Durante la última década se ha puesto de manifiesto la importancia de desarrollar nuevos métodos rápidos de análisis con el fin de controlar el proceso de elaboración de los productos cárnicos de una forma segura y eficiente. Debido a este interés, parte de esta Tesis Doctoral se ha centrado en el desarrollo y la aplicación de nuevos métodos no destructivos y rápidos para controlar el proceso de producción, tanto del jamón cocido como del tradicional jamón curado. La participación de compuestos como la creatina y creatinina en el conjunto de las reacciones químicas y enzimáticas que tienen lugar en el músculo postmortem los convierten en buenos marcadores para conocer el tiempo de curado y/o cocción de productos cárnicos. En la presente Tesis Doctoral se ha desarrollado un nuevo método de análisis por HPLC sencillo y fiable basado en la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) para la determinación simultánea de creatina y creatinina, así como de los dipéptidos carnosina, anserina y balenina, siendo una alternativa muy interesante a los métodos ya existentes para el análisis de este tipo de compuestos. Dado que la conversión de creatina en creatinina se ve influenciada por la temperatura, el tiempo, y por los cambios de pH, se ha empleado la ratio creatinina/creatina como índice para determinar el alcance del tratamiento térmico aplicado durante el procesado de jamón cocido, y también como valor para estimar el tiempo mínimo de curado del jamón. Además de los cambios en compuestos relacionados con el metabolismo energético del músculo, durante el proceso de curado de jamón tienen lugar una serie de reacciones bioquímicas entre las que destaca la intensa proteólisis de las proteínas musculares. A pesar de tener la evidencia de la presencia de oligopéptidos al final del proceso de curado, se sabe muy poco acerca de la secuencia específica de los mismos. / Mora Soler, L. (2010). Determinación de compuestos bioquímicos para el control de calidad en la elaboración de jamón cocido y jamón curado [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7345 / Palancia

Citrus tristeza virus (CTV) is a viral species of the Closterovirus genus, having a ¿20 kb single-stranded and positive sense genomic RNA (gRNA) organized into 12 open reading frames (ORFs) potentially coding 17 protein products, some of which of unknown function. CTV proteins p25 and p27 belong to a gene block involved in virion assembly. It has been demonstrated that p25, along with p20 and p23, are RNA silencing suppressors in some species of Nicotiana, being the latter a pathogenesis determinant. CTV host range is very restricted and in nature viral infections are limited to the phloem cells of some citrus species. Consequently, working with this virus-host pathosystem requires an appropriate experimental host and an efficient CTV genetic system. In our laboratory we have developed a new CTV genetic system based on the agroinfection of Nicotiana benthamiana plants, a non-natural host, with infectious clones of the T36 isolate. That infection induces characteristic symptoms, some of which correlate with those caused by the virus in citrus plants. CTV-N. benthamiana interactions are very variable and genotype-dependent, so only some isolates can replicate in this species and T36 is unique causing systemic infections. In this work, we studied the function of CTV p20 and p25 proteins from three different isolates differing in its pathogenic characteristics. Transient expression of p20 and p25 fused to fluorescent proteins showed an identical subcellular localization for both N. benthamiana and citrus. The p20 protein of T36, T318A and T385 isolates localized in cytoplasm and nucleus forming amorphous aggregates associated with perinuclear regions, together with nuclear punctuate inclusions. On the other hand, subcellular localization of p25 differed depending on the CTV isolate. While p25 of T36 and T385 localized in the nucleus, that of T318A did it in cytoplasm. A detailed analysis of the protein regions involved in this subcellular localization unveiled a leucine-rich nuclear export signal (NES) in the N-terminus (Nt) of the protein. The pathogenic ability of CTV p20 and p25 in N. benthamiana was tested through a PVX heterologous viral infection, showing that p25 was not a pathogenicity determinant in this species, albeit p20 it was. Besides, the interactome of p25-T36 was more complex and diverse than that of p25-T318A, involving a greater number of metabolic processes, redox activities, homeostasis and cellular transport, biosynthesis and protein degradation, plastid and nucleic acid protein binding, biotic and oxidative stress, jasmonic-mediated defense, methylation, ROS signalling and HSP proteins. On the other hand, most p25-T318A potential interactors were related to transport/localization and stress response, like apoptosis, pathogenesis-related and HSP proteins, Ca+2-binding proteins and redoxins. Moreover, the experimental evolution of CTV in N. bethamiana was achieved through serial passages. The evolution process showed adaptative traits as the increase of graft survival, infectivity rates and viral titers, and a decreased time for the onset of symptom development in this species. Adaptive characteristics of evolved viral populations in N. bethamiana, were also correlated to their genetic variability and population structure. Two different evolved lineages showed convergent evolution processes reflected also at the molecular level. CTV viruses evolved in N. benthamiana were found to be less infectious at initial stages of infection when they were back-inoculated to citrus plants, and showed a decreased viral titer during the first year post-inoculation. This re-adaptation of N. benthamiana viral populations back to citrus was correlated, at a molecular level, with the progressive loss of the mutations appeared during its evolution process in N. benthamiana. / El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es un closterovirus con un RNA genómico (gRNA) de ssRNA (+) y ¿20 Kb organizado en 12 pautas de lectura abierta (ORFs) que codifican al menos 17 proteínas, algunas de función desconocida. Las proteínas p25 y p27 forman parte de un grupo de genes implicados en el ensamblaje del virión, y se ha demostrado que p25 junto con p20 y p23 son supresores de silenciamiento génico en algunas especies de Nicotiana, y la última es también un determinante de patogénesis. CTV tiene una gama de huéspedes muy restringida y de forma natural sólo infecta el floema de algunas especies de cítricos. Por ello, para trabajar con este patosistema virus-huésped, se requiere un huésped experimental adecuado y un sistema genético eficiente de CTV. Durante los últimos años hemos desarrollado un sistema genético de CTV basado en la agroinfección sistémica de Nicotiana benthamiana, una especie no-natural de este virus, con clones infecciosos del genotipo T36. Dicha infección va acompañada de síntomas característicos, algunos de los cuales son similares a los que el virus induce en cítricos. La interacción CTV-N. benthamiana es muy variable y genotipo-dependiente, sólo algunos aislados se replican en esta especie y únicamente T36 la infecta sistémicamente. En este trabajo, abordamos la función de las proteínas p20 y p25 de tres aislados de CTV que difieren en sus características patogénicas. La expresión transitoria de las p20 y p25 fusionadas a proteínas fluorescentes reveló su idéntica localización subcelular en N. benthamiana y cítricos. La proteína p20 se localizó en el citosol y el núcleo celular en agregados amorfos asociados a regiones perinucleares e inclusiones nucleares puntuales. En cambio, la expresión de la p25 de T36, T318A y T385 de CTV reveló una localización diferencial. Mientras la de T36 y T385 fue nuclear, la de T318A fue citosólica. Un análisis detallado de las regiones implicadas en dicha localización, reveló la existencia de una señal de exportación nuclear NES rica en leucinas en la región Nt de la proteína. Un análisis de la capacidad patogénica de p20 y p25 en N. benthamiana en un contexto de infección viral heterólogo a través de PVX, mostró que p25 no es un determinante de patogenicidad en esta especie, pero p20 sí. Por otra parte, el interactoma de la p25-T36 resultó mucho más complejo y diverso que el de la p25-T318A, interviniendo potencialmente en mayor número de procesos metabólicos de fotosíntesis, actividad redox, homeóstasis y transporte celular, biosíntesis y degradación de proteínas, unión a proteínas de los plastidios y ácidos nucleicos o de respuesta a estrés (biótico y oxidativo) o defensa mediada por la