No description available.

[EN] The main objective of this work focuses on the use of biotechnology to develop new varieties of sugarcane for increasing productivity as well as the genetic variability that is narrow in this crop. With this purpose we have evaluated the genetic diversity in a population of 204 varieties (putative use as parental), using three molecular markers (CV29, CV37 and CV38) which showed an average polymorphic information content (PIC) of 0.37 indicating that they were able to identify polymorphisms in the population. After calculating the genetic similarity between the varieties and based on it, they were organized into 20 groups. Moreover, the Bru1 marker associated with resistance of a fungal disease known as brown rust was used to analyze 303 varieties (including the 204 previously used). We obtained amplification in 77. The comparison with phenotypic data recorded during four years at two locations confirmed that these 77 varieties were resistant. However, those that did not amplify showed resistance and susceptibility (in 7%), indicating the putative presence of different alleles of resistance. With the above information we design and conduct 22 cross whose offspring F1 were evaluated for four consecutive years recording with the average of each family to features like Brix (%), plant height, stem diameter, number of stems per meter and incidence of major diseases. From 22 crosses, 18 families showed brix equal or higher than CP72-2086 (the control variety), indicating that could overcome their sugar yield as a result of higher sugar content in their stems, although did not exceed in mass of cane. Several varieties with high Brix and tolerance to different diseases have been selected. Another important problem in sugarcane is the propagation of materials from plants that were pathogen infected but do not manifest disease symptoms. In this work the DBIA (Dot Blot Immunoassay) methodology and the PCR was used for detect Xantomonas albilineans; RT-PCR was used for detect SCYLV (Sugar Cane Yellow Leaf Virus). We performed a Radom screening to evaluate the incidence of both pathogens confirming their presence in plants symptomless. Sequencing X. albilineans isolates we found that in Guatemala a minimum of two strains are present. We have compared termoterapy in combination or not with meristem culture for plant sanitation. Whereas meristem culture was more appropriated for rescue plants free of X. albilineans, thermotherapy is sufficient for obtaining virus (SCYLV) free plant. The achievement of pathogen free plants let us to use in vitro culture techniques for conservation and micropropagation. Sanitated plants are maintained in vitro at a temperature of 18ºC. We evaluated several factors that may influence the adventitious regeneration from leaf explants (that may increase multiplication). These factors included genotype, explant position, combinations of growth regulators in the induction medium and auxin type for rooting. A great influence of genotype was manifested as well as the position of the explant and the concentration and type of some growth regulators were also influencing both the percentages of induction and subsequent development of the plants. In the best combination 32 plants per explant were regenerated. The protocols developed in this work are of interest to increase multiplication rates of sanitized materials and are a good base to use them in the future sugarcane improvement through genetic transformation. / [ES] El objetivo principal de este trabajo se centra en el aprovechamiento de técnicas biotecnológicas para el desarrollo de nuevas variedades de caña de azúcar en Guatemala que contribuyan a aumentar la productividad incrementando la variabilidad genética que no es elevada en este cultivo. Para ello se ha evaluado la diversidad genética en una población de 204 variedades de uso potencial como parentales, utilizando tres marcadores moleculares, CV29, CV37 y CV38 que mostraron un contenido de información polimórfica (PIC) medio de 0,37 lo cual indica que fueron capaces de identificar polimorfismos en la población. Tras calcular la similitud genética entre las variedades y en base a ella, se organizaron en 20 grupos. Por otra parte se utilizó el marcador Bru1 asociado a la resistencia de una enfermedad de origen fúngico conocida como Roya Marrón para analizar 303 variedades (incluidas las 204 anteriores), 77 de las cuales amplificaron el marcador. La comparación con datos fenotípicos registrados durante 4 años en dos localidades confirmó que estas 77 variedades eran resistentes. Sin embargo, de las variedades que no amplificaron el alelo de resistencia, solo un 7 % se mostraron susceptibles, lo que indica la posible presencia en estas variedades de otro alelo de resistencia distinto. Con la información anterior se diseñaron y realizaron 22 cruzas cuyas descendencias F1 fueron evaluadas durante dos años consecutivos registrando el promedio de cada familia para características como brix (%), altura de planta, diámetro de tallo, número de tallos por metro e incidencia de las principales enfermedades. Se obtuvieron 18 familias con brix igual o superior a la variedad control CP72-2086, lo que indica que podrían superar su rendimiento de azúcar como consecuencia del mayor contenido de azúcar en sus tallos, aunque no la superen en rendimiento de caña. De estos ensayos se han seleccionado cruzas en las que se ha obtenido tolerancia para distintas enfermedades y un buen brix (%) superior a la variedad control. En este trabajo también se ha comparado la metodología DBIA (Dot Blot Immunoassay) y PCR para diagnosticar la presencia de Xantomonas albilineans y la amplificación de cDNA del RNA vírico para determinar la presencia del virus de la hoja amarilla (SCYLV). Se ha llevado a cabo un muestreo aleatorio para detectar la incidencia de estos patógenos detectando plantas infectadas que no mostraban ninguna sintomatología y, tras la secuenciación de muestras de X. albilineans, se ha confirmado la presencia en Guatemala de al menos dos variantes. También se ha comparado distintos tratamientos térmicos combinados o no con cultivo de meristemos para el saneamiento de plantas infectadas siendo el cultivo de meristemos más adecuado para materiales infectados con la bacteria y la termoterapia suficiente para la obtención de plantas libres de SCYLV. Por último, la obtención de materiales saneados, nos condujo a plantear su conservación y micropropagación utilizando técnicas de cultivo in vitro. Las plantas saneadas y comprobadas como libres de virus se mantienen in vitro a una temperatura de 18oC. Se han evaluado también distintos factores que pueden influir en la regeneración adventicia a partir de explantes de hoja, entre ellos, el genotipo, posición del explante, combinaciones de reguladores de crecimiento en el medio de inducción y tipo de auxina para el enraizamiento de las plantas. Se ha visto un claro efecto del genotipo, de la posición del explante y de la concentración y tipo de algunos reguladores de crecimiento tanto en los porcentajes de inducción como en el posterior desarrollo de las plantas. Se han obtenido en las mejores combinaciones hasta 32 plantas por explante. Los protocolos desarrollados son de gran interés para incrementar las tasas de multiplicación del material saneado o utilizarlos en un futuro para la mejora biotecnológica de la caña mediante transformación genética. / [CAT] L'objectiu principal d'aquest treball es centra a l'aprofitament d' la biotecnología per al desenvolupament de noves varietats de canya més productives i a l'hora amb més variabilitat genética que és escasa en aquest cultiu. En primer lloc, s'ha avaluat la diversitat genètica en una població de 204 varietats de potencial us com a parentals. S'han utilitzat tres marcadores moleculars, CV29, CV37 i CV38 que mostraren un contingut d'informació polimòrfica (PIC) de 0,37 en promedi, la cual cosa indica que es varen identificar polimorfismes a la población en estudi. Es va calcular la similitud genètica entre les varietats i en base a ella, s'obingueren 20 agrupaments. D'un altra banda va utilitzar-se el marcador Bru1 associat a la resistència d'una enfermetat d'origen fúngic coneguda