Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-05-19T12:14:27Z No. of bitstreams: 1 Amanda Emmanuelle Sales.pdf: 4982712 bytes, checksum: 90011cbdafe7a0363213b2fff5735b44 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T12:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Emmanuelle Sales.pdf: 4982712 bytes, checksum: 90011cbdafe7a0363213b2fff5735b44 (MD5) Previous issue date: 2015-12-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fibrinolytic proteases are enzymes that degrade fibrin, the main component of blood clots. The accumulation of this protein leads to thrombosis responsible for cardiovascular disease including myocardial infarction. A promising alternative to thrombolytic therapy has been the production of these enzymes by microorganisms which promotes low cost, high efficiency and capacity for large scale production. This study aimed to select species of filamentous fungi isolated from Caatinga soil samples - Pernambuco - Brazil and assess their potential for production of proteases with fibrinolytic activity. Among the 36 isolates studied, 58% showed fibrinolytic activity above 100 U/mL. The microorganism with the higher activity in terms of enzyme production was Mucor subtilissimus UCP 1262 with 415 U/mL. Further optimization of the fermentation process resulted in the production of 1075 U/mL of enzymatic activity. The fibrinolytic enzyme had a capacity of enzymatic degradation of the blood clot of 16.7 % in vitro. Extraction of fibrinolytic protease produced at submerged fermentation was carried out using a PEG/ammonium sulphate aqueous two-phase system (ATPS). PEG 8000 15% and 25% ammonium sulphate were selected as the most appropriate components for extraction with Fibrinolytic Activity in salt phase: 345 U/mL; K: 0.65; Y: 253.1 % and FP: 8.8. The fibrinolytic enzyme from Mucor subitilissimus UCP 1262 was pre-purified using extractive fermentation in PEG and ammonium sulphate ATPS, in which the fungal strain was able to grown even in high salt concentration, produced and extracted simultaneously to the PEG phase. A novel protease with fibrinolytic activity was purified also by chromatographic methods using a two-step purification protocol. Compared to the crude enzyme extract, the specific activity of the enzyme increased 5.30 fold with a recovery of 36.31%. The initial crude extract with the enzyme was pre-purified using acetone precipitation and adsorbed by ion exchange chromatography on DEAE-sephadex G50. The two-dimensional electrophoresis system (2DE) coupled with SDS-PAGE showed a single protein band of approximately 15.3 kDa and isoelectric focusing point of 3.9, exhibiting a nature as an acidic enzyme. Additionally, the activity was slightly inhibited by EDTA, but significantly inhibited by PMSF and also had a higher affinity for the N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (SAApNA) and azocasein substrates, suggesting to be a chymotrypsin-like protease. Protein unfolding induced by pH and temperature were applied to study the protein conformational changes and showed from the thermal denaturation curve, change in ellipticity at 222 nm, indicated Tm (Melting temperature) of the protein to be 58.14°C. The far UV circular dichroism (CD) of the fibrinolytic protease showed the secondary structure with most content percentage of α-helix. These results demonstrate an economical, viable enzyme purification protocol. And studying the purified fibrinolytic enzyme have established basis for elucidating mechanisms responsible for the changes in conformation of the new fibrinolytic enzyme under varying conditions of temperature and pH. This novel fibrinolytic enzyme may represent a new source of therapeutic agents to treat thrombosis diseases. / Proteases fibrinolíticas são enzimas que degradam a fibrina, o principal componente dos coágulos sanguíneos. O acúmulo da fibrina nos vasos sanguíneos leva a trombose, fenômeno responsável por doenças cardiovasculares. Uma alternativa promissora para a terapia