ruta del jasmónico, del ciclo de metilación, señalización por ROS y proteínas HSP. Las interacciones mayoritarias de la p25-T318A se relacionaron con transporte/localización y respuesta a estrés, principalmente con interactores implicados en procesos de apoptosis, patogénenis y proteínas HSP, de unión a calcio o redoxinas. También hemos conseguido la evolución experimental de CTV por pases seriados en N. benthamiana. Dicha evolución conlleva un conjunto de características adaptativas significativas como: el aumento del prendimiento de injertos, de la tasa neta de infectividad, del título viral y del adelanto de los síntomas causados en esta especie herbácea con el aumento de los pases. Las características adaptativas también se reflejaron a nivel molecular en la variabilidad genética y estructura de las poblaciones de los virus evolucionados en dos linajes independientes. Virus evolucionados en N. benthamiana resultaron menos infecciosos inicialmente por inoculación mecánica de regreso a cítricos, y se acumularon menos que el virus parental durante el primer año. Dicha re-adaptación de los virus evolucionados se reflejó a nivel molecular en la pérdida progresiva de las m / El virus de la tristesa dels cítrics (CTV) és un closterovirus amb un RNA genòmic de ssRNA(+) i 20 Kb organitzat en 12 pautes de lectura oberta (ORFs) que codifiquen, al menys, 17 proteïnes, algunes de les quals de funció desconeguda. Les proteïnes p25 i p27 formen part d'un grup de gens implicat en l'assemblatge del virió, i s'ha demostrat que p25, junt a p20 i p23, són supressors de silenciament gènic en algunes espècies de Nicotiana, i la última també és un determinant de patogènesi. La gama d'hostes de CTV és molt restringida i de forma natural sols infecta el floema d'algunes espècies de cítrics. Per això, per a treballar amb aquest patosistema virus-hoste, es requereix un hoste experimental adequat i un sistema genètic eficient de CTV. Durant els últims anys hem desenvolupat un sistema genètic de CTV basat en l'agroinfecció sistèmica de Nicotiana benthamiana, una espècie no-natural d'aquest virus, amb clons infecciosos del genotip T36. Aquesta infecció va acompanyada de símptomes característics, alguns dels quals són similars als que el virus indueix en cítrics. La interacció CTV-N. benthamiana és molt variable i genotip depenent, ja que sols alguns aïllats es repliquen en aquesta espècie i únicament T36 la infecta sistèmicament. En aquest treball hem abordat la funció de les proteïnes p20 i p25 de tres aïllats de CTV que difereixen en les seues característiques patogèniques. L'expressió transitòria de les p20 i p25 fusionades a proteïnes fluorescents va revelar la seua idèntica localització subcel·lular en N. benthamiana i cítrics. La proteïna p20 dels aïllats T36, T318A i T385 es va localitzar al citosol i al nucli cel·lular formant agregats amorfs associats a regions perinuclears, i inclusions nuclears puntuals. En canvi, l'expressió de la p25 de T36, T318A i T385 de CTV va revelar una localització diferencial. Mentre la de T36 i T385 fou nuclear, la de T318A fou citosòlica. Una anàlisi detallada de les regions implicades en eixa localització va revelar l'existència d'una senyal d'exportació nuclear (NES) rica en leucines a la regió Nt de la proteïna. L'anàlisi de la capacitat patogènica de p20 i p25 en N. benthamiana en un context d'infecció viral heteròloga a través de PVX, va mostrar que p25 no és un determinant de patogenicitat en aquesta espècie, però p20 sí. D'altra banda, l'interactoma de p25-T36 va resultar molt més complex i divers que el de p25-T318A, intervenint potencialment en un major nombre de processos metabòlics de fotosíntesi, activitat redox, homeòstasi i transport cel·lular, biosíntesi i degradació de proteïnes, unió a proteïnes dels plastidis i àcids nucleics o de resposta a estrés (biòtic i oxidatiu) o defensa mediada per la ruta del jasmònic, del cicle de metilació, senyalització per ROS i proteïnes HSP. Les interaccions majoritàries de la p25-T318A es relacionaren amb transport/localització i resposta a estrés, principalment amb interactors implicats en processos d'apoptosi, patogènesi i proteïnes HSP, d'unió a calci o redoxines. També hem aconseguit l'evolució experimental de CTV per passes seriats en N. benthamiana. Aquesta evolució comporta un conjunt de característiques adaptatives significatives com: l'augment de la supervivència dels empelts, de la taxa neta d'infectivitat, de la càrrega viral i de l'ajornament dels símptomes causats en aquesta espècie herbàcia amb l'augment dels passes. Les característiques adaptatives també es reflectiren a nivell molecular amb la variabilitat genètica i estructura de les poblacions dels virus evolucionats en dos llinatges independents. Virus evolucionats a N. benthamiana resultaren menys infecciosos inicialment per inoculació mecànica de tornada a cítrics, i s'acumularen menys que el virus parental durant el primer any. Aquesta re-adaptació dels virus evolucionats a N. benthamiana de tornada a cítrics es va reflectir a nivell molecular amb / Navarro López, JA. (2017). Estudio preliminar de las interacciones del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) y su huésped [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90468 / TESIS

La Leucoencefalopatía Megalencefálica con Quistes Subcorticales (MLC) es un tipo raro de leucodistrofia vacuolizante, que presenta como principales características clínicas macrocefalia, deterioro de las funciones motoras, epilepsia y retraso mental medio. Sin embargo, el diagnóstico de MLC se confirma mediante imágenes de resonancia magnética, donde el encéfalo se presenta atrofiado e hinchado, muestra una sustancia blanca anormalmente difusa y hay presencia de quistes subcorticales. Desde el punto de vista fisiopatológico, una biopsia obtenida de un paciente de MLC muestra la presencia de numerosas vacuolas situadas en las láminas más externas de la mielina. Se ha encontrado un primer gen responsable de la enfermedad en el 75% de los pacientes afectados, denominado MLC1. Se han descrito alrededor de 60 mutaciones, aunque existen pacientes que manifiestan las características clínicas de la enfermedad pero no presentan mutaciones en MLC1 ni presentan ligamiento con su locus, sugiriendo que existe al menos otro gen involucrado en la enfermedad. En el 25% de pacientes restantes, la enfermedad se manifiesta de dos maneras diferentes: en un caso, los enfermos presentan las mismas características clínicas que los pacientes con mutaciones en MLC1; y en el otro, presentan síntomas transitorios y los pacientes mejoran, llegando incluso a que la enfermedad remitiera. El gen MLC1 codifica para una proteína transmembrana que lleva el mismo nombre. Su función es todavía desconocida. Aunque muestra un bajo grado de homología con el canal de potasio Kv1.1 no se ha podido detectar actividad de canal iónico en diferentes sistemas heterólogos. No obstante, dicha homología, su confinamiento en la membrana plasmática y el fenotipo característico vacuolizante de los pacientes sugieren que la proteína podría estar mediando la translocación de iones a través de la superficie celular. El total desconocimiento del rol preciso de la proteína MLC1 ha imposibilitado el entendimiento del mecanismo patofisiológico de la enfermedad, y por ello, no se ha podido desarrollar ningún tratamiento efectivo para los pacientes afectados. Es por ello que nuestro grupo quiso apostar por estrategias innovadoras (combinación de bioquímica y genética) para poder encontrar otros genes responsables de la enfermedad. Usando técnicas de purificación por afinidad combinada con métodos de proteómica cuantitativa encontramos a GlialCAM como una proteína que estaba asociada con MLC1. Es por eso que decidimos estudiar (en colaboración) si los pacientes que no tenían mutaciones en MLC1 podían presentar mutaciones en GLIALCAM. Tras el análisis de 40 de estos pacientes encontramos que cuando los enfermos tenían las características clínicas típicas de MLC presentaban dos mutaciones en GLIALCAM (herencia recesiva); mientras que en el caso de aquellos que mejoraban a lo largo del tiempo, éstos solo presentaban una mutación (herencia dominante), demostrando que GLIALCAM es el segundo gen de MLC. En este estudio también se ha podido determinar que mutaciones dominantes en GLIALCAM podían también causar otras enfermedades como la macrocefalia familiar benigna y la macrocefalia con retraso mental, con o sin autismo. Estudios bioquímicos posteriores han permitido avanzar en el entendimiento de la relación que existe entre MLC1 y GlialCAM. Así se ha demostrado que GlialCAM actúa como una