com Roya Marró per a genotipar 303 varietats (que incloïen les 204 d'avans) i, en 77, es va amplificar el esmentat marcador. La comparació amb dades fenotípiques registrades durant 4 anys en dues localitats va confirmar que les 77 varietats eren resistents però no totes aquelles que en les que no s'havia observat amplificació eren susceptibles, de fet, tan sols un 7 % ho eren. Aquest resultat és indicatiu de la possible presencia d'un altre alel de resistència diferent a Bru1. Amb la informació obtesa es disenyaren i realitzaren 22 creuaments i les descendencies F1 es van analitzar en dues anualitats registrant dades relacionades amb el rendiment en sucre: brix (%), altura de planta, diàmetre de la tija, nombre de tiges per metre i l'incidencia de las principals enfermetats que afecten a aquest cultiu. S'obtingueren 18 families amb brix equivalent o superior a la varietat control CP72-2086, que podrien superar el rendiment en sucre, encara que no la superen en rendiment en canya. En aquest treball s'han sel.leccionat creuaments que han mostrat tolerancia a diferents enfermetats i un bon brix (%) superior a la varietat control. Un altre problema comú al cultiu de la canya és la propagació vegetativa a partir de plantes infectades amb patògens que s'hi troben en estat de latencia. En aquest treball s'ha comparat la DBIA (Dot Blot Immunoassay) i la PCR per a diagnosticar la presència de Xantomonas albilineans i s'ha utilitzat l'amplificació de cDNA del RNA víric per determinar la presencia del virus de la fulla groga (SCYLV). S'ha fet un anàlisi aleatori en diferents zones de cultiu per a determinar la incidencia d'aquestos patògens detectant-se plantes infectades que no mostraven síntomes. La sequenciació de mostres de X. albilineans, ha confirmat també la presència a Guatemala de al menys dues variants del bacteri. També s'han comparat diferents tractaments tèrmics en combinació o no de cultiu de meristems per obtenir plantes sanejades sent el cultiu de meristems més adecuat en el cas del bacteri i la termoterapia suficient per a la virosi. L'obtenció de materials sanejats ens va portar a plantejar la seua conservació en cultiu in vitro. Les plantes sanejades es mantenen a una temperatura de 18oC. També en aquest contexte, s'han avaluat diferents factors que poden influenciar amb la regeneració adventicia a partir de segments de fulla, entre ells: el genotip, la posició de l'explant a la planta, les combinacions de reguladors de creixement, i el tipus d'auxina per enrailar les plantes. S'ha vist un marcat efecte del genotip, de la posició de l'explant i de la contcentració d'alguns reguladors de creixement tant en els porcentajes d'inducció com en el posterior desenvolupament de les plantes. S' ha obtés en la millor combinació fins a 32 plantes per explant. Els protocols de regeneració adventicia que s'han desenvolupat són de gran interés per a incrementar la multiplicació del material sanejat aixi com per a utilitzarlos en un futur per a la millora biotecnològica de la canya mitjançant la transformació genètica. / Molina Monterroso, LG. (2016). Desarrollo y aplicación de técnicas biotecnológicas para la caracterización, selección y mejoramiento genético de la caña de azúcar en Guatemala [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63252 / TESIS

Many modern tomato cultivars, in general, do not satisfy the organoleptic expectations of the consumers, as among the selection criteria used, the organoleptic quality has not been prioritized. However, the growing disappointment of consumers with this aspect has placed organoleptic quality as an important breeding objective. The present thesis aims to contribute to fulfil this objective, using the natural variability present in the genus Solanum section Lycopersicon to increase the content in compounds involved in the perception by the taste. Initially, a capillary zone electrophoresis method has been optimized, allowing the simultaneous quantification of organic acids such as oxalic, malic and citric acids and sugars such as glucose, fructose and sucrose, which determine, to a greater extent, the taste perception in tomatoes, with limits Of detection below 2 and 25 ¿g ml -1 respectively. Its high automation and reproducibility, as well as its simple sample preparation, running time of less than 20 minutes and a low execution cost, have enables its use in the evaluation of organoleptic quality in tomato germplasm. Next, accessions and non-bred varieties of cultivated tomato of different origins, as well as wild and wild-related entries (Solanum lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. habrochaites, S. pennellii and S. peruvianum) have been evaluated in order to detect sources of variability potentially useful in breeding programs. Among the materials evaluated there is great variability and very high contents in compounds responsible for tomato taste. Accessions from the Lycopersicon group have been identified, which include the phylogenetically closest wild species to the crop, which nearly triple the contents of sugars and malic acid and double that of citric acid of the commercial varieties taken as control. These accessions will facilitate breeding programs targeted to balanced increases of taste. Although more phylogenetically distant, two accessions of S. habrochaites, from the Eriopersicon group, with malic and citric acid contents seven and nine times greater than the best of controls have been identified, which may be useful when looking for materials with shades of acidic taste. Finally, since the environment can influence directly or through the interaction of genotype x environment the accumulation of these compounds, a multi-environment study has been developed as a tool to evaluate the real genetic potential of various accessions for the improvement of taste tomato. In this study, we have evaluated clonal replicates in three different environments to more accurately estimate the contribution of the environment, genotype and genotype x environment interaction. The effect of the environment has been estimated from the contribution to the accumulation of these compounds of the photosynthetically active radiation and the temperature, observing that the radiation affects to a greater degree the content in sugars and the temperature to the accumulation of acids. With the predictions of genotypic contribution and genotype x environment interaction, two accessions have been identified, one of S. habrocahites and another of S. pimipinellifolium, which may be interesting as sources of variability to increase taste with acid hue for its high Content of malic and citric acids and their stability. The identification of materials with different accumulation profiles of citric, malic and glutamic acids will also be useful in the study of the regulation of the cycles of tricarboxylic acids and GABA shunt. On the other hand, it has been concluded that in order to take advantage of the intra-population variation it will be necessary to evaluate a large number of plants. / Muchos cultivares modernos de tomate, en general, no satisfacen las expectativas organolépticas de los consumidores, ya que entre los criterios de selección no se ha priorizado la calidad organoléptica. Sin embargo, la creciente decepción de los consumidores con este aspecto ha situado la calidad organoléptica como un importante objetivo de mejora. La presente tesis pretende contribuir al abordaje de este objetivo desde el punto de vista del aprovechamiento de la variabilidad natural presente en el género Solanum sección Lycopersicon para aumentar el contenido en compuestos implicados en la percepción por el gusto. Inicialmente se ha puesto a punto método de electroforesis capilar zonal desarrollado permite cuantificar de forma simultánea ácidos orgánicos como el oxálico, málico y cítrico y azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa que determinan, en mayor medida, la percepción del gusto en tomate con límites de detección inferiores a 2 y 25 ¿g ml-1 respectivamente. Su elevada automatización y reproducibilidad, así como su escasa preparación de muestra, tiempo de carrera inferior a 20 minutos y reducido coste de ejecución, han permitido aplicarlo de forma