation of the organic extract from the fungus cultured in large scale under the same conditions (14 days) allowed the isolation of the steroids wortimannin and 11-deacetoxywortimannin, both new compounds in Paecilomyces. These compounds were isolated by chromatography column and HPLC, and their st ructures were elucidated by spectrometric methods (HRMS, 1H, 13C NMR, and IR) besides comparison with literature data. Dereplication of the extract by LC-MS suggested the presence of cyclosinefungin, stanna A, virescenoside-D, (+)-esclerotiorin, 2'-Amino-2'-deoxiguanosine, fumaramidimicin e deoxynivalenol, all of the new compounds in Paecilomyces. / Este trabalho descreve o estudo de bioprospecção de metabólitos secundários citotóxicos do Pecém-CE. Inicialmente, foi realizado o estudo cinético da produção de metabólitos secundários por P. lilacinus cultivado no meio de batata-dextrose (BD) durante 7, 14 21 e 28 dias. Através da análise cromatográfica dos extratos, bem como dos resultados de atividade citotóxica dos mesmos, frente à linhagem de célula tumoral HCT -116 (câncer de cólon), foi possível selecionar o extrato oriundo do crescimento do fungo por 14 dias (inibição de crescimento: 85,7 %) como o mais citotóxico. O fracionamento bioguiado do extrato orgânico do fungo cultivado por 14 dias em grande escala levou ao isolamento dos esteróides wortimanina e 11-deacetoxiwortimanina, ambos inéditos no gênero Paecilomyces. Os metabólitos secundários foram isolados at ravés de métodos cromatográficos usuais e CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência). A caracterização estrutural foi realizada através do uso de métodos espectrométricos, especialmente espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear (1 H e 13 C) e infravermelho, além de comparação de dados da literatura. Também foi realizado um estudo de desreplicação do extrato, o qual sugeriu a presença dos compostos ciclosinefungina, estatana A, virescenosideo -D, (+)-esclerotiorina, 2'-Amino-2'-deoxiguanosina, fumaramidimicina e deoxinivalenol, todos inéditos no gênero Paecilomycesproduzidos por Paecilomyces lilacinus (cepa BRF053) recuperado de sedimentos da praia.

Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii. / Microbial amylases have biotechnological applications mainly for the conversion of starch to maltose or glucose syrup. The aim of this work was to study amylases produced by the fungus Paecilomyces variotii, isolated from Psidium guajava leaves. The best growth conditions for enzymatic production were standardized, using SR medium, pH 7.0, supplemented with 1.5% oat flour as carbon source, inoculated with 1.75x108 conidia/mL, at 30ºC, without agitation, for 6 days. The fungus developed in a wide range of pH (3-8), osmotic concentration (0-15% NaCl), and high temperatures (up to 45ºC), which characterized it as a tolerant microorganism at extreme environment. The amylases were purified by sequential elution in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography, being in the last step resolved two amylolytic forms (PI and PII). PI was submitted to electroelution resulting in an ?-amylase purified 16.1-fold, with 8.9% recuperation. PII was characterized as a glucoamylase, with a recovery and purification factor of 6.2% and 47.9-fold, respectively. Analysis in PAGE showed that the enzyme was homogeneous and the amylolytic activities (?-amylase and glucoamylase) were confirmed after PAGE, revealing the gels for activity using both iodine and glucose-oxidase. Analysis by Thin Layer Chromatography confirmed the character of these enzymes, which released either maltose and maltotriose (PI), or only glucose (PII), as the main products of starch hydrolysis. ?-amylase and glucoamylase presented molecular masses in SDS-PAGE of 75 kDA and 86.5 kDa, respectively. Optimal pH and temperature were 4.0 and 60ºC for ?-amylase, and 5.0 and 55ºC for glucoamylase. Thermostability analysis showed that both enzymes were stable up to 60ºC. Higher temperatures decreased amylolytic activities. The amylases were stable in all pH tested (2.5-8.0), being higher in acid pH for glucoamylase, and the opposite for ?amylase. Addition of starch in the assay favored the stability of glucoamylase, but it was inhibited by addition of glucose (end product). In contrast, starch protected ?-amylase activity in periods higher 40 minutes and the enzyme was not inhibited by the end product. The isoelectric point and carbohydrate content were 3.5 and 27.5% for glucoamylase and 4.5 and 23% for ?-amylase, respectively. The glucoamylase and ?-amylase of P. variotii hydrolyzed preferentially starch Reagen® and Sigma®, respectively. Km and Vmax values were determined for several substrates, being estimated a catalytic efficiency favorable to amylopectin for glucoamylase and starch Reagen® for ?-amylase. The glucoamylase activity was tested with several metal ions, but only 5mM Mn2+ increased the activity in 80.7%. The ?-amylase was activated by 1mM Ca2+ (65%) and Co2+ (60%). Circular dichroism analysis supplied additional information about the glucoamylase structure, since the protein showed to be rich in ?-helix but ?-amylase showed to be a mixture of ?-helix and ?-sheet. By the analysis in Western Blotting was possible to determine some structural homology between the glucoamylases produced by Paecilomyces variotii and Scytalidium thermophilum, that is in agreement with published information, since the genera Paecilomyces is related, from the evolutionary viewpoint, with Talaromyces. This information were confirmed with the data from mass spectrometry for the glucoamylase of P. variotii, which a sequenced fragment of protein glucoamylase of this microorganism presented homology with the same enzyme produced by Talaromyces emersonii.

Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii. / Microbial amylases have biotechnological applications mainly for the conversion of starch to maltose or glucose syrup. The aim of this work was to study amylases produced by the fungus Paecilomyces variotii, isolated from Psidium guajava leaves. The best growth conditions for enzymatic production were standardized, using SR medium, pH 7.0, supplemented with 1.5% oat flour as carbon source, inoculated with 1.75x108 conidia/mL, at 30ºC, without agitation, for 6 days. The fungus developed in a wide range of pH (3-8), osmotic concentration (0-15% NaCl), and high temperatures (up to 45ºC), which characterized it as a tolerant microorganism at extreme environment. The amylases were purified by sequential elution in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography, being in the last step resolved two amylolytic forms (PI and PII). PI was submitted to electroelution resulting in an ?-amylase purified 16.1-fold, with 8.9% recuperation. PII was characterized as a glucoamylase, with a recovery and purification factor of 6.2% and 47.9-fold, respectively. Analysis in PAGE showed that the enzyme was homogeneous and the amylolytic activities (?-amylase and glucoamylase) were confirmed after PAGE, revealing the gels for activity using both iodine and glucose-oxidase. Analysis by Thin Layer Chromatography confirmed the character of these enzymes, which released either maltose and maltotriose (PI), or only glucose (PII), as the main products of starch hydrolysis. ?-amylase and glucoamylase presented molecular masses in SDS-PAGE of 75 kDA and 86.5 kDa, respectively. Optimal pH and temperature were 4.0 and 60ºC for ?-amylase, and 5.0 and 55ºC for glucoamylase. Thermostability analysis showed that both enzymes were stable up to 60ºC. Higher temperatures decreased amylolytic activities. The amylases were stable in all pH tested (2.5-8.0), being higher in acid pH for glucoamylase, and the opposite for ?amylase. Addition of starch in the assay favored the stability of glucoamylase, but it was inhibited by addition of glucose (end product). In contrast, starch protected ?-amylase activity in periods higher 40 minutes and the enzyme was not inhibited by the end product. The isoelectric point and carbohydrate content were 3.5 and 27.5% for glucoamylase and 4.5 and 23% for ?-amylase, respectively. The glucoamylase and ?-amylase of P. variotii hydrolyzed preferentially starch Reagen® and Sigma®, respectively. Km and Vmax values were determined for several substrates, being estimated a catalytic efficiency favorable to amylopectin for glucoamylase and starch Reagen® for ?-amylase. The glucoamylase activity was tested with several metal ions, but only 5mM Mn2+ increased the activity in 80.7%. The ?-amylase was activated by 1mM Ca2+ (65%) and Co2+ (60%). Circular dichroism analysis supplied additional information about the glucoamylase structure, since the protein showed to be rich in ?-helix but ?-amylase showed to be a mixture of ?-helix and ?-sheet. By the analysis in Western Blotting was possible to determine some structural homology between the glucoamylases produced by Paecilomyces variotii and Scytalidium thermophilum, that is in agreement with published information, since the genera Paecilomyces is related, from the evolutionary viewpoint, with Talaromyces. This information were confirmed with the data from mass spectrometry for the glucoamylase of P. variotii, which a sequenced fragment of protein glucoamylase of this microorganism presented homology with the same enzyme produced by Talaromyces emersonii.