molécula escolta, necesaria para localizar específicamente a MLC1 en uniones celulares. De esta forma pudimos descubrir que las mutaciones en GLIALCAM provocaban un defecto en el tráfico de la proteína debido a una deficiente oligomerización. Como consecuencia, estas mutaciones provocaban la deslocalización de los complejos de MLC1-GlialCAM en las uniones astrocitarias. De forma interesante, GlialCAM permite estabilizar la proteína MLC1, sugiriendo nuevas aproximaciones terapéuticas para los pacientes afectos con MLC. Tras el descubrimiento de GlialCAM como segundo gen de MLC gracias a la aproximación proteómica, y tras comprobar que no todo GlialCAM estaba asociado a MLC1, nos planteamos volver a realizar estudios de proteómica para intentar encontrar posibles proteínas que pudiesen estar interaccionando con GlialCAM. De esta manera encontramos que el canal de cloruro ClC-2, estaba asociado con GlialCAM, y pudimos comprobar que GlialCAM también actuaba como molécula escolta para localizar específicamente a ClC-2 en las uniones entre células. Además, también era capaz de modificar sus propiedades de canal, así como aumentar su función, demostrándose interacción directa entre ambas proteínas. Igualmente que para el caso de MLC1, las mutaciones encontradas en GLIALCAM fallaban en la capacidad de concentrar a ClC-2 en las uniones astrocitarias. Por tanto, la función de GlialCAM podría ser necesaria para agrupar tanto a MLC1 como a ClC-2 en tales uniones, particularmente en los pies terminales astrocitarios, donde podrían estar llevando a cabo su función. ClC-2 podría ser necesario para desarrollar un flujo de Cl- transcelular o para compensar gradientes electroquímicos iónicos que pueden estar ocurriendo en dichas uniones durante cambios en la osmolaridad. El descubrimiento de GlialCAM como una subunidad auxiliar de ClC-2 incrementa la compleja regulación de este canal y proporciona nuevas ideas acerca del papel que ClC-2 puede estar desempeñando en las células gliales así como se sugiere que pueda estar involucrado en la fisiopatología de MLC. / Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts (MLC) is a leukodystrophy characterized by early-onset macrocephaly and delayed-onset neurological deterioration. Recessive MLC1 mutations are observed in 75% of patients with MLC. Genetic-linkage studies failed to identify another gene. We have showed that some patients without MLC1 mutations display the classical phenotype; others improve or become normal but retain macrocephaly. To find another MLC-related gene, we used quantitative proteomic analysis of affinity-purified MLC1 as an alternative approach and found that GlialCAM, an IgG-like cell adhesion molecule, is a direct MLC1-binding partner. Analysis of 40 MLC patients without MLC1 mutations revealed multiple different GLIALCAM mutations. Patients with the classical phenotype had two mutations, and patients with the improving phenotype had one mutation. In addition, patients with dominant GLIALCAM mutations, could also had macrocephaly and mental retardation with or without autism. Therefore, we found that GLIALCAM is the second gene found to be mutated in MLC. Furthermore, we demonstrated that GlialCAM functions as an MLC1 beta-subunit, needed for proper localization of MLC1 in cell-cell junctions. We also demonstrated that MLC1 and GlialCAM form homo- and hetero-complexes and that MLC-causing mutations in GLIALCAM mainly reduce the formation of GlialCAM homo-complexes, leading to a defect in the trafficking of GlialCAM alone to cell junctions. GLIALCAM mutations also affect the trafficking of its associated molecule MLC1, explaining why GLIALCAM and MLC1 mutations lead to the same disease: MLC. In this thesis, we also identify GlialCAM as a chloride channel ClC-2 binding partner. GlialCAM and ClC-2 colocalize in Bergmann glia, in astrocyteastrocyte junctions at astrocytic end-feet around blood vessels, and in myelinated fiber tracts. GlialCAM targets ClC-2 to cell junctions, increases ClC- 2 mediated currents, and changes its functional properties. Disease-causing GLIALCAM mutations abolish the targeting of the channel to cell junctions. Hence, we describes the first auxiliary subunit of ClC-2 and suggests that ClC-2 may play a role in the pathology of MLC disease.

L'estudi de les diferències fenotípiques entre espècies, i entre individus, ha estat una de les grans qüestions fonamentals en els camps de la biologia evolutiva i la genètica. Ben aviat, es va fer palès que la regulació de l’expressió gènica tindria un paper clau en establir aquestes diferències de complexitat. L’adveniment de les tècniques massives de seqüenciació no van sinó confirmar aquesta visió primerenca. Avui dia coneixem un grapat de mecanismes que determinen aquestes diferències entre organismes, com són la divergència de seqüència proteica, la duplicació gènica o la divergència de la regió cis-reguladora, entre d’altres. En la darrera dècada, l’splicing alternatiu ha anat afermant-se com a mecanisme post-transcripcional freqüent i ha anat prenent protagonisme com a font de variabilitat de transcrits i isoformes proteiques, a més a més de jugar un paper regulador de l’expressió gènica. Per tant, l’splicing alternatiu és un ferm candidat a introduir diferències substancials al proteoma que expliquin la diversitat fenotípica entre organismes. Així doncs, aquest treball es va marcar com a objectiu aclarir fins a quin punt la variabilitat que introduïa l’splicing alternatiu tenia implicacions en el fenotip, quina era la seva conservació i si actuava de manera coordinada o independent amb d’altres mecanismes. En primer lloc, vam estudiar la relació que hi havia entre l’splicing alternatiu i les altres fonts moleculars de diversitat fenotípica i si era possible que l’splicing alternatiu pogués introduir variabilitat amb implicacions fenotípiques per si sola. A continuació, ens vam centrar en els mecanismes reguladors de l’expressió gènica basats en splicing alternatiu, analitzant les seves propietats i la seva conservació entre espècies. Finalment, vam examinar la implicació de l’splicing alternatiu en el fenomen de la domin{ncia gènica, ja que és un procés conegut que determina diferències fenotípiques intraespecífiques. El primer pas fou, doncs, comparar l’splicing alternatiu amb d’altres fonts moleculars de diferències fenotípiques: les divergències de la seqüència proteica, de la regió cis-reguladora del gen i de l’expressió gènica entre hum{ i ratolí. En un estudi massiu de les propietats de tots aquests fenòmens entre 13970 parelles d’ortòlegs, vam observar que l’splicing alternatiu podia introduir diferències abans que les altres variables poguessin fer-ho. Quan les identitats de seqüència proteica o de la regió cis-reguladora eren massa elevades com per introduir diferències, l’splicing alternatiu ja presentava patrons prou diferents en la concurrència d’splicing entre hum{ i ratolí. A més a més, la relació entre l’equivalència d’isoformes amb aquestes divergències també va resultar ser molt lleu, fet que ens va fer pensar que l’splicing alternatiu pot introduir isoformes específiques que contribueixin a les diferències entre espècies abans que les altres divergències puguin fer-ho. Pel que fa al segon bloc, vam investigar la conservació i propietats dels mecanismes reguladors de l’expressió gènica basats en AS. Primer de tot, vam confirmar la independència entre les divergències d’expressió gènica i l’splicing alternatiu, fet que ens indica que actuen a diferents nivells. A continuació, vam definir i classificar aquests mecanismes reguladors depenent com l’splicing alternatiu alterava l’arquitectura de dominis de les isoformes. La conservació d’aquests efectes, dels mecanismes reguladors basats en AS, va resultar ser baixa per tots els casos. Pel que fa als esdeveniments on es perdien un o més dominis a les isoformes alternatives, a més a més de ser baixa la conservació del mecanisme, també ho va ser l’equivalència dels esdeveniments d’splicing alternatiu. Així, tot i tenir efectes a nivell de seqüència no homòlegs, la funció es conservava, fet que ens porta a suggerir que aquests esdeveniments d’AS són un exemple de convergència funcional. Per últim, ens vam fixar en el procés de la dominància, abastament conegut, que introdueix diferències fenotípiques clares entre individus de la mateixa espècie, sobretot en el cas de malalties. Donat el fet que es coneixia una relació inversa entre paralogia i haploinsuficiència, per una banda, i paralogia i splicing per l’altra, sumat a la capacitat d’introduir variabilitat per part de l’splicing alternatiu, vam endegar aquest estudi amb la