Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:11:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_EricaBenjamimda_M.pdf: 2288195 bytes, checksum: 5e5ae636ebf8e0749f7cc42bc309a508 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A bioprospecção de micro-organismos nativos capazes de produzir enzimas com diferentes propriedades catalíticas é essencial para o desenvolvimento do setor biotecnológico brasileiro. A lipase é uma enzima com vasta aplicação biotecnológica, utilizada na resolução de fármacos quirais, modificação de gorduras, produção de biocombustíveis, cosméticos, agroquímicos, oleoquímicos e realçadores de sabor. A tanase é outra enzima com grande potencial de aplicação industrial por ser capaz de catalisar a hidrólise de taninos hidrolisáveis e de ésteres de ácido gálico. Desse modo, o objetivo desse trabalho foi isolar novas linhagens de micro-organismos capazes de produzir as enzimas tanase e lipase extracelulares e caracterizar, bioquimicamente, as enzimas selecionadas. Foram isoladas 131 linhagens de fungos e 109 linhagens de leveduras da Região Amazônica e da região da Mata Atlântica. Tais linhagens fúngicas juntamente com outras linhagens da Coleção de Micro-organismos do Laboratório de Bioquímica FEA-UNICAMP (n=348) foram analisadas em meio sólido diferencial. Foram obtidas 26 linhagens positivas para lipase e 105 para tanase. As linhagens positivas foram testadas quanto à capacidade de produzir lipase e tanase por fermentação em estado sólido. A atividade enzimática da tanase foi quantificada por espectrofotometria e a da lipase por titulometria de neutralização. A lipase da linhagem de Colletotrichum sp. apresentou atividade enzimática específica igual a 25,97 U/mg; Km= 6,3 %; Vm= 19,5 U/mg; pH ótimo de atividade de 6,5 a 7,0 e temperatura ótima de atividade de 25 °C à 35 °C. A tanase da linhagem de Aspergillus niger apresentou atividade enzimática de 0,79 U/mL e a produzida pela linhagem de Paecilomyces sp. atingiu atividade específica de 2,14 U/mg, pH e temperatura ótima de atividade de 5,5 e 60°C, respectivamente / Abstract: The bioprospection of native microorganisms capable of producing enzymes with diverse catalytic properties is essential to the development of the Brazilian biotechnological sector. Lipase is an enzyme with wide biotechnological application, it is used on chiral drugs resolution, fat modification and on the production of biofuels, cosmetics and flavor enhancers. Tannase is another enzyme with large potential to be applied at industries, it is capable of catalyze the hydrolysis of hydrolysable tannins and galic acid esters. Therefore, this work goal is to isolate novel microorganisms strains capable of producing extracellular lipase and tannase, and to characterize biochemically the selected strains. 131 fungal strains and 109 yeast strains were isolated from Amazon and Atlantic Rainforest regions. These fungal strains summed with others strains from the Microorganisms Collection of the Biochemistry Laboratory/ FEA-UNICAMP (n=348) by differential solid media. It was found 26 lipase producing strains and 105 tannase producing strains. The positive strains were evaluated regarding their capacity to produce lipase and tannase by solid state fermentation. Tannase¿s enzymatic activity was measured by spectrophotometry and lipases¿s enzymatic activity by neutralization titration. Lipase from Colletotrichum sp. strain showed specific activity of 25.97 U/mg; Km= 6.3 %; Vmax= 19.5 U/mg; pH optimum between 6.5 to 7.0 and temperature optimum from 25 °C to 35 °C. Tannase from Aspergillus niger strain presented enzymatic activity of 0.79 U/mL and tannase from Paecilomyces sp. strain reached 2.14 U/mg, pH and temperature optimum of 5.5 and 60 °C, respectively / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Thesis (doctoral)--Swedish University of Agricultural Sciences, 2004. / Thesis documentation sheet inserted. Errata sheet inserted. Appendix reprints four papers and manuscripts co-authored with others. Includes bibliographical references. Also issued electronically via World Wide Web in PDF format; online version lacks appendix.

Submitted by RAYZA MORGANNA FARIAS CAVALCANTI null (rayzaaires@hotmail.com) on 2017-05-12T13:58:30Z No. of bitstreams: 1 Rayza Morganna Farias Cavalcanti - Dissertação.pdf: 2306411 bytes, checksum: 60982615938f2943b9d769d2c7cc2ae6 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-12T14:31:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cavalcanti_rmf_me_araiq.pdf: 2306411 bytes, checksum: 60982615938f2943b9d769d2c7cc2ae6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T14:31:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cavalcanti_rmf_me_araiq.pdf: 2306411 bytes, checksum: 60982615938f2943b9d769d2c7cc2ae6 (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Bioma Caatinga, caracterizado por apresentar condições extremas de habitat, é fonte de novas espécies, como microrganismos endofíticos, com potencial para síntese de compostos bioativos. Esses microrganismos são responsáveis por produzir uma série de metabólitos de interesse biotecnológico como, por exemplo, enzimas. Entretanto, a tanase, enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis, produzindo glicose e ácido gálico ou ácido elágico, ainda é pouco explorada quanto à produção por microrganismos endofíticos. Essas enzimas são de grande interesse biotecnológico para aplicações em indústrias alimentícias, químicas, de bebidas e farmacêuticas. Diante disto, este estudo visou à prospecção de tanases produzidas por fungos endofíticos associados às plantas ricas em taninos encontradas no Bioma Caatinga. A partir das cascas das plantas angico (Anadenanthera colubrina Vell.), aroeira (Myracrodruon urundeuva Allemao), baraúna (Schinopsis brasiliensis Engl.), cajueiro (Anacardium occidentale L.) e catingueira (Caesalpinia pyramidalis