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T15:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Battestin_Vania_D.pdf: 4281162 bytes, checksum: b173ac91bb78b5cc016fe8016611c298 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A tanino acil hidrolase conhecida como tanase (E.C: 3.1.1.20) é uma enzima produzida por fungos filamentosos, leveduras e bactérias. São caracterizadas por sua atividade em complexos polifenólicos, sendo capazes de hidrolisar ligações éster (entre o grupo anel aromático e o resíduo de glicose) e ligações depsídicas (ligação éster entre os anéis aromáticos) em substratos como ácido tânico, epicatequina galato, epigalocatequina galato entre outros. O objetivo deste trabalho foi selecionar linhagens de fungos produtores de tanase e estudar a produção, purificação, caracterização e aplicação desta enzima. A produção da tanase pelas linhagens de fungos selecionados foi testada em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais de café e uva com 0,5% e 1,5% de ácido tânico. A linhagem LAB 153G, identificada como Paecilomyces variotii, se destacou produzindo 0,275 U/mL de tanase em meio contendo resíduo de café. No estudo de otimização da produção de tanase pela linhagem P. variotii utilizando metodologia de superfície de resposta, foi obtido um aumento de 9 vezes na produção da enzima, utilizando-se as seguintes condições: faixa de temperatura de 29-34ºC, meio de cultivo contendo resíduo de café.farelo de trigo, 50% : 50% (p/p), ácido tânico 8-14% e tempo de incubação de 5 dias. A preparação de tanase bruta apresentou atividade ótima em pH 6,5 e 70ºC e estabilidade na faixa de pH 4,0-7,5 após 24 h de incubação a 30ºC. A enzima bruta mostrou-se estável após 30 min de tratamento a 70ºC em pH 6,0. A tanase purificada mostrou atividade ótima em pH 5,5 e 50ºC; e estabilidade máxima na faixa de pH 4,5 ¿ 6,5 após 12 h de incubação a 30ºC. A enzima purificada mostrou-se estável após 30 min de tratamento a 50ºC. A tanase extracelular foi também purificada cerca de 19,3 vezes, utilizando precipitação com sulfato de amônio seguida de purificação com cromatografia de troca iônica (DEAE-Sepharose). A tanase de P. variotii apresentou valor de Km igual a 0,61 µM e Vmáx igual a 0,55 U/mL, para o substrato ácido tânico. No estudo de aplicação da tanase em substratos naturais como epigalocatequina galato extraído de chá verde, foi verificado que os produtos obtidos da hidrólise apresentaram maior atividade antioxidante quando comparado com epigalocatequina galato / Abstract: Tannin acyl hydrolases, commonly referred to as tannases (E.C. 3.1.1.20), are inducible enzymes produced by fungi, yeast and bacteria. Tannases have been mostly characterized by their activity on polyphenolic complexes, are able to hydrolyse the ¿ester¿ bond (galloyl ester of an alcohol moiety) and the ¿depside¿ bond (galloyl ester of gallic acid) in substrates such as tannic acid, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, chlorogenic acid. The objective of this work was to select tannase producing fungi and to study the production and characterization of this enzyme. These fungi lineages were tested in vegetable residues as coffee and grape, adding 0.5 and 1.5% of tannic acid in the fermentation media. The best result was obtained using LA153G and coffee residues with activity 0.275 U/mL; the best tannase producing fungus was identified as Paecilomyces variotii. This strain was used for the optimization of enzyme production by experimental design method. After the optimization process, the tannase activity increased by 9 times. According to the optimization process, the best conditions for tannase production by the lineage of P. variotii were: temperature 29 to 34 ºC; % residue, coffee husk:wheat bran - 50:50 (p/p), tannic acid 8 to15 % and 5 days of fermentation. The biochemical properties of tannase were determined. Temperature 70 ºC and pH values from 6.5 were optimum for crude tannase activity. Tannase showed stability at pH 4.0-7.5 after 24 h the incubation at 30ºC. The tannase was stable in a temperature 70 ºC after 30 min in pH 6.0. The purified tannase showed optima activity in pH 5.5 and 50ºC; stability at pH 4.5-6.5 after 12 h the incubation at 30ºC. The tannase was stable in a temperature 50ºC after 30 min. An extracellular tannase was partially purified using