idea de descriure la relació entre dominància i splicing. El resultat final ens va mostrar una independència dels dos processos, fet que ens va fer qüestionar la relació entre paralogia i splicing alternatiu. Per la resta de variables estudiades, la caracterització de la dominància va concordar amb els resultats de treballs anteriors. / RESUMEN El estudio de las diferencias fenotípicas entre especies ha sido una de les cuestiones fundamentales de la biología evolutiva y la genética. Muy pronto fue evidente que la regulación de la expresión génica seria clava en el establecimiento de estas diferencias, tesis confirmada con las técnicas masivas de secuenciación actuales. Hoy en día, se conocen una serie de mecanismos que determinan estas diferencias, como son la divergencia de la secuencia proteica, la duplicación génica o la divergencia de la región cis-reguladora. En la última década, el splicing alternativo (AS) ha ido afianzándose como mecanismo post-transcripcional y ha ido tomando protagonismo como fuente de variabilidad de transcritos y isoformas, además de jugar un papel regulador de la expresión génica. Por lo tanto, el AS es un firme candidato a introducir diferencias sustanciales en el proteoma que expliquen la diversidad fenotípica entre organismos. Así pues, este trabajo se marcó como objetivo aclarar hasta qué punto la variabilidad que introducía el AS tenía implicaciones en el fenotipo, cuál era su conservación y si actuaba de manera coordinada o independiente con otros mecanismos. En primer lugar, estudiamos la relación que había entre el AS y las otras fuentes moleculares de diversidad fenotípica y si era posible que el AS pudiera introducir variabilidad con implicaciones fenotípicas por sí sola. A continuación, nos centramos en los mecanismos reguladores de la expresión génica basados en AS, analizando sus propiedades y su conservación entre especies. Finalmente, examinamos la implicación del AS en la dominancia génica. En el primer bloque comparamos el AS con otras fuentes moleculares de diferencias fenotípicas: las divergencias de la secuencia proteica, de la región cis-reguladora del gen y de la expresión génica entre humano y ratón. En un estudio masivo de las propiedades de todos estos fenómenos entre 13.970 ortólogos, observamos que el AS podía introducir diferencias antes que las otras variables pudieran hacerlo. Cuando las identidades de secuencia proteica o de la región cis-reguladora eran demasiado elevadas como para introducir diferencias, el AS ya presentaba patrones bastante diferentes en la concurrencia de AS entre humano y ratón. Además, la relación entre la equivalencia de isoformas con estas divergencias también resultó ser muy leve, lo que nos hizo pensar que el AS puede introducir isoformas específicas que contribuyan a las diferencias entre especies antes que las demás divergencias puedan hacerlo. En el segundo bloque investigamos la conservación y propiedades de los mecanismos reguladores de la expresión génica basados en AS. En primer lugar, confirmamos la independencia entre las divergencias de expresión génica y del AS, lo que nos indica que actúan a diferentes niveles. A continuación, definimos estos mecanismos reguladores dependiendo como el AS alteraba la arquitectura de dominios de las isoformas. La conservación de los mecanismos reguladores basados en AS resultó ser baja en todos los casos. En cuanto a los eventos donde se perdían uno o más dominios en las isoformas alternativas, también fue baja la equivalencia de los eventos de AS. Así, pese a tener efectos a nivel de secuencia no homólogos, la función se conservaba, lo que nos permite sugerir que éste es un escenario de convergencia funcional. Por último, nos fijamos en el proceso de la dominancia, largamente conocido, que introduce diferencias fenotípicas intraespecíficas. Dado que se conocía una relación inversa entre paralogía y haploinsuficiencia, por un lado, y paralogía y AS por la otra, sumado a la capacidad de introducir variabilidad por parte del AS, iniciamos este estudio con la idea de describir la relación entre dominancia y AS. El estudio nos mostró una independencia de los dos procesos, cuestionando así la relación entre paralogía y AS. Para el resto de variables estudiadas, la caracterización de la dominancia concordó con resultados de trabajos anteriores. / The study of phenotypic differences between species, and between individuals, has been one of the great fundamental questions in the fields of evolutionary biology and genetics. Soon, it became clear that the regulation of gene expression would have a key role in establishing these differences in complexity. The advent of mass sequencing techniques did confirm this view. Nowadays, we know a handful of mechanisms that determine these differences between organisms, such as protein sequence divergence, gene duplication and divergence of cis-regulatory region, among others. In the last decade, alternative splicing has been asserting itself as a post-transcriptional mechanism and frequently has taken center stage as a source of variability of transcripts and protein isoforms, and also as a key player in the regulation the gene expression. Therefore, alternative splicing is a strong candidate to introduce substantial differences in the proteome that could explain the phenotypic diversity among organisms. Thus, this work was intended to clarify to what extent the variability introduced the alternative splicing (AS) had implications for the phenotype, which was its conservation and if it acted in a coordinated or independent way relative to other mechanisms. First, we studied the relationship that existed between AS and other sources of molecular and phenotypic diversity and elucidate if AS could introduce phenotypic variability with its own implications. Then we focused on the regulatory mechanisms of gene expression based on AS, analyzing their properties and their conservation between species. Finally, we examined the involvement of AS in the phenomenon of genetic dominance, since it is a known process that determines intraspecific phenotypic differences. The first step was therefore to compare the AS with other sources of molecular phenotypic differences: differences in the protein sequence, the cis-regulatory region of the gene and gene expression between human and mouse. In a massive study of the properties of these phenomena among 13,970 pairs of orthologous, we observed that alternative splicing could introduce differences before other variables could do it. When the identities of protein sequence or cis-regulatory region were too high for introducing differences, AS patterns appeared quite different in the occurrence of splicing between human and mouse. Furthermore, we found that the relationship between the equivalence of isoforms with those differences was very mild, which made us think that AS can introduce specific isoforms that contribute to differences between species before other divergences can do it. Regarding the second section, we investigated the properties and the conservation of the regulatory mechanisms of gene expression based on AS. First, we confirmed the independence between the divergence of gene expression and AS, which indicates that they act at different levels. Then we defined and classified these regulatory mechanisms depending on how the AS altered the domain architecture of the isoforms. The conservation of these effects, the regulatory mechanisms based on AS, was found to be low for all cases. With regard to the events where they lost one or more domains in the alternative isoforms, in addition to the low conservation of the mechanism, it was also low the equivalence of alternative splicing events. So, despite having an non-homologue effect on the level of sequence, the function was preserved, which leads us to suggest that these AS events are an example of functional convergence. Finally, we studied the well known process of dominance which introduces clear phenotypic differences between individuals of the same species, especially in the case of diseases. Given the fact that it is known the inverse relationship between paralogy and haploinsufficiency and, in the other hand, the inverse relationship between paralogy and AS, adding to this the ability of introducing variability by AS, we undertook this study with the idea of describe the relationship between dominance and splicing. The final result showed us that they are two independent processes, which made us question the relationship between paralogy and AS. For the remaining variables, the characterization of the dominance results agreed with previous work.