Tul), coletadas no estado da Paraíba, foi possível isolar 16 fungos endofíticos para seleção dos produtores de tanase. Dentre os isolados, as espécies Aspergillus niger ANG18 e Aspergillus fumigatus CAS21 apresentaram maior produção de tanase. No processo de otimização em Fermentação Submersa (FSbm) A. niger ANG18 apresentou maior nível enzimático quando cultivado em meio Khanna, com 2% de ácido tânico, por 24 horas, a 37ºC e 120 rpm, enquanto que A. fumigatus CAS21 os maiores níveis foram atingidos quando cultivado em meio mineral, adicionado de peptona, 2% de ácido tânico, por 24 horas, a 37ºC e 120 rpm. Em Fermentação em Estado Sólido (FES), A. niger ANG18, cultivado em folhas de eucalipto, umidificado com sais de Khanna (1:1) por 96 horas a 37ºC, apresentou maior produção de tanase quando comparado a A. fumigatus CAS21. Contudo, A fumigatus CAS21 apresentou a maior produção da enzima de interesse em FSbm, a qual foi purificada 4,9 vezes com taxa de recuperação de 10,2%, e caracterizada bioquimicamente. A tanase de A. fumigatus CAS21 tem massa molecular nativa de 60,34 kDa, com 39,1% de conteúdo de carboidratos. Apresentou temperatura ótima de atividade no intervalo de 30 a 40ºC e tempo de meia vida (t50) de 120 minutos e 90 minutos a 30ºC e 45ºC, respectivamente. O valor de pH ótimo aparente de atividade foi 5,0, mantendo-se ativa quando incubada no pH 5,0-6,0 por 24 horas. A atividade enzimática foi aumentada na presença ureia, e inibida na presença de íons de ferro e concentrações de ácido gálico acima de 5mM. Os parâmetros cinéticos foram analisados e a enzima mostrou maior afinidade pelo substrato propil galato (Km = 3,61 mM) quando comparado ao ácido tânico (Km = 6,38 mM) e ao metil galato (Km = 6,28 mM). Contudo, a maior eficiência catalítica foi obtida para o substrato ácido tânico. A aplicação do extrato bruto para tratamento de efluentes de curtume do couro de bode reduziu em 89% o teor de taninos presentes após 2 horas de incubação. Deste modo, o fungo endofítico A. fumigatus CAS21 isolado de planta da Caatinga mostrou-se como um interessante produtor de tanase com propriedades importantes para aplicação industrial. / Caatinga Biome is characterized by extreme habitat conditions and presents source of new species like endophytic microorganisms with potential bioactive compounds synthesis. These microorganisms are responsible to produce metabolites with biotechnological interest, such as enzymes. However, tannase, an enzyme that promote esters and side bonds of hydrolyzes hydrolyzable tannins, producing glucose and gallic acid or ellagic acid, is still little explored in terms of its production by endophytic microorganisms. These enzymes have great biotechnological importance for applications in food, chemical, beverage and pharmaceutical industries. In view of this, this study aims to prospect the production of tannases by endophytic fungi associated with tannins rich plants from the Caatinga Biome. Barks of angico, aroeira, barauna, cashew and catingueira plants were collected in the State of Paraíba and 16 endophytic fungi strains were isolated for the selection of tannase producers. The species Aspergillus niger ANG18 and Aspergillus fumigatus CAS21 showed higher tannase production among the isolated microorganisms. In the process of optimization in Submerged Fermentation (SbmF) A. niger ANG18 presented a higher enzymatic level when grown in Khanna medium, with 2% tannic acid, for 24 hours at 37ºC and 120 rpm, while A. fumigatus CAS21 presented better levels when grown in mineral medium, with addition of peptone, 2% of tannic acid, for 24 hours, at 37ºC and 120 rpm. Under solid state fermentation (SSF), A. niger ANG18 cultivated in eucalypt leaves, humidified with Khanna salts (1:1) for 96 hours at 37ºC, presented higher tannase level when compared to A. fumigatus CAS21. However, A. fumigatus CAS21 showed the highest production of tannase under FSbm, which was purified 4.9 fold with recovery of 10.2%, and biochemically characterized. The A. fumigatus CAS21 tannase has a native molecular mass of 60.34 kDa, with 39.1% carbohydrate content. It presents optimum temperature of activity in the range from 30 to 40ºC and half-fife (t50) of 120 minutes and 90 minutes at 30ºC and 45ºC, respectively. The optimum apparent pH of activity was 5.0 and its activity was maintained when incubated at pH 5.0-6.0 for 24 hours. The tannase activity was improved in the presence of urea, and inhibited in the presence of iron ions and gallic acid above 5 mM. The kinetic parameters were analyzed and the enzyme showed higher affinity for the propyl gallate substrate (Km = 3.61 mM) compared to tannic acid (Km = 6.38 mM) and methyl gallate (Km = 6.28 mM). On the other hand, the best catalytic efficiency was obtained for the substrate tannic acid. The application of the crude filtrate to treat tannery effluents from goat leather reduced the tannin content 89% after 2 hours of incubation. Thus, the endophytic fungi A. fumigatus CAS21 isolated from Caatinga plant was an interesting producer of tannase with important properties for industrial application.