ammonium sulphate precipitation followed by DEAE-Sepharose ion exchange chromatography. DEAE-Sepharose column chromatography led to an overall purification of 19.3 fold. The tanase showed values for Km of 0.61 µM and Vmax of 0.55 U.mL-1. The activity of crude tannase on the epigallocatechin gallate extract of green tea was investigated. This work establish a relationship between the antioxidants effects of epigallocatechin gallate compared to the obtained enzymatic reaction products (epigalocatechin and gallic acid) / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadora : Profª Drª Joana Léa Meira Silveira / Orientadora : Drª Andrea Caroline Ruthes / Co-orientador : Prof. Dr. Jaime Paba Martinez / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 13/02/2014 / Inclui referências / Resumo: A indústria têxtil representa um importante setor na economia brasileira e mundial que vem crescendo nos últimos anos. No entanto, devido à complexidade dos efluentes eliminados em corpos de água, destaca-se como uma potencial contribuinte à degradação ambiental. Diversos problemas ambientais são inerentes às dificuldades no tratamento dos efluentes têxteis, especialmente em relação à remoção da cor intensa, causada pela presença de corantes oriundos do processo de tingimento de fibras têxteis. Dentre as formas de tratamento de efluentes, o processo de biossorção, através do uso de fungos tem se destacado. Neste processo geralmente a molécula de corante é adsorvida pela parede celular fúngica, composta por lipídeos, proteínas e principalmente polissacarídeos, os quais são frequentemente associados à biossorção. Sendo assim, o fungo Paecilomyces sp. foi avaliado quanto a capacidade biossortiva de seu micélio para processos de descoloração de corantes têxteis. Além disso, foi possível avaliar a relação de polissacarídeos extraídos da parede celular com o processo de biossorção. Entre os resultados obtidos foi observado que o crescimento e a capacidade biossortiva do fungo são alterados pela composição (fontes de carbono, nitrogênio e suplementação) do meio de cultivo. A biomassa micelial de Paecilomyces sp. com o melhor índice de biossortividade foi crescida em meio contendo maltose 15 g/L e tartarato de amônio 100 mM. Cultivado nestas condições, o micélio apresentou capacidade biossortiva para corantes têxteis de diferentes classes e estruturas químicas, sendo que a eficiência de descoloração foi alterada com pré-tratamentos químicos, destacando-se o tratamento com NaOH que aumentou em até 43 % a eficiência de descoloração pela biomassa. Além disso, foi observado que o aumento do tempo de contato entre a biomassa micelial e a solução de corante, e o aumento na concentração de biossorvente proporcionam aumento na eficiência de descoloração. Porém, em diferentes concentrações de NaCl e temperaturas a eficiência de descoloração permanece inalterada. A biomassa micelial também apresentou possibilidade de reuso, pelo processo de dessorção com solução de NaOH 0,1 M. Quanto aos polissacarídeos da parede celular de Paecilomyces sp., foram purificadas cinco frações polissacarídicas, IHW, SFHW, RSFK2, ESFK2 e PDIK2, todas compostas por heteropolissacarídeos com diferentes proporções de manose, galactose e glucose. Dentre as frações polissacarídicas insolúveis, a fração PDIK2 proveniente da extração da fração IK2 com DMSO, apresentou eficiência de descoloração de 86 %. A mesma fração após tratamento com pronase E, manteve a eficiência de descoloração acima de 70 %, sugerindo a isenção da porção proteica da fração no processo de biossorção de corante. No entanto, após o tratamento com glicosidase de Trichoderma harzianum, a fração PDIK2 apresentou diminuição na eficiência de descoloração, sugerindo que a porção polissacarídica seja a principal envolvida na capacidade biossortiva do fungo. Palavras-chave: Biossorção de corantes. Paecilomyces sp. Polissacarídeos de parede celular. Polissacarídeos de fungos filamentosos. / Abstract: The textile industry is an important sector in the Brazilian and world economy and has been growing in recent years. However, due to the complexity of their effluent disposed into water bodies, stands out as a potential contributor to environmental damage. Several environmental problems are inherent to difficulties in treating textile wastewater particularly in relation to the