[EN] Previous results obtained in the research group where this thesis has been performed shown that the MNSV uses the cellular secretory pathway, through its membrane protein DGBp2 (p7B) to reach the cell periphery. Knowledge about signals/motifs of membrane proteins that facilitate or permit such transport was then rather scarce. In this work we determined the residues involved in the transport of a viral transmembrane protein through the early secretory pathway (DGBp2, MNSV p7B). The residues involved are located in both the Nt (cytosolic) and Ct region (luminal) being one of the first examples in plants of a luminal ER export signal. With this information we have proposed a model in which after insertion and correct folding of the protein in the ER membrane, the luminal Ct of p7B interacts through the K49 residue with a transmembrane adapter associated with the actin cytoskeleton for movement and concentration in the RE-cortical. Nt cytoplasmic seems to be necessary to associate with the COPII vesicle components. Moreover, we have deepened in the study of the interactome of the carmovirus MPs and we have identified through a two-hybrid assay (Y2H), three cellular proteins capable of interacting with three DGBp1 from three different carmovirus (MNSV, TCV and CarMV). These cellular factors are the 60S ribosomal protein P3 (RPP3A), the g subunit of the translation initiation factor 3 (eIF3g) and the transcription factor WRKY36. These interactions were confirmed by BiFC. Furthermore, mutagenesis assays showed that binding domain of these DGBp1 is a FNF conserved domain at the very Ct end. The fact that these three proteins interact with the same host factors suggest a possible mechanism common to most if not all carmoviruses. The unstructured Nt region of MNSV CP, as for other RNA viruses, generally is responsible for viral RNA binding so it is usually called R domain. By using substitution and deletion mutants, we have shown that this R domain (which in MNSV comprising the first 94 residues) is not involved only in the packaging and binding of the viral genome, but is also responsible of CP multifunctionality. By EMSA assays with deletion mutants we could determine that the R domain was essential for binding of RNA. It was further noted that within the R domain there was a conserved region between aa 60 to 91 region, which appears to play a role in both the genomic RNA binding and in vitro encapsidation of subgenomic RNAs. However, in packaging assays, it was observed that the R domain is essential for full genome encapsidation and that the region between residue 31 and 91 is required for both cell to cell and systemic movement. Finally, using PVX as an expression vector, we showed that MNSV CP can act as a suppressor of silencing most likely by sequestering sRNAs. With very few exceptions, plant viruses use the phloem to move from infection sites to distal parts of the plant. In order to know the phloem proteome of infected plants and to identify in the future potential host proteins that facilitate or hinder the systemic transport of viruses, in the last chapter we conducted a comparative proteomic analysis by 2D-DIGE between phloem of MNSV-infected and healthy melon plants. From a total of 1046 spots, 25 were detected having significant abundance changes between the two conditions. After mass spectrometric analysis, 22 spots corresponding to 19 protein, were identified (13 of which were overrepresented and 9 had decreased abundance). Many of the identified proteins were involved in cell death and control of redox homeostasis. Two of these 19 proteins were never described in phloem proteomic assays. / [ES] Resultados previos obtenidos en el grupo de investigación donde se ha realizado la presente Tesis habían puesto de manifiesto que el MNSV utiliza la ruta de secreción celular, a través de su proteína de membrana DGBp2 (p7B), para alcanzar la periferia celular. Hasta el momento de realizar la presente Tesis los conocimientos sobre las señales/motivos de las proteínas de membrana que facilitan o permiten dicho transporte eran más bien escasos. En este trabajo hemos determinado los residuos implicados en la salida de una proteína transmembrana viral en la ruta de secreción temprana (DGBp2, p7B MNSV). Los residuos implicados se encuentran tanto en la región Nt (citosólica) como en la Ct (luminal) siendo éste uno de los primeros ejemplos descritos en plantas de señal luminal de salida de RE. Con todos estos datos se ha propuesto un modelo en el que después de la inserción y correcto plegamiento de la proteína en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residuo K49 con un adaptador transmembrana asociado al citoesqueleto de actina para su movimiento y concentración en el RE cortical. El motivo Nt citoplasmático sería necesario para el ensamblaje de la vesícula COPII. Por otra parte se ha profundizado en el estudio del interactoma de las MPs de los carmovirus y se han identificado, mediante un ensayo de doble híbrido (Y2H), tres proteínas celulares capaces de interaccionar con tres DGBp1 procedentes de tres carmovirus diferentes (MNSV, TCV y CarMV). Estos factores celulares son la proteína P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunidad g del factor de iniciación de la traducción 3 (eIF3g) y el factor de transcripción WRKY36. Estas interacciones fueron confirmadas por BiFC. Además, mediante ensayos de mutagénesis se demostró que el dominio de unión de estas DGBp1 es un dominio Ct (FNF) conservado. El hecho de que estas tres proteínas interaccionen con los mismos factores sugiere un posible mecanismo común para todos o la mayor parte de los carmovirus. Las CPs virales constituyen el paradigma de la multifuncionalidad proteica y, además de su obvio papel estructural, intervienen en un gran número de procesos del ciclo viral, incluyendo el transporte del RNA viral. La región Nt desestructurada de la CP del MNSV, al igual que para otros virus de RNA, generalmente es la encargada de unir el RNA viral por lo que se le suele llamar dominio R. Mediante mutantes de deleción y sustitución se ha demostrado que este dominio R (que en el MNSV comprende los primeros 94 residuos) no interviene solo en la encapsidación y unión del genoma viral, sino que es la responsable de la multifuncionalidad de la CP. Mediante EMSAs con mutantes de deleción se pudo determinar que la región R es esencial para la unión del RNA. Además se observó que dentro del dominio R se encuentra una región conservada entre los aa 60 al 91, que parece desempeñar un papel tanto en la unión de RNA genómico in vitro como en la encapsidación de RNAs subgenómicos. Sin embargo, en ensayos de encapsidación se observó que todo el dominio R es esencial para la encapsidación del genoma completo y que la región comprendida entre el residuo 31 y el 91 es necesaria para el movimiento tanto célula a célula como sistémico. Finalmente, utilizando PVX como vector de expresión, se demostró que la CP del MNSV puede actuar como un supresor del silenciamiento mediante la unión a los sRNAs. Con objeto de conocer el proteoma del floema de plantas infectadas y poder en el futuro identificar posibles proteínas del huésped que faciliten o dificulten el transporte sistémico de los virus, en el último capítulo se llevó a cabo un análisis proteómico comparativo, mediante 2D-DIGE, entre floemas de plantas de melón infectadas con MNSV y plantas sanas. Se detectaron 1046 spots de los cuales 2 poseían cambios significativos entre las dos condiciones Dos de estas 19 proteínas no habían sido descritas previamente en ens / [CAT] Resultats previs obtinguts en el grup de recerca on s'ha realitzat la present Tesi havien posat de manifest que el MNSV utilitza la ruta de secreció cel·lular, a través de la seva proteïna de membrana DGBp2 (p7B), per arribar-hi a la perifèria cel·lular. Fins al moment de realitzar la present Tesi els coneixements sobre els senyals/motius de les proteïnes de membrana que faciliten o permeten aquest transport eren més aviat escassos. En aquest treball hem determinat els residus implicats en el transport d'una proteïna transmembrana viral a través de la ruta de secreció primerenca (DGBp2, p7B MNSV). Els residus implicats es troben tant a la regió Nt (citosòlica) com en la Ct (luminal) sent aquest un dels primers exemples descrits en plantes de senyal luminal de sortida de RE. Amb totes aquestes dades s'ha proposat un model en el qual després de la inserció i correcte plegament de la proteïna en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residu K49 amb un adaptador transmembrana associat al citoesquelet d'actina per al seu moviment i concentració en el RE cortical. El motiu Nt citoplasmàtic caldria per a l'acoblament de la vesícula COPII. D'altra banda s'ha aprofundit en l'estudi del interactoma de les MPs dels carmovirus i s'han identificat, mitjançant un assaig de doble híbrid (Y2H), tres proteïnes cel·lulars capaces d'interaccionar amb tres DGBp1 procedents de tres Carmovirus diferents (MNSV, TCV i CarMV). Aquests factors cel·lulars són la proteïna P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunitat g del factor d'iniciació de la traducció 3 (eIF3g) i el factor de transcripció WRKY36. Aquestes interaccions van ser confirmades per BiFC. A més, mitjançant assajos de mutagènesi es va demostrar que el domini d'unió d'aquestes DGBp1 és un domini Ct (FNF) conservat. El fet que aquestes tres proteïnes interaccionen amb els mateixos factors suggereix un possible mecanisme comú per a tots o la major part dels carmovirus. Les CPs virals constitueixen el paradigma