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T15:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Battestin_Vania_D.pdf: 4281162 bytes, checksum: b173ac91bb78b5cc016fe8016611c298 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A tanino acil hidrolase conhecida como tanase (E.C: 3.1.1.20) é uma enzima produzida por fungos filamentosos, leveduras e bactérias. São caracterizadas por sua atividade em complexos polifenólicos, sendo capazes de hidrolisar ligações éster (entre o grupo anel aromático e o resíduo de glicose) e ligações depsídicas (ligação éster entre os anéis aromáticos) em substratos como ácido tânico, epicatequina galato, epigalocatequina galato entre outros. O objetivo deste trabalho foi selecionar linhagens de fungos produtores de tanase e estudar a produção, purificação, caracterização e aplicação desta enzima. A produção da tanase pelas linhagens de fungos selecionados foi testada em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais de café e uva com 0,5% e 1,5% de ácido tânico. A linhagem LAB 153G, identificada como Paecilomyces variotii, se destacou produzindo 0,275 U/mL de tanase em meio contendo resíduo de café. No estudo de otimização da produção de tanase pela linhagem P. variotii utilizando metodologia de superfície de resposta, foi obtido um aumento de 9 vezes na produção da enzima, utilizando-se as seguintes condições: faixa de temperatura de 29-34ºC, meio de cultivo contendo resíduo de café.farelo de trigo, 50% : 50% (p/p), ácido tânico 8-14% e tempo de incubação de 5 dias. A preparação de tanase bruta apresentou atividade ótima em pH 6,5 e 70ºC e estabilidade na faixa de pH 4,0-7,5 após 24 h de incubação a 30ºC. A enzima bruta mostrou-se estável após 30 min de tratamento a 70ºC em pH 6,0. A tanase purificada mostrou atividade ótima em pH 5,5 e 50ºC; e estabilidade máxima na faixa de pH 4,5 ¿ 6,5 após 12 h de incubação a 30ºC. A enzima purificada mostrou-se estável após 30 min de tratamento a 50ºC. A tanase extracelular foi também purificada cerca de 19,3 vezes, utilizando precipitação com sulfato de amônio seguida de purificação com cromatografia de troca iônica (DEAE-Sepharose). A tanase de P. variotii apresentou valor de Km igual a 0,61 µM e Vmáx igual a 0,55 U/mL, para o substrato ácido tânico. No estudo de aplicação da tanase em substratos naturais como epigalocatequina galato extraído de chá verde, foi verificado que os produtos obtidos da hidrólise apresentaram maior atividade antioxidante quando comparado com epigalocatequina galato / Abstract: Tannin acyl hydrolases, commonly referred to as tannases (E.C. 3.1.1.20), are inducible enzymes produced by fungi, yeast and bacteria. Tannases have been mostly characterized by their activity on polyphenolic complexes, are able to hydrolyse the ¿ester¿ bond (galloyl ester of an alcohol moiety) and the ¿depside¿ bond (galloyl ester of gallic acid) in substrates such as tannic acid, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, chlorogenic acid. The objective of this work was to select tannase producing fungi and to study the production and characterization of this enzyme. These fungi lineages were tested in vegetable residues as coffee and grape, adding 0.5 and 1.5% of tannic acid in the fermentation media. The best result was obtained using LA153G and coffee residues with activity 0.275 U/mL; the best tannase producing fungus was identified as Paecilomyces variotii. This strain was used for the optimization of enzyme production by experimental design method. After the optimization process, the tannase activity increased by 9 times. According to the optimization process, the best conditions for tannase production by the lineage of P. variotii were: temperature 29 to 34 ºC; % residue, coffee husk:wheat bran - 50:50 (p/p), tannic acid 8 to15 % and 5 days of fermentation. The biochemical properties of tannase were determined. Temperature 70 ºC and pH values from 6.5 were optimum for crude tannase activity. Tannase showed stability at pH 4.0-7.5 after 24 h the incubation at 30ºC. The tannase was stable in a temperature 70 ºC after 30 min in pH 6.0. The purified tannase showed optima activity in pH 5.5 and 50ºC; stability at pH 4.5-6.5 after 12 h the incubation at 30ºC. The tannase was stable in a temperature 50ºC after 30 min. An extracellular tannase was partially purified using ammonium sulphate precipitation followed by DEAE-Sepharose ion exchange chromatography. DEAE-Sepharose column chromatography led to an overall purification of 19.3 fold. The tanase showed values for Km of 0.61 µM and Vmax of 0.55 U.mL-1. The activity of crude tannase on the epigallocatechin gallate extract of green tea was investigated. This work establish a relationship between the antioxidants effects of epigallocatechin gallate compared to the obtained enzymatic reaction products (epigalocatechin and gallic acid) / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T09:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Queiros_LiviaDias_M.pdf: 1473794 bytes, checksum: 8841b5d38503f939739da3243001d1ed (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A soja atrai considerável atenção no atual cenário econômico mundial devido ao seu elevado potencial nutritivo e efeitos potencialmente benéficos à saúde humana, que são atribuídos principalmente às isoflavonas. Esta classe de fenóis heterocíclicos é conhecida por suas atividades biológicas, tais como as atividades estrogênica, antioxidante e antitumoral, sendo as formas agliconas mais ativas do que as glicosiladas. Contudo, estudos têm mostrado que a eficácia clínica das isoflavonas está relacionada com a capacidade de produção de equol, um metabólito da daidzeína que, segundo a literatura vigente, é produzido exclusivamente pela ação da microbiota intestinal. Assim, há evidências de que nem todos os indivíduos são capazes de metabolizar as isoflavonas a equol, sendo essa variabilidade atribuída às diferenças na composição da microflora intestinal, hábitos alimentares, fatores genéticos, dentre outros. Neste contexto, os produtos à base de soja são uma forma de incluir as isoflavonas na dieta, sendo que o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) é um substrato que tem se apresentado com potencial para produção de novos alimentos com apelo saudável. Desse modo, com o propósito de aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas e avaliar a viabilidade de um processo biotecnológico para produção de equol in vitro, neste projeto foi investigada a aplicação de culturas starters e bactérias lácticas probióticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extrato bruto de tanase obtido a partir de Paecilomyces variotti. Além disso, também foi avaliada a biotransformação dos compostos fenólicos e atividade antioxidante do produto obtido. O teor de fenóis totais foi avaliado pelo método de Folin-Ciocalteau, a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH e o perfil químico dos extratos, antes e depois dos processos de biotransformação, foi avaliado por CLAE-DAD com co-injeção de padrões de isoflavonas. Após o processo fermentativo e/ou tratamento enzimático do EHS, houve um significativo aumento no teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante, evidenciada por ambos métodos empregados (ORAC e DPPH), quando comparados com o controle do EHS sem reação. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico das amostras do EHS biotransformadas evidenciado por CLAE-DAD, resultando em um aumento na concentração das formas agliconas em relação às glicosiladas, bem como o aumento da concentração de equol após os processos de biotransformação propostos. Os resultados obtidos por CLAE-DAD confirmaram que o extrato de tanase de P. variotty foi capaz de biotransformar as formas glicosiladas (daidzina e genistina) das isoflavonas em suas respectivas formas agliconas (daidzeína e genisteína), indicando uma atividade diglicosídica do extrato semipurificado de tanase. Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de isoflavonoides glicosilados por tanase, bem como a formação de equol, é um relato inédito na literatura demonstrando que é possível desenvolver um processo in vitro para a obtenção deste composto bioativo, sem a presença de bactérias intestinais, utilizando apenas uma biotransformação enzimática / Abstract: The soy attracts considerable attention in the current global economic scenario due to their high nutritional potential and potentially beneficial effects to human health, which are mainly attributed to isoflavones. This class of heterocyclic phenols is known for its biological activities, such as estrogenic, antioxidant and antitumor activities, and the aglycone forms are more active than the glycosylated. However, studies have shown that the clinical efficacy of isoflavones is related to the capacity to produce equol, a metabolite of daidzein, which according to the current literature it is produced exclusively by the action of the gut microbiota. Thus, there is evidence that not all individuals are able to metabolize isoflavones to equol and this variability is attributed to differences in the composition of gut microflora, diet, genetic factors, among others. In this context, the soy-based products are a way to include the isoflavones in the diet, and the soymilk is a substrate that has shown the potential to produce new foodstuff with healthy appeal. Thus, in order to increase the content of bioactive isoflavones and assess the viability of a biotechnological process for in vitro production of equol, in this project was investigated the application of starters and probiotic lactic bacteria strains in the fermentation of soymilk, combined with the action of the crude extract of tannase obtained from Paecilomyces variotii. Furthermore, it was also evaluated the biotransformation of phenolic compounds and antioxidant activity of the obtained product. The total phenolic content was assessed by Folin-Ciocalteau method, the antioxidant activity by in vitro methods of ORAC and DPPH radical sequestration and the chemical profile of the extracts, before and after the processes of biotransformation, was evaluated by HPLC-DAD with co- injection of standards of isoflavones. After the fermentation process and/or enzymatic treatment of the soymilk, there was a significant increase of the total phenolic content and antioxidant capacity, as evidenced by both methods employed (ORAC and DPPH), compared with the standard soymilk. Furthermore, there was observed a change in the polyphenolic profile of biotransformed samples of soymilk, evidenced by HPLC-DAD, resulting in an increase in the concentration of the aglycones in relation to glucosides forms, as well as there was a significant increase of the concentration of equol after the biotransformation processes proposed. The results obtained by HPLC-DAD confirmed that the extract of tannase from P. variotii was able to biotransform the glucosides forms (daidzin and genistin) of isoflavones in their aglycone forms (daidzein and genistein), indicating a diglycosidase activity of the crude extract of tannase. From what is known, the hydrolysis of glucosides isoflavone by tannase, as well as the formation of equol, is an unpublished report in the literature demonstrating that it is possible to develop an in vitro method for obtaining this bioactive compound, without the presence of gut bacteria process using only an enzymatic biotransformation / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:15:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schons_PatriciaFernanda_D.pdf: 7426090 bytes, checksum: 313de43e28f0e8dfd168987a56f6a2c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Tanino acil hidrolase (TAH) conhecida como tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima que hidrolisa ésteres e taninos hidrolisáveis produzindo glicose e ácido gálico quando o meio reacional for polar. No entanto, a literatura indica sua capacidade de esterificar também ésteres de ácidos gálico em meio orgânico. Nosso grupo de pesquisa isolou um fungo, Paecilomyces variotii, produtor de tanase no ano de 2005 e desde então vem desenvolvendo estudos de produção, purificação, caracterização e aplicações desta enzima. Dando continuidade à linha de pesquisa, o objetivo deste trabalho foi estudar um processo de imobilização da tanase de Paecilomyces variotii empregando diferentes suportes e técnicas. Foram avaliados os parâmetros do processo de imobilização, a tanase livre e imobilizada foi caracterizada bioquimicamente