trombolítica tem sido a produção dessas enzimas por micro-organismos que promovem baixo custo, alta eficiência e capacidade de produção em larga escala. Produzir proteases fibrinolíticas por linhagens de fungos filamentosos por fermentação submersa e desenvolver o processo de purificação utilizando Sistemas de Duas Fases Aquosas (SDFA) e cromatografia líquida, além de caracterizar bioquímico e estruturalmente a enzima. Dentre as 36 espécies estudadas, 58% apresentaram atividade fibrinolítica acima de 100 U/mL A espécie com maior atividade foi Mucor subtilissimus UCP 1262 com 415 U/mL. Foram realizados processos fermentativos que resultaram na produção de 1075 U/mL de atividade fibrinolítica, com capacidade de degradação do coágulo sanguíneo de 16,7% in vitro. A extração da protease fibrinolítica produzida por fermentação submersa foi realizada utilizando o sistema de duas fases aquosas (SDFA) com Polietileno glicol (PEG) e sulfato de amônio. O PEG 8000 (g/mol) a 15% e sulfato de amônio a 25% foi selecionado como a condição mais eficiente para a extração da enzima na fase do sal, apresentando 345 U/mL de atividade, coeficiente de partição K=0,65; Recuperação Y=253,1% e Fator de purificação FP=8,8. A protease fibrinolítica produzida por Mucor subitilissimus UCP 1262 foi também pré-purificada utilizando fermentação extrativa com SDFA (PEG e sulfato de amônio), onde a espécie fúngica foi capaz de crescer mesmo em altas concentrações de sal, produzir e extrair simultaneamente para a fase do PEG do sistema. A protease fibrinolítica foi purificada também através de métodos cromatográficos utilizando um protocolo de purificação com dois passos. O extrato bruto inicial com a enzima foi pré-clarificado utilizando precipitação com acetona e adsorção em cromatografia de troca-iônica em DEAE-sephadex G50, o qual foi capaz de aumentar a pureza em 5,30 vezes com a recuperação de 36, 31%. O sistema de eletroforese bidimensional 2DE acoplado ao SDS-PAGE mostrou uma banda única de aproximadamente 15,3 kDa e a focalização isoelétrica apresentou o ponto isoelétrico no pH 3,9, exibindo uma natureza de enzima ácida. Adicionalmente a enzima foi significativamente inibida por PMSF e alta afinidade catalítica para o substrato sintético amidolítico N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (SAApNA) e azocaseína. Sugerindo ser uma serino-protease semelhante à quimotripsina. Desdobramento proteico induzido por pH e temperatura foram aplicados para estudar as mudanças conformacionais da enzima e mostraram através da curva de desnaturação térmica, mudança da elipticidade a 222 nm, indicando um Tm (Temperatura de desnaturação) da proteína de 58,14°C. O dicroísmo circular no UV distante (far UV CD) da protease fibrinolítica mostrou a estrutura secundária da proteína com maior teor de α-hélix. Estes resultados demonstram um protocolo de purificação de enzimas eficiente. E o estudo da enzima purificada estabeleceu bases para elucidar mecanismos responsáveis pelas mudanças de conformação de uma nova enzima fibrinolítica sob a variação de condições variadas de temperatura e pH. Esta enzima fibrinolítica pode representar uma nova fonte de agente terapêutico no tratamento de doenças trombolíticas.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-05-19T12:41:06Z No. of bitstreams: 1 Tatiana Pereira Shiu Lin Liu.pdf: 880008 bytes, checksum: 5eed3ce34aa09053744a3f45eca49b25 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T12:41:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tatiana Pereira Shiu Lin Liu.pdf: 880008 bytes, checksum: 5eed3ce34aa09053744a3f45eca49b25 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Tannin acylhydrolase (TAH) known as tannase (E.C:3.1.1.20) is an enzyme which hydrolizes esters and lateral bonds of hydrolizable tannins. The tannic acid is a typical hydrolizable tannin, which can be hydrolized by tannase along with glucose and gallic acid. Tannase can be obtained from vegetables, animal and microbial sources. From those, the last