de la multifuncionalitat proteica i, a més del seu obvi paper estructural, intervenen en un gran nombre de processos del cicle viral, incloent el transport de l'RNA viral. La regió Nt desestructurada de la CP del MNSV, igual que per altres virus de RNA, generalment és l'encarregada d'unir l'RNA viral pel que se li sol cridar domini R. Mitjançant mutants de deleció i substitució s'ha demostrat que aquest domini R (que en el MNSV comprèn els primers 94 residus) no intervé només a la encapsidación i unió del genoma viral, sinó que és la responsable de la multifuncionalitat de la CP. Mitjançant EMSAs amb mutants de deleció es va poder determinar que el domini R essencial per a la unió de l'RNA. A més es va observar que dins del domini R es troba una regió conservada entre els aa 60 al 91, que sembla tenir un paper tant en la unió de RNA genòmic in vitro com en l'encapsidació de RNAs subgenómicos. No obstant això, en assajos d'encapsidació es va observar que tot el domini R és essencial per a l'encapsidació del genoma complet i que la regió compresa entre el residu 31 i el 91 és essencial per al moviment tant cèl·lula a cèl·lula com sistèmic. Finalment, utilitzant PVX com a vector d'expressió, es va demostrar que la CP del MNSV pot actuar com un supressor de silenciament mitjançant la unió als sRNAs. Amb l'objecte de conèixer el proteoma del floema de plantes infectades i poder en el futur identificar possibles proteïnes de l'hoste que facilitin o dificultin el transport sistèmic dels virus, en l'últim capítol es va dur a terme una anàlisi proteòmic comparatiu, mitjançant 2D-DIGE, entre floemas de plantes de meló infectades amb MNSV i plantes sanes. Es van detectar 1046 espots dels quals 25 tenien canvis significatius entre les dues condicions. Després de sotmetre les proteïnes a una anàlisi d'espectrometria de masses , es van identificar 19 proteïnes que corresponien a 22 espots Dues / Serra Soriano, M. (2016). Relación estructura-función de las proteínas virales implicadas en el movimiento de los carmovirus y su interacción con factores celulares [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61634 / TESIS

Tesis por compendio / [EN] A series of biochemical reactions responsible for aroma, color, texture and flavour of the final product occur during the dry-cured ham processing. Among these reactions, proteolysis of muscle proteins is one of the most important, resulting in the generation of a large amount of peptides which could be used as quality markers of dry-cured ham. In this sense, proteomic techniques based on mass spectrometry have become a fundamental tool for the identification of peptides naturally generated throughout the dry-cured ham processing. So, the present Thesis has been focused on the study of the intense degradation of three proteins present in dry-cured ham: LIM domain-binding protein 3, ubiquitin-60S ribosomal protein and titin protein, identifying the peptide sequences generated at different times along the process and evaluating their potential as markers of dry-cured ham processing time. Moreover, peptide oxidation that occurs during dry-curing process has been studied due to its importance on final quality of dry-cured ham as well as its influence on the nutrititional and sensory characteristics, showing oxidation of methionine residues in numerous peptides generated from the degradation of the major myofibrillar proteins. Besides the identification of peptidic sequences, recent advances in mass spectrometry techniques have allowed the precise quantitation of proteins in complex mixtures. So, a label-free methodology has been optimized for the relative quantitation of major sarcoplasmic proteins from the quantitation of the generated peptides and the study of the proteolytic degradation along the dry-cured ham processing. This methodology represents an advance regarding quantitative methods used to date as it allows a simple, accurate and reliable evaluation of changes in the abundance of proteins throughout the dry-cured ham processing. Several recent studies have been focused on the study of the potential of dry-cured ham as a source of bioactive peptides, mainly those showing angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity. However, it is not clear whether these peptides are able to cross the intestinal barrier and reach the blood stream in an active form. Thus, in the present Thesis the transepithelial transport of dry-cured ham peptides having ACE inhibitory activity has been simulated through a Caco-2 cell monolayer, showing the absorption of intact peptides or fragments generated by the action of intestinal peptidases, which could exert an in vivo antihypertensive effect. / [ES] Durante el proceso de elaboración del jamón curado tienen lugar una serie de reacciones bioquímicas responsables del aroma, color, textura y sabor del producto final. Entre estas reacciones destaca la intensa proteolisis de las proteínas musculares, cuyo resultado es la generación de una gran cantidad de péptidos algunos de los cuales podrían ser utilizados como marcadores de calidad del jamón. En este sentido, las técnicas proteómicas basadas en espectrometría de masas son una herramienta fundamental para la identificación de los péptidos generados de manera natural a lo largo de proceso de elaboración del jamón curado. Así, la presente Tesis Doctoral se ha centrado en estudiar la intensa degradación de tres proteínas presentes en el jamón: la proteína 3 de unión al dominio LIM, la proteína ribosomal ubiquitina-60S y la proteína titina, identificando las secuencias de los péptidos generados a distintos tiempos durante el proceso y evaluando su potencial como marcadores del tiempo de curado del jamón. Además, se han estudiado los cambios oxidativos a nivel peptídico que tienen lugar durante el proceso de curado del jamón, cuya importancia radica en su efecto sobre la calidad y las características tanto nutricionales como sensoriales del producto final, evidenciando la oxidación del aminoácido metionina en numerosos péptidos generados a partir de las principales proteínas miofibrilares. Además de la identificación de las secuencias peptídicas, los recientes avances en técnicas de espectrometría de masas han permitido la cuantificación precisa de proteínas en muestras complejas. Así, se ha optimizado un método sin marcaje ("label-free") para la cuantificación relativa de las principales proteínas sarcoplásmicas a partir de la cuantificación de los péptidos generados y de esta forma estudiar la degradación proteolítica durante el proceso de elaboración del jamón curado. Esta metodología supone un avance respecto a los métodos cuantitativos utilizados hasta el momento ya que permite evaluar de manera sencilla, precisa y fiable los cambios en la abundancia de proteínas a lo largo del proceso de elaboración del jamón curado. Varios estudios recientes se han centrado en estudiar el potencial del jamón curado como fuente de péptidos bioactivos, principalmente aquellos que son inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA). Sin embargo, no se conoce si estos péptidos son capaces de atravesar la barrera intestinal y alcanzar la corriente sanguínea en forma activa. Por ello, en la presente Tesis Doctoral se ha simulado el transporte intestinal mediante la utilización de células Caco-2 de péptidos del jamón inhibidores de la ECA, evidenciado la absorción de péptidos enteros, o fragmentos de los mismos generados por acción de las peptidasas intestinales, que podrían ejercer un efecto antihipertensivo in vivo. / [CA] Al llarg del procés d'elaboració del pernil curat tenen lloc una sèrie de reaccions bioquímiques responsables de l'aroma, color, textura i sabor del producte final. Entre aquestes reaccions destaca la intensa proteolisis de les proteïnes musculars, el resultat de la qual és la generació d'una gran quantitat de pèptids alguns dels quals podrien ser utilitzats com a marcadors de qualitat del pernil. En aquest sentit, les tècniques proteòmiques basades en espectrometria de masses són una ferramenta fonamental per a la identificació dels pèptids generats de manera natural al llarg de procés d'elaboració del pernil curat. Així, la present Tesi Doctoral s'ha centrat a estudiar la intensa degradació de tres proteïnes presents en el pernil: la proteïna 3 d'unió al domini LIM, la proteïna ribosomal ubiquitina-60S i la proteïna titina, identificant les seqüències dels pèptids generats a distints temps al llarg del procés i avaluant el seu potencial com a marcadors del temps de curat del pernil. A més, s'han estudiat els canvis oxidatius a nivell peptídic que tenen lloc durant el procés de curat del pernil, la importància dels quals radica en el seu efecte sobre la qualitat i les característiques tant nutricionals com sensorials del producte final, evidenciant l'oxidació de l'aminoàcid metionina en nombrosos pèptids generats a partir de les principals proteïnes miofibrilars. A més de la identificació de les seqüències peptídiques, els recents avanços en tècniques d'espectrometria de masses han permés la quantificació precisa de proteïnes en mostres complexes. Així, s'ha optimitzat un mètode sense marcatge ("label-free") per a la quantificació relativa de les principals proteïnes sarcoplàsmiques a partir de la quantificació dels pèptids generats i d'esta manera estudiar la degradació proteolítica durant el procés d'elaboració del pernil curat. Esta metodologia suposa un avanç respecte als mètodes quantitatius utilitzats fins al moment ja que permet avaluar de manera senzilla, precisa i fiable els canvis en l'abundància de proteïnes al llarg del procés d'elaboració del pernil curat. Diversos estudis recents s'han centrat en estudiar el potencial del pernil curat com a font de pèptids bioactius, principalment aquells que són inhibidors de l'enzim convertidor d'angiotensina I (ECA). No obstant això, no es coneix si aquests pèptids són capaços de travessar la barrera intestinal i arrivar al corrent sanguini en forma activa. Per això, en la present Tesi Doctoral s'ha simulat el transport intestinal mitjançant l'utilització de cèl·lules Caco-2 amb pèptids del pernil inhibidors de l'ECA, evidenciant l'absorció de pèptids sencers, o fragments generats per acció de les peptidases intestinals, que podrien exercir un efecte antihipertensiu in vivo. / Gallego Ibáñez, M. (2015). PÉPTIDOS GENERADOS EN JAMÓN CURADO COMO MARCADORES DE CALIDAD [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/55506 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