ainda foi investigada a quimioseletividade da tanase imobilizada e livre para reações de síntese. A tanase foi imobilizada pelo método de adsorção em alumina, Amberlite, Accurel e celite; por ligação covalente em amberlite e Dowex ativados com polietilenoimina e glutaraldeído e em sílica, accurel e celite ativados com 3-aminopropiltrietoxisilano e glutaraldeído e por gelificação iônica em alginato de sódio, alginato de alga marrom, carragena, quitosana, pectina e goma gelana. A tanase imobilizada foi avaliada quanto a porcentagem de atividade enzimática e porcentagem de eficiência de imobilização. O processo de imobilização de tanase em alginato de sódio foi otimizado empregando a ferramenta de planejamento de experimentos. A tanase imobilizada em alginato na condição otimizada, foi avaliada quanto ao reuso e caracterizada bioquimicamente quanto ao pH e temperatura ótimos de atividade e de estabilidade e quanto a atividade frente a inibidores. Em adição ao processo de imobilização, foi avaliado o efeito do emprego de reticulantes: genipina, glutaraldeído, transglutaminase Activa® e transglutaminase de Streptomyces sp. CBMAI 837. As cápsulas obtidas foram avaliadas quanto à atividade enzimática, eficiência de imobilização e sua morfologia foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura. Dentre os suportes empregados para imobilização de tanase por adsorção, ligação covalente e gelificação iônica obteve-se maior porcentagem de atividade enzimática utilizando os suportes celite, sílica ativada com 3-aminopropiltrietoxisilano e glutaraldeído e alginato de sódio, respectivamente. A condição otimizada para a imobilização de tanase em alginato de sódio foi com 3,6% de alginato de sódio, cloreto de cálcio 0,1M, 3,6mg de tanase/mL de alginato e 6h de cura. Após o processo de otimização a tanase aumentou 35 vezes sua atividade enzimática. A tanase imobilizada em alginato de sódio nas condições otimizadas pode ser reutilizadas por até 5X mantendo 60% de sua atividade catalítica, as cápsulas apresentaram maior estabilidade quanto ao pH, temperatura e inibidores comparando com a tanase livre. Por fim, avaliouse a capacidade da tanase livre e imobilizada em sintetizar ésteres de ácido gálico. A tanase livre mostrou-se efetiva na síntese de galatos, especialmente, propilgalato com porcentagem de esterificação de 65%, já com a tanase imobilizada em alginato de sódio somente 8% de esterificação do propilgalato foi observado / Abstract: Tannin acyl hydrolase (TAH) known as tannase (EC 3.1.1.20) is an enzyme that hydrolyzes esters of hydrolysable tannins producing gallic acid and glucose as the reaction medium is polar. However, the literature indicates their ability to produce also gallic acid esters in organic media. Our research group has isolated a fungus, Paecilomyces variotii, tannase producer in 2005 and since then has been conducting studies of production, purification, characterization and applications of this enzyme. Continuing the research, the objective of this work was study a process to immobilize tannase from Paecilomyces variotii using different supports and techniques. Were evaluated the parameters of the immobilization process, free and immobilized tannase were characterized biochemically and yet been investigated quimioseletivity of tannase immobilized and free for synthesis reactions. Tannase was immobilized by adsorption onto alumina, Amberlite, Accurel and celite, by covalent binding in Amberlite and Dowex activated with polyethyleneimine and glutaraldehyde on silica, celite and Accurel activated with glutaraldehyde and 3-aminopropyltriethoxysilane and ionic gelation by sodium alginate, alginate from brown seaweed, carrageenan, chitosan, pectin and gellan gum. The immobilized tannase was evaluated as the percentage of enzyme activity and percentage of immobilization efficiency. The immobilization process of tannase in sodium alginate was optimized using the experimental design method. After the optimization process the tannase immobilized in alginate was evaluated for reuse and characterized biochemically for pH and temperature optima for activity and stability and the activity against inhibitors. In addition to the immobilization process, we evaluated the effect of the use of cross-linking: genipin, glutaraldehyde, Transglutaminase Activa ® and the transglutaminase from Streptomyces sp. CBMAI 837. The capsules obtained were evaluated for percentage of enzymatic activity, percentage of immobilization efficiency and their morphology was studied by scanning electron microscopy. Among the carriers used for immobilization of tannase by adsorption, covalent and ionic gelation has been a higher percentage of enzyme activity using the supports celite, silica activated with glutaraldehyde and 3-aminopropyltriethoxysilane and sodium alginate, respectively. The optimal conditions for immobilization of tannase in sodium alginate were 3.6% sodium alginate, calcium chloride 0.1 M, 3.6 mg of tannase / mL alginate and 6h of cure. After the optimization process, the tannase activity increased by 35 times. The tannase immobilized on sodium alginate in the optimized conditions can be reused up to 5X keeping 60% of its catalytic activity, the capsules showed greater stability for pH, temperature and inhibitors compared with free tannase. Finally, we evaluated the ability of free and immobilized tannase in synthesizing esters of gallic acid. The free tannase proved to be effective in the synthesis of gallates, especially propyl gallate with a percentage of esterification of 65%, with the immobilized tannase in sodium alginate was observed only 8% of propyl gallate esterification / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T21:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_LiviaRosas_M.pdf: 6389418 bytes, checksum: 474ea71f0f4b85a4fb59fa346c31f972 