removal of intense color caused by the presence of dyes derived from the dyeing process of textile fibers. Among the forms used in wastewater treatment, the biosorption process using fungi has been outstanding. In this process, the dye molecule is usually adsorbed by the fungal cell wall, composed of lipids, proteins, and especially carbohydrates, which are often associated with the biosorption. Therefore, the fungus Paecilomyces sp. was investigated in this study about its mycelium biosorption capacity for bleaching processes of textile dyes. Moreover, it was possible to evaluate the relationship of polysaccharides extracted from the cell wall with the biosorption process. Among the results was observed that growth and biosorption capacity of the fungus are changed by the composition (sources of carbon, nitrogen and supplementation) of the culture medium. The Paecilomyces sp. mycelial biomass that had the best biosorption capacity was grown in medium containing maltose 15 g/L and 100 mM ammonium tartrate. Mycelium grown under these conditions showed biosorption capacity for different classes of textile dyes and chemical structures, and the efficiency of discoloration was changed by chemical pretreatments, especially with NaOH, which raised up to 43 % biomass efficiency of discoloration. Furthermore, it was observed that increasing the time of contact between the mycelial biomass and the dye solution, and the increase in the concentration of biosorbent provide increased efficiency of discoloration. However, in different concentrations of NaCl and temperatures discoloration efficiency remains unchanged. The mycelial biomass also showed possibility of reuse, by desorption process with NaOH 0.1 M. As to the cell wall polysaccharides of Paecilomyces sp. at least five polysaccharide fractions, IHW, SFHW, RSFK2, ESFK2 and PDIK2 all composed by heteropolysaccharides with different ratios of mannose, galactose and glucose were purified. Among the insoluble polysaccharide fractions, the fraction PDIK2 derived from extraction of fraction IK2 with DMSO showed a discoloration efficiency of 86 %. The same fraction after treatment with proteinase, kept the discoloration efficiency above 70 %, suggesting the exemption of the protein portion in the dye biosorption process. However, after treatment with the glycosidase fraction PDIK2 showed a decrease in the efficiency of discoloration, suggesting that the polysaccharide portion is engaged in the main biosortion capacity. Key-words: Dye biosorption. Paecilomyces sp. Cell wall polysaccharides. Filamentous fungi polysaccharides.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4621_1.pdf: 3366454 bytes, checksum: 0f8d7fbcd9aea57e993d99f860f0e9f1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O cupim asiático, Coptotermes gestroi, é considerado praga nas áreas urbanas, causando danos expressivos em casas, edifícios e árvores. Esta pesquisa avaliou a patogenicidade de Paecilomyces farinosus URM4993 e Paelomyces farinosus URM4995 sobre operários de C. gestroi. Os insetos foram pulverizados nas concentrações de 104 a 108 conídios/mL, mantidos em BOD a 25ºC e 80% de umidade relativa e determinada a Concentração Letal (CL50) e Tempo Letal (TL50). Foi avaliada a produção de conídios sobre os insetos mortos e analisados os aspectos biológicos referentes à germinação, esporulação, crescimento radial e microestruturas, antes e após a infecção em C. gestroi. O fungo foi patogênico ao cupim, causando mortalidade em todas as concentrações utilizadas, sendo que P. farinosus URM4993 foi mais virulenta, apresentando mortalidade de 100%, após o 6º dia de inoculação (CL50 de 4,86 x 105 conídios/mL e TL50 de 2,26 dias). A esporulação nos insetos mortos não diferiu entre as linhagens. O percentual de germinação foi maior nas linhagens reisoladas. P. farinosus URM4993 apresentou maior esporulação do que P. farinosus URM4995. O crescimento micelial de P. farinosus URM4995 foi maior do que seu reisolado, a partir do 9º dia de análise. Não foram observadas diferenças morfológicas das linhagens após a passagem pelo hospedeiro. Esses resultados demonstraram a patogenicidade e virulência das linhagens testadas, sendo que P. farinosus URM4993 foi mais eficiente, indicando seu potencial para o biocontrole de C. gestroi