La fecundación en mamíferos consiste básicamente en la fusión de los gametos masculino y femenino para formar un zigoto capaz de dar lugar a un nuevo individuo. Hasta ahora, la mayoría de las investigaciones encaminadas al esclarecimiento de este proceso se han centrado en el estudio de la biología de ambos gametos como células aisladas, o bien en el estudio de los diversos mecanismos que tienen lugar durante la interacción de ambos. Sin embargo, se ha dejado un poco de lado a otro elemento fundamental y sin el cual el resto de estudios pueden resultar incompletos: el microambiente en el que tiene lugar el encuentro entre los gametos, es decir, el fluido y las células oviductales que secretan ciertos componentes de dicho fluido. La fase folicular tardía o etapa inmediatamente preovulatoria, es el momento en el que el oviducto se encuentra preparado para el encuentro de los gametos y para que se produzca la fecundación. Debido a la importancia de los factor es implicados en la unión de gametos que han de estar presentes en este momento preciso del ciclo estral y a la escasez de información acerca de los mismos, centramos nuestro estudio en esta fase. Para ello, se abordó el análisis de los componentes oviductales y sus características fundamentalmente desde cuatro perspectivas: (1) efecto del fluido oviductal (FO) sobre la resistencia a la digestión enzimática de la zona pelúcida en 9 especies, (2) fraccionamiento del FO bovino en base a su capacidad de unión a heparina, (3) análisis proteómico del FO y (4) análisis de la expresión génica del oviducto porcino. / Fertilization in mammals is basically the merging of male and female gametes to form a zygote that can give rise to a new individual. So far, most research aimed at clarifying this process have focused either on the study of the biology of the spermatozoon and the oocyte as isolated cells or in the study of the various mechanisms that occur during the interaction of both. However, it has been partially left to one side to another key element without which the other studies may be incomplete: the microenvironment in which the meeting takes place between the gametes, ie the fluid and the oviductal cells that secrete some components of such a fluid. The late follicular phase or immediately pre-ovulatory phase is the time when the oviduct is prepared for the meeting of gametes and fertilization occurs. Due to the importance of the factors involved in the gametes interaction which must be present at this precise moment of the estrous cycle and the scarcity of information about them, we focused our study on this phase. To do so, it was addressed the analysis of oviductal components and features mainly from four perspectives: (1) effect of oviductal fluid (OF) on the resistance to enzymatic digestion of the zona pellucida in 9 species, (2) fractionation of the bovine oviductal fluid based on their ability to bind to heparin, (3) proteomic analysis of OF and (4) gene expression analysis of pig oviduct.

Les Streptomyces sont des bactéries filamenteuses du sol à Gram +. Elles sont connues pour leur capacité à produire des métabolites secondaires utiles en médecine et en agriculture. S. coelicolor et S. lividans sont des souches modèles phylogénétiquement proches. Elles ont cependant des capacités contrastées à accumuler des lipides de réserve de la famille des triacylglycérol (TAG) et produire des métabolites secondaires alors qu’elles possèdent des voies de biosynthèse similaires pour ces deux types de molécules. En présence de glucose, S. coelicolor produit des niveaux élevés de métabolites secondaires spécifiques et son contenu en TAG est faible alors que c'est le contraire chez S. lividans. En revanche, en présence de glycérol, les deux souches accumulent une quantité de TAG similaire mais S. coelicolor produit aussi des métabolites secondaires. Le but de la présente thèse était de déterminer les caractéristiques métaboliques différentielles qui sous-tendent les différentes capacités biosynthétiques de ces deux souches modèles. Pour ce faire, une analyse protéomique comparative sans marquage des souches cultivées en milieu R2YE liquide ou solide en présence de glucose ou de glycérol comme principales sources de carbone a été réalisée en utilisant la technique de chromatographie liquide couplée à de la Spectrométrie de Masse en tandem (LC-MS / MS). Au total, 2024 et 4372 protéines ont été identifiées à partir des cultures liquides et solides, représentant 24% et 50% du protéome théorique. Les études en liquide ont révélé que le métabolisme de S. lividans était principalement glycolytique alors que le métabolisme de S. coelicolor était principalement oxydatif. Elles ont également indiqué que ces caractéristiques pourraient être liées au catabolisme préférentiel des acides aminés par rapport au glucose chez S. coelicolor par rapport à S. lividans. De plus, cette thèse constitue la première analyse protéomique du métabolisme de ces deux souches modèles en présence de glycérol. / Streptomyces are filamentous Gram+ soil bacteria well known for their ability to produce secondary metabolites useful in medicine and agriculture. S. coelicolor and S. lividans are phylogenetically closely-related model strains but they have contrasted abilities to accumulate storage lipids of the TriAcylGlycerol (TAG) family and to produce secondary metabolites whereas they possess similar pathways for the biosynthesis of these molecules. In the presence of glucose, S. coelicolor produces high levels of specific secondary metabolites and its TAG content is low whereas it is the opposite for S. lividans. In contrast, in the presence of glycerol, the two strains accumulated similar amount of TAG but S. coelicolor still produces secondary metabolites. The aim of the present thesis was to determine the differential metabolic features supporting such different biosynthetic abilities. To do so, a comparative label-free shotgun proteomic analysis of the strains grown in liquid or solid R2YE media with glucose or glycerol as main carbon sources was carried out using Liquid chromatography−tandem mass spectrometry (LC−MS/MS). A total of 2024 and 4372 proteins were identified in liquid and solid cultures, representing 24% and 50% of the theoretical proteome, respectively. These studies revealed that S. lividans metabolism was mainly glycolytic whereas S. coelicolor metabolism was mainly oxidative. They also suggested that these features might be related to the preferential catabolism of amino acids over glucose of S. coelicolor compared to S. lividans. Furthermore, this thesis constituted the first proteomic analysis of the metabolism of these two model strains in the presence of glycerol. / Streptomyces es un género de bacterias filamentosas Gram+ provenientes del suelo que son conocidas por su capacidad para producir metabolitos secundarios útiles en la medicina y agricultura. S. coelicolor y S. lividans son cepas modelo filogenéticamente próximas que presentan capacidades opuestas para acumular lípidos de reserva de la familia de los triglicéridos (TAG) y para producir metabolitos secundarios en tanto que ambas cepas poseen rutas metabólicas idénticas para la biosíntesis de éstas moléculas. En presencia de glucosa, S. coelicolor produce altos niveles de metabolitos secundarios específicos y su contenido de TAG es bajo mientras que en S. lividans el comportamiento es opuesto. Sin embargo, en presencia de glicerol, ambas cepas acumulan cantidades similares de TAG y S. coelicolor produce metabolitos secundarios. El objetivo de ésta tesis fue de determinar las características metabólicas que distinguen las diferentes capacidades biosintéticas mencionadas previamente. Por esto, un análisis protéomico comparativo sin marcaje de tipo “shotgun” fue realizado con las dos cepas cultivadas en medio R2YE líquido y sólido usando glucosa o glicerol como fuentes principales de carbono mediante Cromatografía Líquida en “tándem” acoplada a Espectrometría de Masas (LC-MS/MS). Un total de 2024 y 4372 proteínas fueron identificadas en cultivos en medio líquido y sólido, representando 24% y 50% del proteoma teórico, respectivamente. El presente estudio demostró que el metabolismo de S. lividans fue principalmente glicolítico mientras que el metabolismo de S. coelicolor fue principalmente oxidativo. También se sugiere que éstas características pueden estar relacionadas con la preferencia catabólica de aminoácidos sobre el catabolismo de glucosa de S. coelicolor comparada con S. lividans. Además, la presente tesis constituye el primer análisis proteómico del metabolismo de éstas dos cepas modelo en presencia de glicerol.