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), conhecida como tanase, é uma enzima com habilidade de atuar em ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis e também foi descrita como capaz de hidrolisar polifenóis como ácido clorogênico, epicatequina galato e epigalocatequina galato. Os polifenóis, ou compostos fenólicos, estão distribuídos em uma ampla variedade de fontes vegetais e estão relacionados à prevenção de câncer e doenças cardiovasculares. No entanto, os polifenóis ocorrem frequentemente como glicosídeos ou outros conjugados, o que pode comprometer a biodisponibilidade e os efeitos benéficos destes compostos à saúde, sendo necessária a biotransformação destes conjugados no trato gastrointestinal. Como alternativa tecnológica, a biotransformação enzimática dos polifenóis ou de suas fontes vegetais também pode liberar estes compostos de seus conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional de tais antioxidantes. O objetivo do presente trabalho foi estudar a especificidade do extrato semipurificado de tanase de Paecilomyces variotii frente a diferentes padrões comerciais de polifenóis e avaliar sua atuação na matriz alimentar suco de laranja quanto a modificações em características físico-químicas, perfil fenólico e atividade antioxidante. O estudo da especificidade do extrato semipurificado de tanase foi realizado por CLAE-DAD e ESI-MS e o suco de laranja foi avaliado quanto aos parâmetros acidez total titulável, sólidos totais, pH, teor de vitamina C e fenólicos totais. As alterações no perfil fenólico do suco de laranja foram avaliadas por CLAE-DAD e a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH. Os resultados obtidos por CLAE-DAD e ESI-MS mostraram que não houve hidrólise dos padrões ácido clorogênico, ácido ferúlico, ácido elágico, resveratrol, quercetina e hesperetina pelo extrato semipurificado de tanase nas condições empregadas para o teste. No entanto, foi observado a hidrólise da ligação entre a aglicona e o dissacarídeo dos flavonoides rutina, naringina e hesperidina, gerando respectivamente os produtos quercetina, naringenina e hesperetina, e indicando uma atividade diglicosídica do extrato semipurificado de tanase. Para o suco de laranja, os resultados de acidez titulável, pH, sólidos solúveis e vitamina C não apresentaram diferença significativa após o tratamento enzimático do suco com extrato semipurificado de tanase, no entanto, houve um aumento de 16,8% no teor de fenólicos totais. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico do suco de laranja obtido por CLAE-DAD, resultando em um aumento na atividade antioxidante do suco biotransformado em aproximadamente 50% pelo método ORAC e 70% pelo método DPPH. Os padrões comerciais hesperidina e naringina biotransformados pelo extrato semipurificado de tanase também apresentaram maior atividade antioxidante do que o controle sem reação. Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de flavonoides glicosilados por tanase é um relato inédito na literatura e, portanto este trabalho fornece novos substratos para o extrato semipurificado de tanase de P. variotii e confirma que a biotransformação é uma boa estratégia para melhorar a atividade antioxidante in vitro de polifenóis e de suco de laranja / Abstract: Tannin acyl hydrolases (EC 3.1.1.20), commonly named as tannases, are enzymes able to act on ester and depside bonds of hydrolysable tannins and have also been described to hydrolyse polyphenols such as chlorogenic acid, epicatechin gallate and epigallocatechin gallate. Polyphenols, or phenolic compounds, are widely distributed in the plant kingdom and are related to the prevention of cancer and cardiovascular diseases. However, polyphenols are often found as glycosides or other conjugates, which may affect their bioavailability and health benefits, being necessary the biotransformation of these compounds in the gastrointestinal tract. As a technological alternative, the enzymatic biotransformation of the polyphenols or their plant sources can also release these compounds from their conjugates and therefore improve the functional activity of these antioxidants. The objectives of the present study were to investigate the specificity of the crude extract of tannase from Paecilomyces variotii in reaction with differents comercial standards of phenolic compounds and to evaluate the effects on the physico-chemical properties, phenolic profile and antioxidant activity of the orange juice reacted with the crude extract of tannase. The specificity study of the crude extract of tannase was performed by HPLC-DAD and ESI-MS. The orange juice was subject to analysis of titratable acidity, pH, and total solids, vitamin C and total phenolics contents. Furthermore, changes in the phenolic profile of orange juice were analyzed by HPLC-DAD and the antioxidant capacity of the samples was tested by in vitro DPPH and ORAC assays. The results obtained by HPLC-DAD and ESI-MS did not show hydrolysis of the standards chlorogenic acid, ferulic acid, ellagic acid, resveratrol, quercetin and hesperetin at test conditions. However, the crude extract of tannase was able to hydrolyse the glucosidic bond between disaccharide and aglycone of the flavonoids rutin, hesperidin and naringin, yielding as products quercetin, hesperetin and naringenin, respectively, and indicating a diglycosidase activity of the crude extract of tannase. For orange juice, the results of acidity, pH, soluble solids and vitamin C showed no significant difference after enzymatic treatment with the crude extract of tannase, but there was an increase of 16.8% in total phenolic content. In addition, there was an extensive modification in the polyphenolic profile from the biotransformed orange juice obtained by HPLC-DAD, which resulted about 50% and 70% increase in orange juice antioxidant activity by ORAC and DPPH methods, respectively. The standards