generalizada en ensayos de evaluación de características de calidad organoléptica en germoplasma de tomate. A continuación, se han evaluado entradas y variedades no mejoradas de tomate cultivado de diferentes orígenes, así como entradas silvestres y de especies silvestres relacionadas (Solanum lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. habrochaites, S. pennellii y S. peruvianum) para detectar fuentes de variabilidad potencialmente útiles en la mejora. Entre los materiales recolectados existe gran variabilidad y contenidos muy elevados en compuestos responsables del gusto en tomate. Se han identificado entradas del grupo Lycopersicon, que incluye las especies silvestres filogenéticamente más próximas a la cultivada, que casi triplican los contenidos en azúcares y ácido málico y duplican el de ácido cítrico de las variedades comerciales tomadas como control, lo que facilitará su uso en planes de mejora de la calidad organoléptica que busquen incrementos equilibrados del gusto. Aunque más alejadas filogenéticamente, se han identificado dos entradas de S. habrochaites, del grupo Eriopersicon, con contenidos en ácido málico y cítrico siete y nueve veces mayores que el mejor de los controles, que pueden ser útiles cuando se busque obtener materiales con matices de sabor más ácido. Finalmente, dado que el ambiente puede influir directamente o a través de la interacción del genotipo x ambiente en la acumulación de estos compuestos, se ha desarrollado un estudio multi-ambiente como herramienta de evaluación del potencial genético real de diversas entradas para la mejora del gusto de tomate. En este estudio, se han evaluado réplicas clonales en tres ambientes diferentes para estimar con mayor precisión la contribución del ambiente, el genotipo y la interacción genotipo x ambiente. El efecto del ambiente se ha estimado a partir de la contribución a la acumulación de estos compuestos de la radiación fotosintéticamente activa y la temperatura, observándose que la radiación afecta en mayor grado al contenido en azúcares y la temperatura a la acumulación de ácidos. A partir de las predicciones de contribución genotípica y de interacción genotipo x ambiente se han identificado dos entradas, una de S. habrocahites y otra de S. pimipinellifolium, que pueden ser interesantes como fuentes de variabilidad para incrementar el gusto con matiz ácido por su elevado contenido en ácidos málico y cítrico y por su estabilidad. La identificación de materiales con distinto perfil de acumulación de los ácidos cítrico, málico y glutámico será también útil en el estudio de la regulación de los ciclos de los ácidos tricarboxílicos y del GABA shunt. Por otro lado, se ha puesto de manifiesto la necesidad de evaluar un número el / Molts cultivars comercials de tomata, en general, no satisfan les expectatives organolèptiques dels consumidors, ja que entre els criteris de selecció no s'ha prioritzat la qualitat organolèptica. No obstant això, la creixent decepció dels consumidors ha situat la qualitat organolèptica com un important objectiu de millora. La present tesi pretén contribuir a l'abordatge d'aquest objectiu des del punt de vista de l'aprofitament de la variabilitat natural present en el gènere Solanum secció Lycopersicon per augmentar el contingut en compostos implicats en la percepció pel gust. Inicialment s'ha posat a punt un mètode d'electroforesi capil·lar zonal que permet quantificar de forma simultània àcids orgànics com l'oxàlic, màlic i cítric i sucres com la glucosa, fructosa i sacarosa que determinen, en major mesura, la percepció del gust en tomata amb límits de detecció inferiors a 2 i 25 mg ml-1 respectivament. La seua elevada automatització i reproductibilitat, així com la seua escassa preparació de mostra, temps de carrera inferior a 20 minuts i reduït cost d'execució, han permès aplicar-lo de forma generalitzada en assajos d'avaluació de característiques de qualitat organolèptica en germoplasma de tomata. A continuació, s'han avaluat entrades i varietats no millorades de tomata cultivada de diferents orígens, així com entrades silvestres i d'espècies silvestres relacionades (Solanum lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. habrochaites, S. pennellii i S. peruvianum) per detectar fonts de variabilitat potencialment útils en la millora. Entre els materials avaluats existix gran variabilitat i continguts molt elevats en compostos responsables del gust en tomata. S'han identificat entrades del grup Lycopersicon, que inclou les espècies silvestres filogenèticament més properes a la conreada, que gairebé tripliquen els continguts en sucres i àcid màlic i dupliquen el d'àcid cítric de les varietats comercials preses com a control, el que facilitarà el seu ús en plans de millora de la qualitat organolèptica que busquen increments equilibrats del gust. Encara que més allunyades filogenèticament, s'han identificat dos entrades de S. habrochaites, del grup Eriopersicon, amb continguts d'àcid màlic i cítric set i nou vegades més grans que el millor dels controls, que poden ser útils quan es busque obtindre materials amb matisos de sabor més àcid. Finalment, atès que l'ambient pot influir directament o a través de la interacció del genotip x ambient en l'acumulació d'aquests compostos, s'ha desenvolupat un estudi multi-ambient com a eina d'avaluació del potencial genètic real de diverses entrades per la millora del gust de la tomata. En aquest estudi, s'han avaluat rèpliques clonals en tres ambients diferents per estimar amb més precisió la contribució de l'ambient, el genotip i la interacció genotip x ambient. L'efecte de l'ambient s'ha estimat a partir de la contribució a l'acumulació d'aquests compostos de la radiació fotosintèticament activa i la temperatura, observant-se que la radiació afecta en major grau al contingut en sucres i la temperatura a l'acumulació d'àcids. A partir de les prediccions de contribució genotípica i d'interacció genotip x ambient s'han identificat dues entrades, una de S. habrocahites i una altra de S. pimipinellifolium, que poden ser interessants com a fonts de variabilitat per incrementar el gust amb matís àcid pel seu elevat contingut en àcids màlic i cítric i per la seua estabilitat. La identificació de materials amb diferent perfil d'acumulació dels àcids cítric, màlic i glutàmic serà també útil en l'estudi de la regulació dels cicles dels àcids tricarboxílics i del GABA shunt. D'altra banda, s'ha posat de manifest la necessitat d'avaluar un nombre elevat de plantes per aprofitar correctament la variació intra-poblacional. / Galiana Balaguer, L. (2017). Aprovechamiento de la diversidad en Solanum L. sección Lycopersicon para la mejora genética de la calidad organoléptica en tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86205 / TESIS

[ES] Uno de los principales objetivos de los programas de mejora genética de mandarinos es generar nuevas variedades que no produzcan semillas ni induzcan la formación de semillas en otras variedades por polinización cruzada, como es el caso de los híbridos triploides. La manipulación del nivel de ploidía es una estrategia fundamental para la obtención de híbridos triploides de mandarino sin semillas, que se pueden obtener a partir de hibridaciones entre dos genotipos diploides, como consecuencia de la formación de gametos no reducidos diploides, o mediante hibridaciones entre parentales diploides y tetraploides. En cítricos, la citometría de flujo se ha empleado para determinar el tamaño del genoma y para determinar el nivel de ploidía de plantas regeneradas mediante técnicas de cultivo in vitro e hibridaciones sexuales. Sin embargo, no se ha aplicado hasta el momento para el análisis del nivel de ploidía de granos de polen maduros de genotipos diploides y euploides, debido a la inexistencia de una metodología apropiada de extracción de núcleos. Por otro lado, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) es una metodología que permite, a partir de poblaciones o subpoblaciones de núcleos de granos de polen, su aislamiento y clasificación según su nivel de ploidía para su posterior análisis genético con marcadores moleculares. No obstante, los análisis genéticos con marcadores moleculares se encuentran limitados por la escasa