O arroz (Oryza sativa L.) está entre as culturas mais importantes do mundo, tanto em valores de produção quanto em contribuição para a alimentação humana. A mancha parda, causada pelo fungo Bipolaris oryzae, destaca-se entre as principais doenças que afetam o arroz por reduzir a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos colhidos, colocando em risco a segurança alimentar de mais da metade da população mundial. O biocontrole de doenças como a mancha parda apresenta-se como uma alternativa mais sustentável em comparação ao controle químico que, por sua vez, apresenta elevados custos financeiro e ambiental. Os objetivos desse trabalho foram isolar micro-organismos antagonistas de solo com potencial de utilização no biocontrole da mancha parda, elucidar alguns dos mecanismos de ação ocorrentes no antagonismo entre os micro-organismos isolados e B. oryzae, avaliar os efeitos dos filtrados de cultivos dos micro-organismos isolados sobre o desenvolvimento do fitopatógeno e avaliar a eficácia dos micro-organismos isolados no controle da mancha parda em folhas de arroz. Dois micro-organismos antagonistas foram selecionados pela capacidade de produzirem metabólitos que inibem o crescimento de outros micro-organismos. Os antagonistas foram identificados como Paecilomyces lilacinus e Bacillus amyloliquefaciens ou B. methylotrophicus (o fragmento sequenciado de gDNA apresentou nível idêntico de similaridade para ambas as espécies), micro-organismos já utilizados na formulação de produtos biológicos para o controle de doenças de plantas. Bacillus spp. e P. lilacinus inibiram o crescimento micelial de B. oryzae em 52,5% e 37,3%, respectivamente, em ensaio de pareamento de culturas. Ambos os micro-organismos isolados foram capazes de inibir, também, o crescimento de outros importantes fitopatógenos como Magnaporthe oryzae, Sclerotinia sclerotiorum e Phytophthora infestans. Além dos metabólitos dissolvidos no meio de cultivo, foi verificada a produção de compostos orgânicos voláteis (COVs) pelos antagonistas. Bacillus spp. e P. lilacinus produziram COVs que reduziram o crescimento de B. oryzae em 19,3% e 20,6% respectivamente. Os filtrados de cultivo de Bacillus spp. e P. lilacinus apresentaram efeito fungistático sobre o desenvolvimento de B. oryzae. O filtrado da bactéria inibiu o crecimento, a esporulação e a germinação daquele patógeno em 74,7%, 94,2% e 100% respectivamente. O filtrado do fungo, por sua vez, foi capaz apenas de reduzir o crecimento micelial do patógeno (39,4%). Os metabólitos produzidos por Bacillus spp. demonstraram ser foto e termoestáveis; enquanto que os produzidos por P. lilacinus perderam sua atividade inibitória na presença de luz ultravioleta de comprimento longo. O biocontrole da mancha parda foi avaliado em segmentos de folhas de arroz tratadas, separadamente, com suspensão de células e esporos de Bacillus spp. e P. lilacinus respectivamente, e em seguida inoculadas com esporos de B. oryzae. Não houve redução da incidência e da severidade da doença através do tratamento de segmentos de folhas de arroz com suspensões de células e esporos dos antagonistas. No presente estudo, os micro-organismos antagonistas isolados de solo foram capazes de inibir in vitro o crescimento de B. oryzae e outros 3 fitopatógenos; porém, nas condições experimentais avaliadas, não foram eficazes no controle in vivo da mancha parda. / Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important crops in the world in terms of total production and contribution to human diet. Brown spot of rice, caused by the fungus Bipolaris oryzae, is among the diseases that most affect this crop, reducing both yield and grain quality, and threatening food security for millions of people across the world. Biological control is considered a more sustainable approach to control plant diseases since pesticides application presents higher economical and environmental costs. The objectives of this study were: isolating antagonistic microorganisms from soil which show potential for use in the biocontrol of brown spot; elucidating some of the antagonistic mechanisms of the interaction among the plant pathogen and the isolated microorganisms; assessing the effect of cell-free culture filtrates from the antagonists on the development of B. oryzae; and evaluating the efficacy of the antagonistic microorganisms on the biocontrol of brown spot in rice leaves. Two