hesperidin and naringin biotransformed by crude extract of tannase also showed higher antioxidant activities than the control. To the best of our known, this is the first report about tannase which could hydrolyze flavonoid glycosides and, therefore this work provides new substrates for crude extract of tannase from P. variotii and confirms that biotransformation is a good strategy to improve in vitro antioxidant activity of polyphenols and orange juice / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T10:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schons_PatriciaFernanda.pdf: 1271406 bytes, checksum: 668e62b416afd72ff47587e7425cecd0 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho visou avaliar o efeito do fungo Paecilomyces variotti e das enzimas fitase e tanase sobre fatores antinutricionais, taninos e fitatos presentes no sorgo tipo vassoura. A enzima tanase produzida pelo fungo Paecilomyces variotti apresentou atividade enzimática de 626U/g, além desta enzima, estavam presentes no extrato enzimático, com menor atividade protease, carboximetilcelulase, polimetilgalacturonase e fitase. A fitase empregada foi comercial (NATUPHOS ¿ BASF) e apresentou atividade de 660U/g. O sorgo utilizado neste estudo possui 13,6% de proteína, 4,2% de lipídeos, 1,7% de cinzas e 80,5% de carboidratos, elevada concentração de compostos fenólicos, especialmente taninos condensados e 226mg/100g de sorgo de fósforo inorgânico. O sorgo foi preparado e tratado com Paecilomyces variotti, tanase e fitase em diferentes combinações. As respostas diminuição de tanino e aumento de fósforo foram avaliados, os melhores resultados foram obtidos quando a farinha de sorgo foi tratada com tanase e fitase durante 5 dias. Por meio de planejamento experimental foi feito estudo do tratamento de sorgo com as enzimas fitase e tanase, o qual indicou a relação entre sorgo:água, como sendo a variável mais significativa para o processo. O processamento (maceração e fervura) e adição das enzimas foram efetivos na redução de taninos e aumento de fósforo, quando comparamos estes resultados com o sorgo cru, porém, as diferentes concentrações das enzimas não tiveram efeito sobre os parâmetros avaliados. Baseado nos resultados expostos, o sorgo para a elaboração das dietas foi tratado com a concentração inferior de enzimas estudada (100U/Kg). O estudo in vivo mostrou que a dieta elaborada com sorgo tratado enzimaticamente foi efetivo na melhoria da digestibilidade aparente de fósforo, na diminuição da excreção de fósforo, resultaram em melhores índice bioquímico para glicose e colesterol, apresentaram uma menor atividade de enzimas hepáticas aspartato aminotrasnferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT), comparando com sorgo cru. No entanto, não teve efeito significativo na melhoria do ganho de peso, da digestibilidade aparente de proteína, na concentração de fósforo, ferro e cálcio plasmático, bem como na concentração de mineral contido no fêmur / Abstract: This work aimed assess the fungus Paecilomyces variotti and enzymes phytase, tannase effects on the antinutritional factors, tannins and phytates present in sorghum. The tannase produced by the fungus Paecilomyces variotti has enzymatic activity of 626U/g, in addition this enzyme were present in the enzymatic extract protease, in less activity protease, carboxymetilcellulase, polymetilgalacturonase and phytase. The phytase used is commercially (NATUPHOS ¿ BASF) and has activity of 660U/g. The sorghum utilized in this study has 13.6% protein, 4.2% of lipids, 1.7% ash and 80.5% carbohydrate, high concentration of phenolic, mainly condensed tannins and inorganic phosphorus 226mg/100g sorghum. The sorghum was prepared and treated by using Paecilomyces variotti, tannase and phytase in different combinations. The decrease in the tannins and increase in the phosphorus were evaluated, the best results were obtained when sorghum flour was treated with tannase and phytase for 5 days. Through experimental design were made a study about sorghum treated by the enzymes tannase and phytase, which indicated the relationship between sorghum:water, as the most significant variable in the process. The processing (soaking and boiling) and addition of enzymes were effective in reducing tannin and increase phosphorus, when comparing these results with the raw sorghum, however, different concentrations of the enzymes had no effect on the parameters evaluated. Based on the results above, the sorghum for the preparation of the diets were treated with lower concentration of enzymes studied (100U/Kg). The in vivo assay showed that the diet prepared using sorghum treated enzimaticaly was effective in improving digestibility of phosphorus, reducing the phosphorus excretion, resulting in better biochemical index for glucose and cholesterol, showed a lower activity of liver enzymes aspartate aminotransferase (AST) and alanin aminotransferase (ALT), compared with raw sorghum. However, it had no significant effects in improve weight, the apparent digestibility of protein, and the concentration of phosphorus, iron and calcium in the plasma and mineral content in the femur / Universidade Estadual de Campi / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