cantidad de ADN que poseen los núcleos individualizados. Una opción para solventar este problema es el uso de kits de Whole Genome Amplification (WGA) que permiten generar mayor cantidad de ADN a partir del contenido de un solo núcleo. La utilización conjunta de estas dos metodologías nunca se ha aplicado en cítricos y su implementación permitiría generar nuevo conocimiento sobre su biología reproductiva y su aplicación en los programas de mejora genética. Las hibridaciones sexuales 2x X 4x y 4x X 2x son dos estrategias que permiten obtener elevadas poblaciones de híbridos triploides. Las estructuras genéticas de estos híbridos dependen en gran medida de los modelos de segregación cromosómica de los parentales tetraploides, ya que influyen en la transmisión de heterocigosidad parental al gameto diploide. Existen dos modelos extremos de segregación de plantas tetraploides, disómico y tetrasómico, aunque también se han descrito modelos de segregación intermedia. En este sentido, es clave realizar estudios con marcadores moleculares que permitan determinar los modelos de segregación de los parentales tetraploides utilizados en los programas de mejora genética de mandarino para optimizar y seleccionar las estrategias más eficientes para la obtención de híbridos triploides con determinadas características. En esta tesis, se ha utilizado por primera vez la citometría de flujo para determinar el nivel de ploidía de poblaciones de granos de polen de diferentes especies diploides, triploides y tetraploides de cítricos, demostrando que los granos de polen maduros son binucleados. Los granos de polen de genotipos diploides mostraron dos picos perfectamente definidos con diferentes intensidades de fluorescencia, correspondiendo el primer pico a la población de núcleos vegetativos y el segundo, a los núcleos generativos. Únicamente se han identificado dos excepciones con picos adicionales en sus histogramas; el tangor `CSO´ y la lima `Mexicana´. El tangor `CSO´ mostró un pico adicional de fluorescencia equivalente a la suma de los valores fluorescencia de los núcleos vegetativos y generativos, lo que sugiere que los núcleos permanecen unidos después de su aislamiento de los granos de polen mediante el método de ruptura y aislamiento; y corroborado posteriormente mediante marcadores moleculares, ya que las tres poblaciones de núcleos presentan el mismo origen genético. Sin embargo, en la lima `Mexicana´ se han identificado por primera vez en cítricos gametos no reducidos de polen mediante citometría de flujo. Las poblaciones de granos de polen de genotipos triploides no evidenciaron picos claros y definidos en los histogramas obtenidos-, mientras que los genotipos tetraploides revelaron dos poblaciones de núcleos, una de núcleos vegetativos y la otra de núcleos generativos, con el doble de intensidad de fluorescencia que sus núcleos homólogos en los genotipos diploides. Una vez puesta punto una metodología para determinar el nivel de ploidía de los núcleos de granos de polen, utilizando la técnica FACS, se aislaron individualmente los núcleos de las poblaciones identificadas con el objetivo de analizar el origen y la estructura genética de los núcleos de los granos de polen de genotipos diploides y tetraploides e identificar los mecanismos implicados en la formación de gametos no reducidos de lima `Mexicana´, mediante la amplificación del genoma de cada núcleo utilizando un kit de WGA y su posterior análisis con marcadores moleculares de tipo Simple Sequence Repeat (SSR) y Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Inicialmente se aislaron núcleos de las tres poblaciones identificadas en el histograma del tangor `CSO´ y se demostró la presencia de un solo alelo, confirmando que corresponden a núcleos de granos de polen reducidos (normales). Estos resultados son de gran importancia para una correcta interpretación de los histogramas, lo que nos permite afirmar que la presencia de un segundo (o tercer) pico en las poblaciones de granos de polen no corresponde con la presencia de granos de polen no reducidos. El uso combinado de FACS y WGA se mostró como una metodología válida y adecuada para la individualización y amplificación genómica de núcleos haploides de granos de polen de genotipos diploides, permitiendo su posterior genotipado con marcadores SSR y SNP. Posteriormente, esta metodología se utilizó tentativamente para identificar el mecanismo implicado en la formación de gametos no reducidos de polen de lima `Mexicana´ y para estudiar el modo de segregación cromosómica de las plantas tetraploides. Para ello, y como control, se aislaron y amplificaron núcleos de hojas de genotipos diploides que se analizaron con diferentes marcadores heterocigotos. Los resultados obtenidos a partir de los núcleos diploides de hoja evidenciaron una amplificación desbalanceada hacia uno de los dos alelos y por lo tanto no amplificando los alelos correspondientes en la proporción esperada (1:1). Estos resultados indican que esta metodología no es adecuada para la realización de estudios genéticos con núcleos no haploides. Con la puesta a punto de la metodología combinada para individualizar y amplificar núcleos haploides para su posterior análisis con múltiples marcadores moleculares, se estudiaron por primera vez eventos de recombinación y distorsiones de la segregación (SD) en núcleos de granos de polen haploides. El análisis de los eventos de recombinación se realizó en el cromosoma 1 del limón `Eureka´, revelando la presencia de hasta cinco eventos en un brazo y cuatro en el otro brazo, con un promedio 1,97 puntos de recombinación por gameto. Asimismo, cinco muestras mostraron ausencia de eventos de recombinación para los marcadores moleculares utilizados. La SD se analizó en una población de núcleos de granos de polen individualizados del tangor `CSO´ y una población de plantas (`RTSO´) que se obtuvo a partir del cruzamiento entre el tangor `RTO´ como parental femenino y el tangor `CSO´ como parental masculino. La SD obtenida en los núcleos de granos de polen del tangor `CSO´ fue ligeramente menor (13.8%) respecto a la observada en la población de plantas `RTSO´ (20.7%). Ambas poblaciones mostraron SD sincronizada en el grupo de ligamiento (GL) 2, mientras que el GL 7 solo mostró una SD en la población de plantas `RTSO´. Se distinguieron mecanismos de selección gametofítica masculina en la población de núcleos de granos de polen, mientras que en la población de plantas se observaron mecanismos de selección gametofítica y/o selección zigótica. Estos resultados demuestran que esta metodología es eficiente para realizar estudios genéticos con un gran número de marcadores moleculares sin la necesidad de generar poblaciones. Además, podría permitir la realización de proyectos de secuenciación en especies altamente heterocigóticas como los cítricos evitando la obtención de haplotipos a través de técnicas de cultivo in vitro. La obtención de dos poblaciones de híbridos triploides generadas con el mandarino `Moncada´ tetraploide en hibridaciones 2x x 4x y 4x x 2x nos ha permitido estudiar los modelos de segregación cromosómica a nivel masculino y femenino de un mismo genotipo. Como parental femenino, presentó un modelo de segregación tetrasómica completa en siete de los nueve GLs (GL1, GL2, GL3, GL5, GL6, GL7, y GL9). Sin embargo, en el GL8 se observó un modelo de herencia intermedia con tendencia hacia la tetrasomía, mientras que el GL4 mostró una clara herencia intermedia. Como parental masculino, siete de los GL se ajustaron a un modelo de segregación tetrasómica, excepto en los GL 5 y 6 que presentaron modelos de segregación intermedios. Estas variaciones en el modo de segregación a nivel de GL según la dirección de las hibridaciones tienen importantes implicaciones en los programas de mejora genética. Dependiendo en qué GL se encuentre un gen que controle un carácter de interés, la regulación genética del carácter y la dirección del cruzamiento, la segregación obtenida en la descendencia será diferente. Además, el mandarino `Moncada´ 4x presentó valores significativos de DR. Como parental femenino se observaron valores significativos en cinco GLs (GL2, GL3, GL4, GL7 y GL9) y como parental masculino en seis GLs (GL2, GL3, GL4, GL5 GL6 y GL7). La producción de valores más elevados de homocigosidad podría ser útil para los programas de mejora genética de mandarino dirigidos a la obtención de híbridos triploides debido al potencial efecto de “limpieza” que puede tener la DR al revelar alelos nocivos o deletéreos para la selección y aumentar las configuraciones alélicas raras pero favorables que pueden detectarse mediante marcadores moleculares. El conocimiento generado en esta tesis doctoral a sobre el análisis del nivel de ploidía e individualización de núcleos de granos de polen de genotipos diploides, triploides y tetraploides de cítricos mediante FACS y posterior amplificación genómica para su genotipado con marcadores SSR y SNP, así como el conocimiento de los modelos de segregación cromosómica del mandarino `Moncada´ 4x permitirá un desarrollo más eficiente de los programas de mejora genética de cítricos con el objetivo de obtener nuevas variedades de elite sin semillas para el mercado de consumo en fresco. De hecho, los resultados obtenidos se están aplicando actualmente, y suponen un punto de partida para realizar nuevos trabajos de investigación. / [CA] Un dels principals objectius dels programes de millora genètica de mandariners és generar noves varietats que no produïsquen llavors ni induïsquen la formació de llavors en altres varietats per pol·linització creuada, com és el cas dels híbrids triploides. La manipulació del nivell de ploidía és una estratègia fonamental per a l'obtenció d'híbrids triploides de mandariner sense llavors, que es poden obtindre a partir d'hibridacions entre dos genotips diploides, com a conseqüència de la formació de gàmetes no reduïts diploides, o mitjançant hibridacions entre parentals diploides i tetraploides. En cítrics, la citometria de flux s'ha emprat per a determinar la grandària del genoma i per a determinar el nivell de ploidía de plantes regenerades mitjançant tècniques de cultiu in vitro e hibridacions sexuals. No obstant això, no s'ha aplicat fins al moment per a l'anàlisi del nivell de ploidía de grans de pol·len madurs de genotips diploides i euploides, a causa de la inexistència d'una metodologia apropiada d'extracció de nuclis. D'altra banda, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) és una metodologia que permet, a partir de poblacions o subpoblacions de nuclis de grans de pol·len, el seu aïllament i classificació segons el seu nivell de ploidía per a la seua posterior anàlisi genètica amb marcadors moleculars. No obstant això, les anàlisis genètiques amb marcadors moleculars es troben limitats per l'escassa quantitat d'ADN que posseeixen els nuclis individualitzats. Una opció per a solucionar aquest problema és l'ús de kits de Whole Genome Amplification (WGA) que permeten generar major quantitat d'ADN a partir del contingut d'un sol nucli. La utilització conjunta d'aquestes dues metodologies mai s'ha aplicat en cítrics i la seua implementació permetria generar nou coneixement sobre la seua biologia reproductiva i la seua aplicació en els programes de millora genètica. Les hibridacions sexuals 2x X 4x i 4x X 2x són dues estratègies que permeten obtindre elevades poblacions d'híbrids triploides. Les estructures genètiques d'aquests híbrids depenen en gran manera dels models de segregació cromosòmica dels parentals tetraploides, ja que influeixen en la transmissió de l´heterocigositat parental al gàmeta diploide. Existeixen dos models extrems de segregació de plantes tetraploides, disómic i tetrasómic, encara que també s'han descrit models de segregació intermèdia. En aquest sentit, és clau realitzar estudis amb marcadors moleculars que permeten determinar els models de segregació dels parentals tetraploides utilitzats en els programes de millora genètica de mandariner per a optimitzar i seleccionar les estratègies més eficients per a l'obtenció d'híbrids triploides amb determinades característiques. En aquesta tesi, s'ha utilitzat per primera vegada la citometria de flux per a determinar el nivell de ploidía de poblacions de grans de pol·len de diferents espècies diploides, triploides i tetraploides de cítrics, demostrant que els grans de pol·len madurs són binucleat. Els grans de pol·len de genotips diploides van mostrar dos pics perfectament definits amb diferents intensitats de fluorescència, corresponent el primer pic a la població de nuclis vegetatius i el segon, als nuclis generatius. Únicament s'han identificat dues excepcions amb pics addicionals en els seus histogrames; el tangor `CSO´ i la llima `Mexicana´. El tangor `CSO´ va mostrar un pic addicional de fluorescència equivalent a la suma dels valors de fluorescència dels nuclis vegetatius i generatius, la qual cosa suggereix que els nuclis romanen units després del seu aïllament dels grans de pol·len mitjançant el mètode de ruptura i aïllament; i corroborat posteriorment mitjançant marcadors moleculars, ja que les tres poblacions de nuclis presenten el mateix origen genètic. No obstant això, en la llima `Mexicana´ s'han identificat per primera vegada en cítrics gàmetes no reduïts de pol·len mitjançant citometria de flux. Les poblacions de grans de pol·len de genotips triploides no van evidenciar pics clars i definits en els histogrames obtinguts, mentre que els genotips tetraploides van revelar dues poblacions de nuclis, una de nuclis vegetatius i l'altra de nuclis generatius, amb el doble d'intensitat de fluorescència que els seus nuclis homòlegs en els genotips diploides. Una vegada posada punt una metodologia per a determinar el nivell de ploidía dels nuclis de grans de pol·len, utilitzant la tècnica FACS, es van aïllar individualment els nuclis de les poblacions identificades amb l'objectiu d'analitzar l'origen i l'estructura genètica dels nuclis dels grans de pol·len de genotips diploides i tetraploides i identificar els mecanismes implicats en la formació de gàmetes no reduïts de llima `Mexicana´, mitjançant l'amplificació del genoma de cada nucli utilitzant un kit de WGA i la seua posterior anàlisi amb marcadors moleculars de tipus Simple Sequence Repeat (SSR) i Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Inicialment es van aïllar nuclis de les tres poblacions identificades en l'histograma del tangor `CSO´ i es va demostrar la presència d'un sol al·lel, confirmant que corresponen a nuclis de grans de pol·len reduïts (normals). Aquests resultats són de gran importància per a una correcta interpretació dels histogrames, la qual cosa ens permet afirmar que la presència d'un segon (o tercer) pic en les poblacions de grans de pol·len no correspon amb la presència de grans de pol·len no reduïts. L'ús combinat de FACS i WGA es va mostrar com una metodologia vàlida i adequada per a la individualització i amplificació genòmica de nuclis haploides de grans de pol·len de genotips diploides, permetent el seu posterior genotipat amb marcadors SSR i SNP. Posteriorment, aquesta metodologia es va utilitzar temptativament per a identificar el mecanisme implicat en la formació de gàmetes no reduïts de pol·len de llima `Mexicana´ i per a estudiar la manera de segregació cromosòmica de les plantes tetraploides. Per a això, i com a control, es van aïllar i van amplificar nuclis de fulles de genotips diploides que es van analitzar amb diferents marcadors heterozigots. Els resultats obtinguts a partir dels nuclis diploides de fulla van evidenciar una amplificació desbalanceada cap a un dels dos al·lels i per tant no amplificant els al·lels corresponents en la proporció esperada (1:1). Aquests resultats indiquen que aquesta metodologia no és adequada per a la realització d'estudis genètics amb nuclis no haploides. Amb la posada a punt de la metodologia combinada per a individualitzar i amplificar nuclis haploides per a la seua posterior anàlisi amb múltiples marcadors moleculars, es van estudiar per primera vegada esdeveniments de recombinació i distorsions de la segregació (SD) en nuclis de grans de pol·len haploides. L'anàlisi dels esdeveniments de recombinació es va realitzar en el cromosoma 1 de la llima `Eureka´, revelant la presència de fins a cinc esdeveniments en un braç i quatre en l'altre braç, amb una mitjana 1,97 punts de recombinació per gàmeta. Així mateix, cinc mostres van mostrar absència