Plastids are the cellular organelles where many of the visual, health and flavor-related metabolites are produced and stored in the fruit, and therefore are valuable components for consumers and breeders. The more sugar and flavor the fruit has, the more appreciated is for the consumer and industry. Thus, one of the breeder's goals is to obtain new varieties with fruits improved in these aspects. Paradoxically, fruits with a high content in chloroplasts have been avoided by the breeders because it usually suffers of oxidative stress disorders; such yellow shoulder impairment and fruit cracking when the light intensity increases. For this reason breeding efforts has been focused mainly on avoiding fruit losses and organoleptic characteristics have been neglected. This thesis aims to improve tomato fruit quality by engineering plants to produce fruits with enhanced fruit chloroplast functions and improved tolerance to oxidative stress, using cisgenic/ intragenic approaches. SlGLK1, SlGLK2 and SlAPRR2 transcription factors have been suggested to be involved in chloroplast development. Tomato MoneyMaker plants were engineered to express SlGLKs and SlAPRR2 either singly or in combination early in development. Those lines provide fruits which accumulate more sugars, carotenoids and specific volatiles than WT. The fruit chloroplast enhanced lines were characterized at the structural, metabolic, proteomics and transcriptomics. A novel additive effect in the chloroplast regulation network resulted when both transcription factors were coexpressed and a hypothesis for this effect is presented. In addition, two tomato traditional varieties (Muchamiel and Pera) expressing tomato genes for BMW anthocyanin regulatory complex under the control of the light inducible promoter (PLI) were produced and characterized. Engineered tomato plants showed large accumulation of anthocyanin specifically in the fruit peel and in Type VI trichomes. Characterization of those tissues indicated specific alterations of the flavonoid pathway that were highly dependent on the light conditions. These tomato lines could be of high interest to protect the fruit chloroplast enhancement lines from eventual stresses involving ROS, and also to assess the effect on plant growth under high light stress and in plant-pest interaction studies. / Los plastidos son orgánulos celulares donde se producen y almacenan muchos de los metabolitos relacionados con atributos organolépticos y compuestos beneficiosos para la salud, por lo tanto se consideran componentes de alto valor añadido para consumidores y mejoradores vegetales. Cuanto mayor contenido en azúcares solubles y sabor presente el fruto más se valoran por los consumidores y la industria. Por lo tanto uno de los objetivos actuales de los mejoradores de tomate es mejorar el fruto en estos aspectos. Paradójicamente, se ha seleccionado en contra de frutos con alto contenido en cloroplastos porque este carácter, bajo alta intensidad lumínica, suele estar asociado a daños en el fruto por estrés oxidativo; como los hombros amarillos del tomate o el agrietado del fruto. Por este motivo los esfuerzos en mejora se han orientado principalmente a evitar pérdidas y consecuentemente la calidad organoléptica se ha visto reducida. El objetivo de esta tesis es mejorar la calidad del fruto de tomate mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética orientadas a incrementar los cloroplastos en fruto y mejorar la tolerancia al estrés oxidativo con una aproximación cis/ intragenica. Los factores de transcripción SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 han sido estudiados por influir en el desarrollo del cloroplasto. Plantas de tomate de variedad MoneyMaker fueron mejoradas genéticamente para expresar de forma individual o conjunta SlGLKs y SlAPRR2 en estadios tempranos de desarrollo. Estas líneas proveen frutos con mayor acumulo de azúcares, carotenos y volátiles que el control MoneyMaker. Las líneas potenciadas en desarrollo de cloroplastos se caracterizaron a nivel estructural, metabólico, proteómico y transcriptómico. Se descubrió un novedoso efecto aditivo en la regulación génica del cloroplasto cuando ambos factores de transcripción se expresan simultáneamente y se presentó una hipótesis para dicho efecto. Además se caracterizaron dos variedades tradicionales de tomate (Muchamiel and Pera) diseñadas para expresar genes pertenecientes al complejo de regulación de antocianinas BMW, bajo el control del promotor inducible por luz (PLI). Las plantas mejoradas genéticamente presentan una gran acumulación de antocianos, especialmente en piel de fruto y en tricomas tipo VI. Caracterización de estos tejidos indican alteraciones específicas en la ruta de flavonoides y una alta dependencia a condiciones de luz. Estas plantas podrían ser de gran interés para proteger frutos con altos niveles de cloroplastos frente al estrés oxidativo generado por ROS, para evaluar el efecto en el crecimiento de la planta bajo condiciones de alta luz y en futuros estudios de interacción planta-patógenos / Els plastidis són orgànuls cel.lulars on es produeixen i emmagatzemen molts dels metabòlits relacionats amb atributs organolèptics i composts beneficiosos per a la salut, per tant es consideren components d'alt valor afegit per a consumidors i milloradors vegetals. Quant major contingut en sucres solubles i sabor presenta el fruït, més serà valorat per part dels consumidors i la industria. Paradoxalment, s'ha seleccionat en contra dels fruïts amb alt contingut en cloroplasts perquè aquest caràcter, davall alta intensitat lumínica, sol estar associat amb danys en el fruït per estrés oxidatiu; com muscles groguencs de la tomata o clevitjament del fruït. Per aquest motiu, l'esforç en millora s'ha orientat principalment a evitar pèrdues de manera que la qualitat organolèptica s'ha vist reduïda. L'objectiu d'aquesta tesi es millorar la qualitat del fruït de tomata mitjançant l'ús de tècniques d'enginyeria genètica orientades a incrementar els cloroplasts al fruït i millorar la tolerància a l'estrès oxidatiu amb una aproximació cis/intragènica. Plantes de tomata de la varietat MoneyMaker foren millorades genèticament per expressar de manera individual o conjunta SlGLK1, SlGLK2 y SlAPRR2 als moments inicials del desenvolupament. Aquestes línies donen fruïts amb major acumulació de sucres, carotens i volàtils que el control MoneyMaker. Les línies potenciades amb el desenvolupament de cloroplasts es caracteritzaren a nivell estructural, metabòlic, proteòmic i transcriptòmic. Es va descobrir un nou efecte additiu en la regulació gènica del cloroplast quan ambdós factors de transcripció s'expressen de manera simultània i es va presentar una hipòtesi per a dit efecte. A més, es van caracteritzar dos varietats tradicionals de tomata (Muchamiel i Pera) dissenyades per a expressar gens que pertanyen al complex de regulació d'antocians BMW, davall el control del promotor induïble per llum (PLI). Les plantes millorades genèticament presentaren una gran acumulació d'antocians, especialment a la pell del fruït i en tricomes de tipus VI. La caracterització d'aquest teixit indica alteracions específiques en la ruta dels flavonoides i una altra dependència a condicions de llum. Aquestes plantes podrien ser de gran interès per a protegir els fruïts d'alts nivells de cloroplasts front a l'estrès oxidatiu generat pels ROS, i per a avaluar l'efecte en el creixement de la planta davall condicions d'alta llum i en futurs estudis d'interacció planta-patògen. / Cocaliadis Caisson, MF. (2017). A multilevel, developmentally controlled gene engineering strategy for tomato fortification and protection [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90401 / TESIS