is the most important source to obtain the enzyme. Green tea has several substances, among which catechins are a major source of antioxidant, which help in maintaining the organism.The activity and purification of tannase produced by Aspergillus melleus URM 5827 was evaluated by semi solid fermentation using seeds of mangosteen (Garcinia humilis (Vahl) C. D. Adam) as substract. Forty two cultures fungical cultures of Aspergillus were used for qualitative selection purposes in order to verify potential for tannase production. After selecting cultures, it was performed a semi solid fermentation using seeds of mangosteen as substrate. A factorial planning (2³) was used to verify the influence of production variables such as: quantity of substrate; initial moisture and amount of tannic acid over tannase activity. The purification was evaluated by ionic change chromatography at DEAE-Sephadex. Maximum activity was produced by Aspergillus melleus URM 5827 with 452.55 units per gram of dry-based substract (U/gss) using 5.0 grams of substrate, with initial moisture of 60% and 2% of tannic acid through 48 hours fermentation. The purified enzyme has a molecular weight of 69.52 kDa on Superdex G-75, while on SDS-PAGE electrophoresis showed 66.5 kDa. As for the characterization, the optimum pH and temperature was 5.5 and 40ºC, respectively, achieving thermostability at 30ºC. Coughing increases the antioxidant activity of green tea significantly. The results obtained in this study show the promising potential of tannase produced by Aspergillus melleus URM 5827 and its use in improving the antioxidant potential of green tea. / Tanino acil hidrolase (TAH) conhecida como tanase (E.C:3.1.1.20) é uma enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis. O ácido tânico é um típico tanino hidrolisável, que pode ser hidrolisado por tanase em glicose e ácido gálico. A tanase pode ser obtida a partir de fontes vegetais, animais e microbianas, sendo o meio microbiológico a fonte mais importante de obtenção desta enzima. O chá verde apresenta várias substâncias, dentre elas, as catequinas que são uma importante fonte de antioxidante, que ajudam na manutenção do organismo.A atividade e a purificação de tanase produzida por Aspergillus melleus URM 5827 foi avaliada por fermentação em estado sólido utilizando como substrato sementes de achachairú (Garcinia humilis (Vahl) C. D. Adam). Foram utilizadas 42 culturas de fungos do gênero Aspergillus para seleção qualitativa das culturas com potencial para produção da tanase. Com a cultura selecionada foi realizada uma fermentação em estado sólido utilizando sementes de achachairú como substrato. Um planejamento fatorial (23) foi utilizado para analisar a influência das variáveis de produção: quantidade de substrato, umidade inicial e quantidade de ácido tânico sobre a atividade da tanase. A purificação foi avaliada por cromatografia de troca iônica em DEAE- Sephadex. A máxima atividade foi produzida por Aspergillus melleus URM 5827 com 452,55 unidades por grama de substrato na base seca (U/gss) utilizando 5,0 g de substrato, com umidade inicial de 60% e 2,0% de ácido tânico em 48 horas de fermentação. A enzima purificada apresentou peso molecular de 69,52 kDa em Superdex G-75, enquanto que em eletroforese SDS-PAGE apresentou 66,5 kDa. Quanto a caracterização, apresentou pH e temperatura ótima de 5,5 e 40ºC respectivamente, obtendo termoestabilidade a 30ºC. A atividade enzimática na presença de íons, surfactantes e inibidores de protease, foi inibida na presença dos íons ZnCl2, ZnSO4 e dos surfactantes triton X-100, SDS, reduzida com os íons CaCl2, KCl, NaCl, MgSO4, CuSO4, dos surfactantes Tween 20, Tween 80 e dos inibidores de protease EDTA e β-mercaptoetanol. A tanase aumentou a atividade antioxidante do chá verde significativamente. Os resultados obtidos no presente estudo, mostram o potencial promissor da tanase produzida por Aspergillus melleus URM 5827 e na sua utilização no aumento do potencial antioxidante do chá verde.