d'esdeveniments de recombinació per als marcadors moleculars utilitzats. L'SD es va analitzar en una població de nuclis de grans de pol·len individualitzats del tangor `CSO´ i una població de plantes (`RTSO´) que es va obtindre a partir del creuament entre el tangor `RTO´ com a parental femení i el tangor `CSO´ com a parental masculí. L'SD obtinguda en els nuclis de grans de pol·len del tangor `CSO´ va ser lleugerament menor (13.8%) respecte a l'observada en la població de plantes `RTSO´ (20.7%). Totes dues poblacions van mostrar SD sincronitzada en el grup de lligament (GL) 2, mentre que el GL 7 només va mostrar una SD en la població de plantes `RTSO´. Es van distingir mecanismes de selecció gametofítica masculina en la població de nuclis de grans de pol·len, mentre que en la població de plantes es van observar mecanismes de selecció gametofítica i/o selecció zigótica. Aquests resultats demostren que aquesta metodologia és eficient per a realitzar estudis genètics amb un gran nombre de marcadors moleculars sense la necessitat de generar poblacions. A més, podria permetre la realització de projectes de seqüenciació en espècies altament heterocigóticas com els cítrics evitant l'obtenció de haplotipos a través de tècniques de cultiu in vitro. L'obtenció de dues poblacions d'híbrids triploides generades amb el mandariner `Moncada´ tetraploide en hibridacions 2x X 4x i 4x X 2x ens ha permés estudiar els models de segregació cromosòmica a nivell masculí i femení d'un mateix genotip. Com a parental femení, va presentar un model de segregació tetrasómica completa en set dels nou GLs (GL1, GL2, GL3, GL5, GL6, GL7, i GL9). No obstant això, en el GL8 es va observar un model d'herència intermèdia amb tendència cap a la tetrasomía, mentre que el GL4 va mostrar una clara herència intermèdia. Com a parental masculí, set dels GL es van ajustar a un model de segregació tetrasómica, excepte en els GL 5 i 6 que van presentar models de segregació intermedis. Aquestes variacions en la manera de segregació a nivell de GL segons la direcció de les hibridacions tenen importants implicacions en els programes de millora genètica. Depenent en quin GL es trobe un gen que controle un caràcter d'interés, la regulació genètica del caràcter i la direcció del creuament, la segregació obtinguda en la descendència serà diferent. A més, el mandariner `Moncada´ 4x va presentar valors significatius de DR. Com a parental femení es van observar valors significatius en cinc GLs (GL2, GL3, GL4, GL7 i GL9) i com a parental masculí en sis GLs (GL2, GL3, GL4, GL5 GL6 i GL7). La producció de valors més elevats de homocigositat podria ser útil per als programes de millora genètica de mandariner dirigits a l'obtenció d'híbrids triploides a causa del potencial efecte de “neteja” que pot tindre la DR en revelar al·lels nocius o deleteris per a la selecció i augmentar les configuracions al·lèliques estranyes però favorables que poden detectar-se mitjançant marcadors moleculars. El coneixement generat en aquesta tesi doctoral sobre l'anàlisi del nivell de ploidía i individualització de nuclis de grans de pol·len de genotips diploides, triploides i tetraploides de cítrics mitjançant FACS i posterior amplificació genòmica per al seu genotipat amb marcadors SSR i SNP, així com el coneixement dels models de segregació cromosòmica del mandariner `Moncada´ 4x permetrà un desenvolupament més eficient dels programes de millora genètica de cítrics amb l'objectiu d'obtindre noves varietats d'elit sense llavors per al mercat de consum en fresc. De fet, els resultats obtinguts s'estan aplicant actualment, i suposen un punt de partida per a realitzar nous treballs de recerca. / [EN] One of the main objectives of mandarin breeding programs is to generate new varieties that neither produce seeds nor induce seed formation in other varieties by crossed pollination, as with triploid hybrids. Ploidy manipulation is a fundamental strategy to obtain mandarin triploid hybrids without seeds, which can be achieved by hybridisations between two diploid genotypes as a result of non-reduced diploid gamete formation, or between diploid and tetraploid parentals. In citrus, flow cytometry has been employed to determine not only genome size, but also the ploidy level of regenerated plants by in vitro culture techniques and sexual hybridisations. Nevertheless, flow cytometry has not yet been applied to analyse the ploidy level of mature pollen grains of diploid and euploid genotypes because no suitable nuclei extraction methodology exists. Moreover, the Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) methodology isolates and classifies populations or pollen grain nuclei subpopulations according to their ploidy level to then submit them to genetic analyses with molecular markers. Nonetheless, genetic analyses with molecular markers are limited due to the small amount of DNA that individual nuclei possess. One option to overcome this problem is to use Whole Genome Amplification (WGA) kits that can obtain more DNA from the content of a single nucleus. The joint use of both these methodologies has never been applied to citrus, and its implementation will generate new knowledge about their reproductive biology and application in genetic improvement programs. 2x X 4x and 4x X 2x sexual hybridisations are two strategies that allow to recover large populations of triploid hybrids. To a great extent, the genetic structures of these hybrids depend on the chromosome segregation models of tetraploid parentals as they influence the parental heterozygosity transmission to diploid gametes. Two extreme tetraploid plant segregation models exist, disomic and tetrasomic, and intermediate segregation models have also been described. Therefore, it is key to conduct studies with molecular markers to determine the segregation models of the tetraploid parents employed in mandarin breeding programs to optimise and select the most efficient strategies to obtain triploid hybrids with certain characteristics. In this thesis, flow cytometry has been used for the first time to determine the ploidy level of pollen grain populations from different diploid, triploid and tetraploid citrus species to demonstrate that mature pollen grains are binucleate. The pollen grains of diploid genotypes show two perfectly defined peaks with different fluorescence intensities: the first peak corresponds to the vegetative nuclei population and the second to generative nuclei. Only two exceptions have been identified with additional peaks in their histograms; `CSO´ tangor and `Mexican´ lime. `CSO´ tangor shows another equivalent fluorescence peak to the sum of the fluorescence values of vegetative and generative nuclei, which suggests that nuclei continue to bind after being isolated from pollen grains via the rupture and isolation method. This was later corroborated by molecular markers because the three nuclei populations are of the same genetic origin. Nonetheless, non-reduced pollen gametes were identified in citrus for the first time in `Mexican´ lime by flow cytometry. The pollen grain populations of triploid genotypes evidenced no clear well-defined peaks in the obtained histograms, whereas two nuclei populations were revealed with tetraploid genotypes, one vegetative nuclei population and another generative nuclei population, with 2-fold higher fluorescence intensity than their homologous nuclei in the diploid genotypes. After setting up the methodology to determine the ploidy level of pollen grain nuclei by FACS, the nuclei of the identified populations were individually isolated to analyse the origin and genetic structure of the pollen grain nuclei of both the diploid and tetraploid genotypes, and to identity the mechanisms involved in non-reduced `Mexican´ lime gamete formation by amplifying the genome of each nucleus with a WGA kit to then be analysed by Simple Sequence Repeat- (SSR) and Single Nucleotide Polymorphism- (SNP) molecular markers. Initially, the nuclei of the three populations identified on the `CSO´ tangor histogram were isolated, and the presence of a single allele was demonstrated, which confirmed that they corresponded to (normal) reduced pollen grain nuclei. These results are most important to