microorganisms were selected because of the production of metabolites wich showed inhibitory effects on other microorganisms. The selected antagonists were identified as Bacillus amyloliquefaciens or B. methylotrophicus (gDNA sequenced fragments presented high similarity to both species), and Paecilomyces lilacinus, which are already used as commercial biocontrol products. Bacillus spp. and P. lilacinus inhibited mycelial growth of B. oryzae in 52.5 and 37.3%, respectively, in dual plate assays. Both microorganisms also inhibited mycelial growth of other important plant pathogens such as Magnaporthe oryzae, Phytophthora infestans and Sclerotinia sclerotiorum. Besides the production of metabolites dissoveld in the culture medium, the antagonism among B. oryzae and the isolated microorganisms also involves volatile organic compounds (VOCs). Bacillus spp. and P. lilacinus produced VOCs which reduced mycelial growth of that pathogen in 19.3 and 20.6% respectively. The cell-free culture filtrate from both antagonists showed fungistatic effetcs on the development of B. oryzae. The filtrate obtained from Bacillus spp. inhibited mycelial growth (74.7%), spore formation (94.2%) and germination (100%) of the plant pathogen. On the other hand, the antagonistic fungus filtrate was only effective on the reduction of the mycelial growth of B. oryzae (39.4%). While the metabolites produced by Bacillus spp. remained stable after heat and light treatments, the ones produced by P. lilacinus lost their inhibitory activity under near-ultraviolet light exposure. Brown spot biocontrol was assessed in detached rice 5-cm leaf segments treated, simultaneously, with a spore suspension of B. oryzae and cell suspension of Bacillus spp. or spore suspension of P. lilacinus. No reduction in disease incidence and severity was observed in leaves treated with the antagonists in comparison to control (water). In the present study, the antagonistic microorganisms isolated from soil inhibited in vitro the mycelial growth of B. oryzae and other three plant pathogens; however, they were not able to control brown spot in rice leaves in the experimental conditions used.

A amplificação in vitro de DNA, utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR), tem sido estudada como uma alternativa aos tradicionais métodos de detecção de micro-organismos contaminantes em tanques de armazenagem de biodiesel. Neste sentido, objetivou-se padronizar um método rápido e eficaz para detecção de Paecilomyces variotii utilizando-se a técnica de PCR e avaliar o desenvolvimento de P. variotii em amostras contendo diesel puro (B0), mistura diesel/biodiesel (B7) e biodiesel puro (B100). Em sistemas contendo meio mínimo mineral e misturas diesel/biodiesel, após 60 dias, verificou-se que o micro-organismo desenvolveu biomassa significativamente superior em B7 e B100 quando comparados a B0. A técnica de PCR foi capaz de detectar um mínimo de 103 esporos/mL de P. variotii em suspensão com água, correspondente a 0,0144 ng de DNA/μL, e demonstrou ausência de reações inespecíficas frente aos fungos Aspergillus fumigatus e Pseudallescheria boydii. Entretanto, o método mostrou-se ineficaz para detecção de P. variotii em amostras contendo diesel, biodiesel ou misturas de diesel/biodiesel. / The in vitro amplification of DNA using polymerase chain reaction (PCR), has been studied as an alternative to traditional methods for detecting microorganisms contaminating biodiesel storage tanks. In this sense, the aim of this study was to standardize a fast and effective method for detection of Paecilomyces variotii using the PCR technique and evaluate the development of P. variotii in samples containing pure diesel (B0), blend diesel/biodiesel (B7) and pure biodiesel (B100). In systems containing mineral minimal medium and diesel/biodiesel blends after 60 days, it was found that the microorganism biomass developed significantly higher in B7 and B100 when compared to B0. The PCR technique was able to detect a minimum of 103 spores/mL of P. variotii in suspension with water, corresponding to 0,0144 ng DNA/μL, and showed no nonspecific reactions against the fungi Aspergillus fumigatus and Pseudallescheria boydii. However, this method proved to be ineffective for the detection of P. variotii in samples containing diesel, biodiesel or diesel/biodiesel blends.