ABSTRACT PRODUCTION OF TANNASE BY ASPERGILLUS NIGER &Ouml / zt&uuml / rk, Alev Deniz M.S., Department of Chemical Engineering Supervisor: Prof. Dr. Ufuk Bakir Co-Supervisor: Prof. Dr. B. Z&uuml / mr&uuml / t &Ouml / gel August 2006, 90 pages In this study, a filamentous fungus, Aspergillus niger was evaluated in terms of extracellular tannase production. The effect of tannic acid, glucose and nitrogen sources on tannase and biomass productions was investigated and their concentrations were optimized. The highest enzyme activity was recorded as 316 U/ml in the optimized medium containing 8% Tannic acid, 1% Glucose, 0.4% (NH4)2HPO4, 0.1% K2HPO4, 0.1% MgSO4.7H2O, 0.01% ZnSO4.7H2O, 0.0005% NaCl in a shake-flask bioreactor at 35oC and 175 rpm. The bioreaction profile including tannic acid, gallic acid, pyrogallol, glucose concentrations, pH, biomass and extracellular tannase production were determined under the optimized conditions. The maximum extracellular tannase activity (316 U/ml) was observed on the 4th day of cultivation. However, biomass continued to increase up to the 9th day of fermentation. Increase in biomass concentration during the first two days and after the 7th day was high. The microorganism used tannic acid and glucose during the first two days by considering the sharp decrease in tannic acid and glucose concentrations. The increase in biomass concentration after the 7th day was directly proportional to the decrease in pyrogallol concentration in this period of time. The pH of the cultivation medium decreased from 5.5 to 2.3 owing to the assimilation of glucose and the production of gallic acid. Keywords: Tannase, Aspergillus niger, Enzyme production, Cultivation profile, Tannic acid.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-05-19T12:41:06Z No. of bitstreams: 1 Tatiana Pereira Shiu Lin Liu.pdf: 880008 bytes, checksum: 5eed3ce34aa09053744a3f45eca49b25 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T12:41:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tatiana Pereira Shiu Lin Liu.pdf: 880008 bytes, checksum: 5eed3ce34aa09053744a3f45eca49b25 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Tannin acylhydrolase (TAH) known as tannase (E.C:3.1.1.20) is an enzyme which hydrolizes esters and lateral bonds of hydrolizable tannins. The tannic acid is a typical hydrolizable tannin, which can be hydrolized by tannase along with glucose and gallic acid. Tannase can be obtained from vegetables, animal and microbial sources. From those, the last is the most important source to obtain the enzyme. Green tea has several substances, among which catechins are a major source of antioxidant, which help in maintaining the organism.The activity and purification of tannase produced by Aspergillus melleus URM 5827 was evaluated by semi solid fermentation using seeds of mangosteen (Garcinia humilis (Vahl) C. D. Adam) as substract. Forty two cultures fungical cultures of Aspergillus were used for qualitative selection purposes in order to verify potential for tannase production. After selecting cultures, it was performed a semi solid fermentation using seeds of mangosteen as substrate. A factorial planning (2³) was used to verify the influence of production variables such as: quantity of substrate; initial moisture and amount of tannic acid over tannase activity. The purification was evaluated by ionic change chromatography at DEAE-Sephadex. Maximum activity was produced by Aspergillus melleus URM 5827 with 452.55 units per gram of dry-based substract (U/gss) using 5.0 grams of substrate, with initial moisture of 60% and 2% of tannic acid through 48 hours fermentation. The purified enzyme has a molecular weight of 69.52 kDa on Superdex G-75, while on SDS-PAGE electrophoresis showed 66.5 kDa. As for the characterization, the optimum pH and temperature was 5.5 and 40ºC, respectively, achieving thermostability at 30ºC. Coughing increases the antioxidant activity of green tea significantly. The results obtained in this study show the promising potential of tannase produced by Aspergillus melleus URM 5827 and its use in improving the antioxidant potential of green tea. / Tanino acil hidrolase (TAH) conhecida como tanase (E.C:3.1.1.20) é uma enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis. O ácido tânico é um típico tanino hidrolisável, que pode ser hidrolisado por tanase em glicose e ácido gálico. A tanase pode ser obtida a partir de fontes vegetais, animais e microbianas, sendo o meio microbiológico a fonte mais importante de obtenção desta enzima. O chá verde apresenta várias substâncias, dentre elas, as catequinas que são uma importante fonte de antioxidante, que ajudam na manutenção do organismo.A atividade e a purificação de tanase produzida por Aspergillus melleus URM 5827 foi avaliada por fermentação em estado sólido utilizando como substrato sementes de achachairú (Garcinia humilis (Vahl) C. D. Adam). Foram utilizadas 42 culturas de fungos do gênero Aspergillus para seleção qualitativa das culturas com potencial para produção da tanase. Com a cultura selecionada foi realizada uma fermentação em estado sólido utilizando sementes de achachairú como substrato. Um planejamento fatorial (23) foi utilizado para analisar a influência das variáveis de produção: quantidade de substrato, umidade inicial e quantidade de ácido tânico sobre a atividade da tanase. A purificação foi avaliada por cromatografia de troca iônica em DEAE- Sephadex. A máxima atividade foi produzida por Aspergillus melleus URM 5827 com 452,55 unidades por grama de substrato na base seca (U/gss) utilizando 5,0 g de substrato, com umidade inicial de 60% e 2,0% de ácido tânico em 48 horas de fermentação. A enzima purificada apresentou peso molecular de 69,52 kDa em Superdex G-75, enquanto que em eletroforese SDS-PAGE apresentou 66,5 kDa. Quanto a caracterização, apresentou pH e temperatura ótima de 5,5 e 40ºC respectivamente, obtendo termoestabilidade a 30ºC. A atividade enzimática na presença de íons, surfactantes e inibidores de protease, foi inibida na presença dos íons ZnCl2, ZnSO4 e dos surfactantes triton X-100, SDS, reduzida com os íons CaCl2, KCl, NaCl, MgSO4, CuSO4, dos surfactantes Tween 20, Tween 80 e dos inibidores de protease EDTA e β-mercaptoetanol. A tanase aumentou a atividade antioxidante do chá verde significativamente. Os resultados obtidos no presente estudo, mostram o potencial promissor da tanase produzida por Aspergillus melleus URM 5827 e na sua utilização no aumento do potencial antioxidante do chá verde.