correctly interpret histograms and enable us to state that the presence of a second (or third) peak in pollen grain populations does not correspond to the presence of non-reduced pollen grains. The combined use of FACS and WGA is an adequate methodology for the individualisation and whole genome amplification of haploid pollen grain nuclei of diploid genotypes because it allows subsequent genotyping with SSR and SNP markers. Later this methodology was used to tentatively identify the mechanism involved in the formation of non-reduced `Mexican´ lime pollen gametes, and to study the segregation pattern of tetraploid plants. To this end, and as a control, the nuclei of leaves from diploid genotypes were isolated and amplified, which were analysed with different heterozygote markers. The results obtained from diploid leaf nuclei evidenced an unbalanced amplification towards one of the two alleles, thus the corresponding alleles were not amplified in the expected proportion (1:1). These results indicate that this methodology is not suitable for conducting genetic studies with non-haploid nuclei. After setting up the combined methodology to individualise and amplify haploid nuclei to then analyse them with many molecular markers, recombination events and segregation distortions (SDs) were studied for the first time in haploid pollen grain nuclei. The analysis of recombination events was carried out in chromosome 1 of `Eureka´ lemon, which revealed the presence of up to five events on one arm and four on the other, with an average of 1.97 recombination points per gamete. Five samples showed that recombination events were absent for the employed molecular markers. The SD was analysed in a population of pollen grains that were individualised from `CSO´ tangor and a plant population (`RTSO´) obtained by a cross between `RTO´ tangor as female parent and `CSO´ tangor as male parent. The SD obtained from the pollen grain nuclei population of `CSO´ tangor was slightly lower (13.8%) than that observed in the `RTSO´ plant population (20.7%). Both populations showed a synchronised SD in the linkage groups 2 (LG2), whereas LG7 only displayed one SD in the `RTSO´ plant population. Gametophytic selection mechanisms were observed in the pollen grain nuclei population, while gametophytic selection and/or zygotic selection mechanisms were noted in the plant population. These results reveal that this methodology is efficient for conducting genetic studies using a large number of molecular markers without having to recover progenies. It could also allow sequencing projects to be undertaken in highly heterozygotic species like citrus to avoid obtaining haplotypes by in vitro culture techniques. The recovery of two different triploid hybrid populations generated with the tetraploid `Moncada´ mandarin in 2x X 4x and 4x X 2x sexual hybridisations enabled us to study chromosomal segregation models of the same genotype acting as male or female parent. As a female parent, it presented a complete tetrasomic segregation model in seven of the nine GLs (GL1, GL2, GL3, GL5, GL6, GL7 and GL9). However, an intermediate inheritance model was observed in GL8 with a tendency towards tetrasomy, while GL4 displayed clear intermediate inheritance. As a male parent, seven GLs matched a tetrasomic segregation model, save in GL5 and GL6, which presented intermediate segregation models. These variations in GL segregation according to the direction of hybridisations have major implications for genetic breeding programs. Depending on which GL a gene is found in, which controls not only a character of interest, but also the genetic regulation of the character and the direction of the cross, the segregation obtained in the progenies will differ. Moreover, the tetraploid `Moncada´ mandarin displayed important double reduction (DR) values. Significant values were also observed as female parent in five GLs (GL2, GL3, GL4, GL7 and GL9) and in six GLs (GL2, GL3, GL4, GL5 GL6 and GL7) as male parent. The production of higher levels of homozygosity could be useful in triploid mandarin breeding for the potential cleaning effect that DR can have by revealing deleterious alleles to selection. DR also could increase the accumulation of rare but favorable allelic configurations through selection with molecular markers. Knowledge acquired in this doctoral thesis on the ploidy level analysis and individualisation of pollen grain nuclei of diploid, triploid and tetraploid citrus genotypes by FACS, followed by WGA and genotyping with SSR and SNP markers, as well as knowledge about the segregation patterns of tetraploid `Moncada´ mandarin, will allow citrus breeding programs to be more efficiently run with the objective to recover new elite seedless varieties for the fresh-fruit market. In fact, the obtained results are presently being applied and act as a starting point to conduct new research works. / Garavello, MF. (2020). Análisis del nivel de ploidía y estructura genética de gametos de mandarino [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149567 / TESIS

Tesis por compendio / [ES] La mejora de las especies cultivadas es un área dinámica, sujeta a las necesidades y requerimientos de los diferentes cultivos en cada momento y de las exigencias de productores y consumidores. Una limitación en este proceso de mejora es la diversidad genética existente en los cultivos, debido a cuellos de botella poblacionales, que hacen necesario el uso de especies silvestres. El tomate cultivado (Solanum lycopersicum var. lycopersicum, SLL) surgió a partir de Solanum lycopersicum var. cerasiforme (SLC) que a su vez fue pre-domesticada a partir de Solanum pimpinellifolium (SP). Pese al potencial para la mejora de estas especies, su uso está limitado en gran medida por la falta de información de las colecciones mantenidas en los bancos de germoplasma, principalmente en SLC. Para dar solución a este problema, se ha empleado una colección de germoplasma compuesta por 15 accesiones de SLL, procedentes de México; 27 de SP, procedentes de Perú y Ecuador y 121 de SLC, procedentes de Perú, Ecuador, México y Mesoamérica. Esta colección ha sido sometida a una extensa caracterización fenotípica y genética, lo que ha permitido identificar las regiones de genoma asociadas a caracteres fenotípicos mediante estudios de asociación del genoma completo (GWAS). Además, se han creado poblaciones segregantes F2 para cada una de las entradas de la colección a partir de los híbridos obtenidos con tres parentales diferentes, y estos cruces se han puesto a disposición de la comunidad científica. Este recurso permitirá el estudio del control genético de mutantes de interés en mejora. El estudio realizado con los datos morfológicos ha demostrado la presencia de una gradación morfológica continua entre los tres grupos taxonómicos, y ha permitido la identificación de una serie de caracteres que permiten la diferenciación entre grupos y también entre las distintas procedencias geográficas dentro de cada grupo taxonómico. Los diferentes polimorfismos de nucleótido único (SNPs) fueron anotados con base a la predicción de sus efectos en la secuencia codificantes mediante el programa SnpEff y se llevaron a cabo estudios de GWAS. El análisis genético reveló a Perú y Ecuador como las regiones con mayores niveles de diversidad, tanto en la especie SP como en SLC. Se observó una reducción en el número de variantes SNP en SLC México, que concuerda con la hipótesis de que Mesoamérica sea centro de domesticación y difusión del tomate cultivado. Por último, se constató el proceso de domesticación como la causa de la menor diversidad presente en la especie cultivada. Los estudios GWAS permitieron la identificación de correlaciones genotipo-fenotipo, revelando la asociación entre 107 SNPs y ocho caracteres cuantitativos y un total de 30 SNPs asociados a 7 caracteres cualitativos. Una parte de los SNPs detectados fueron localizados cerca de regiones genómicas ya asociadas con genes y QTLs, otra parte se localizaron en regiones con posibles genes candidatos anotados y el resto de SNPs detectados se corresponden a regiones no descritas previamente, lo que abre el camino a estudios para la detección de nuevos genes candidatos. En