Made available in DSpace on 2014-08-11T12:37:22Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) danielly_sequeira_ipec_mest_2012.pdf: 2424681 bytes, checksum: ed24d6708879c54afddd527d203840cd (MD5) danielly_sequeira_ipec_mest_2012.pdf.txt: 173996 bytes, checksum: ecd8de971059c558c0dce338c325180f (MD5) danielly_sequeira_ipec_mest_2012.pdf.jpg: 1397 bytes, checksum: c17355da56b89d0e6c266d9afe07e708 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Paecilomyces lilacinus é um fungo filamentoso, hialino, assexuado e agente causal da hialohifomicose. Esse fungo é considerado um patógeno emergente e oportunista capaz de infectar crianças, adultos imunossuprimidos, como também imunocompetentes. O presente trabalho objetivou estudar a resposta à infecção, in vivo, de camundongos C57BL/6, imunocompetentes e imunossuprimidos, frente a P. lilacinus. Dois isolados de origem humana do fungo foram avaliados quanto à virulência, tendo como critérios, sinais clínicos, sobrevivência, índice esplênico, lesões histológicas nos animais e reisolamento de células fúngicas viáveis do baço. Além disso, o perfil imunológico dos animais foi feito através da quantificação de células T CD4+ e CD8+ esplênicas, seus perfis de marcadores de ativação e memória em linfócitos T (CD25, CD69 e CD62L), e da avaliação de anticorpos no plasma contra epítopos de P. lilacinus Os resultados demonstraram que ambos os isolados fúngicos apresentaram características morfológicas compatíveis com a espécie e foram capazes de infectar os animais do grupo dos imunocompetentes e provocar a doença, com manifestações clínicas, no modelo imunossuprimido. Um dos isolados, proveniente de lesão cutânea, foi considerado mais virulento, pelos critérios avaliados, que o isolado proveniente de lesão subcutânea na região da tíbia. A avaliação imunológica mostrou diferenças na cinética de expressão de moléculas de ativação pelos linfócitos CD4+ e CD8+ dos animais inoculados com os dois isolados, sendo mais recente para o isolado da região tibial, e tardia para o isolado de pele Foi possível também verificar que esse padrão se mantinha nos animais imunossuprimidos, mas com um grau de ativação aparentemente mais elevado do que nas células obtidas dos animais imunocompetentes. Com relação a avaliação da produção de anticorpos específicos contra o fungo, nossos dados sugerem que a imunossupressão não exerceu influência na resposta humoral, visto que ambos os grupos de animais, imunocompetentes e imunossuprimidos, inoculados com o fungo foram capazes de produzir anticorpos IgG específicos anti-P. lilacinus / Paecilomyces lilacinus is a filamentous, hyaline, asexual fungus and causal agent of hyalohyphomycosis. This fungus is considered an emergent and opportunist ic pathogen , to be able to infect child ren and adults i mmunosuppressed, as well as immunocompetent ones . This study investigated the response to infection, in vivo , of the immunocompetent and i mmunosuppressed C57BL/6 mice inoculated with P. lilacinus . Two strains fro m human lesions were evaluated regarding virulence using the following criteria: clinical signs, survival, splenic index, histopathological lesions and the number of viable fungal cells recovered from spleen. Besides, the immunological profile of the mice was done by quantification of CD4+ and CD8+ on splenocytes and their profiles of activation markers on T lymphocytes (CD25 and CD69), as well as memory markers (CD62L), and evaluation of antibodies in plasma against P. lilacinus epitopes . The results demon strated that both strains showed morphological features compatible with the species and were able to infect the immunocompetent group of animals and cause disease, with clinical manifestations, in the immuno supressed model. One of the strains from skin les ions was considered to be more virulent than the strain from subcutaneous lesion of the tibia area . The immunological evaluation showed differences in the activation molecules expression in CD4+ and CD8+ T cells obtained from animals infected with each fu ngal strain. Activation happened earl ier in cells from the tibia strain infected animals, when compared to those obtained from animals infected with the skin isolated strain. We were also able to observe the same pattern of expression in cells obtained f rom Immunosuppressed infected animals, although the degree of activation seem to be much higher than those observed in the immunocompetent mice. It was also possible to suggest that the immunosuppression did not interfere in the humoral immune response, s ince both groups of the animals, immunocompetent and immunosuppressed, inoculated with the fungus were able to produce specific IgG anti - P. lilacinus antibodies .