esta tesis se muestra la utilidad de la colección de familias segregantes mediante su uso en el estudio del control genético de la presencia y alta densidad de tricomas tipo IV en dos fondos genéticos diferentes, SLL x SP y SP x SLC. En ambos fondos se han detectado dos QTLs principales en los cromosomas 9 y 11. Además, se han detectado señales en los cromosomas 2, 5, 6, 7 y 8, en función de la familia segregante estudiada. Las regiones detectadas en los cromosomas 9 y 11 habían sido previamente descritas en otras especies por regular la densidad de este tipo de tricomas o los niveles de acilazúcares. En ambas regiones hay genes anotados que intervienen en el desarrollo de los tricomas o en la formación de acilazúcares, como aciltransferasas, glicosiltransferasas o los factores de transcripción MYB. / [CA] La millora de les espècies cultivades és una àrea dinàmica, subjecta a les necessitats i requeriments dels diferents cultius a cada moment i de les exigències de productors i consumidors. Una limitació en aquest procés de millora és la diversitat genètica existent en els cultius a causa de diversos colls de botella poblacionals durant la seua domesticació. En aquests casos, les espècies silvestres emparentades revisten un especial interés, podent-se utilitzar com a font de al·lels en la millora genètica. Aquesta circumstància es dona en el cas de la tomaca cultivada (Solanum lycopersicum var. lycopersicum, SLL). Aquesta espècie va sorgir a partir de Solanum lycopersicum var. cerasiforme (SLC), que al seu torn va ser pre-domesticada a partir de Solanum pimpinellifolium (SP). Pese al potencial per a la millora d'aquestes espècies, el seu ús està limitat en gran manera per la falta d'informació de les col·leccions mantingudes en els bancs de germoplasma, principalment SLC. Per a aconseguir l'objectiu anteriorment exposat s'ha emprat una col·lecció de germoplasma composta per 15 accessions de SLL, procedents de Mèxic; 27 de SP, procedents del Perú i l'Equador i 121 de SLC, procedents del Perú, l'Equador, Mèxic i Mesoamèrica. Aquesta col·lecció ha sigut sotmesa a una extensa caracterització fenotípica i genètica, la qual cosa ha permés identificar les regions de genoma associades a caràcters fenotípics mitjançant estudis d'associació del genoma complet (GWAS). A més, s'han creat poblacions segregants F2 per a cadascuna de les entrades de la col·lecció creuant-les amb tres parentals diferents, i aquests creus s'han posat a la disposició de la comunitat científica. Aquest recurs permetrà l'estudi del control genètic de mutants d'interés en millora. Aquesta utilitat s'explora en l'últim capítol de la tesi, on s'estudia el control genètic de la densitat de tricomas en una accessió de l'espècie SP, característica d'interés per conferir resistència a artròpodes. L'estudi realitzat amb les dades morfològiques ha demostrat la presència d'una gradació morfològica contínua entre els tres grups taxonòmics, i ha permés la identificació d'una sèrie de caràcters que permeten la diferenciació entre grups i també entre les diferents procedències geogràfiques dins de cada grup taxonòmic. Els diferents polimorfismes de nucleòtid únic (SNPs) van ser anotats en base a la predicció del seu efecte en la sequència codificant mitjançant el programa SnpEff i es van dur a terme estudis de GWAS. L'anàlisi genètica va revelar al Perú i l'Equador com les regions amb majors nivells de diversitat, tant en l'espècie SP com en SLC. Es va observar una reducció en el nombre de variants SNP en SLC Mèxic, que concorda amb la hipòtesi que Mesoamèrica siga centre de domesticació i difusió de la tomaca cultivada. Finalment, es va constatar el procés de domesticació com la causa de la menor diversitat present en l'espècie cultivada. Els estudis GWAS van permetre la identificació de correlacions genotipe-fenotip, revelant l'associació entre 107 SNPs i huit caràcters quantitatius i un total de 30 SNPs associats a 7 caràcters qualitatius. Una part dels SNPs detectats van ser localitzats prop de regions genòmiques associades amb gens i QTLs o en regions amb possibles gens candidats anotats y la resta de SNPs detectats es corresponen amb regions no descrites prèviament el que obri el camí a estudis per a la detecció de nous gens candidats. La utilitat d'aquestes famílies F2 es demostra en l'últim capítol d'aquesta tesi mitjançant l'estudi de la base genètica de la densitat de tricomas tipus IV. S'estudia el control genètic de la presència i alta densitat de tricomas tipus IV en dos fons genètics diferents, SLL x SP i SP x SLC. En tots dos fons s'han detectat dos QTLs principals en els cromosomes 9 i 11. A més, s'han detectat senyals en els cromosomes 2, 5, 6, 7 i 8, en funció de la família segregant estudiada. Les regions detectades en els cromosomes 9 i 11 havien sigut prèviament descrites en altres espècies per regular la densitat d'aquests tricomas o els nivells de acilazúcares. En totes dues regions hi ha gens anotats que intervenen en el desenvolupament dels tricomas o en la formació de acilsucres, com aciltransferases, glicosiltransferases o els factors de transcripció MYB. / [EN] The improvement of cultivated species is a dynamic field, subject to the needs and requirements of the different crops at different moments as well as to the demands of producers and consumers. A limitation in this improvement process is the amount of genetic diversity available for breeding purposes because of population bottlenecks during their domestication. This circumstance occurs in the case of cultivated tomatoes (Solanum lycopersicum var. lycopersicum, SLL) which evolved from Solanum lycopersicum var. cerasiforme (SLC), which was pre-domesticated from Solanum pimpinellifolium (SP). Despite these species have been used for tomato breeding, their use is still limited due to the lack of detailed information about the collections that are kept in genebanks. With the aim of solve this problem, a germplasm collection has undergone an extensive morphological and genetic characterization. This collection comprises a wide range of geographical origins: includes 15 SLL accessions from Mexico; 27 SP accession from Peru and Ecuador and 121 SLC accessions from Peru, Ecuador, Mesoamerica, and Mexico. Genome-wide association studies (GWAS) were performed to detect genomic candidate regions associated with each agronomic trait. Furthermore, a collection of segregating populations has been developed by crossing the whole collection with a representative accession for each of the three species (SLL, SLC and SP). These populations are available to the scientific community and could be very useful to speed up the validation of candidate genes or to study the genetic control of mutants. This last approach will be explored in the last chapter of this thesis, where the genetic control of density of type IV trichomes is studied. The study carried out with morphological data has demonstrated the presence of a phenotypic variation between our three species. The analysis has allowed the identification of characters which differentiate between species and between different geographical origin within each species. The identified SNPs were annotated, and their putative impacts were predicted by using SnpEff. The lowest number of variants was detected in SLL grups and the highest number of variants was detected in SP. SLC had a variation between SLL and SP, with lower levels in SLC Mexico. This fact agrees with the hypothesis for the domestication and diffusion of cultivated tomato in Mesoamerica. Additionally, GWAS analysis was carried out with this genetic data and revealed significant associations between 107 SNPs and 8 quantitative traits and a total of 30 SNPs associated with 7 qualitative traits. This analysis has allowed the identification of known genomic regions such as the associations between fruit weight and fw2.2 or fw9.2. However, regions with possible novel genes have also been detected such as the case of yellow fruit. These results reinforce the potential of our collection for breeding programmes. The usefulness of F2 populations have been used to determine the genetic control of density of type IV trichomes. During the characterization of this collection, a SP accession (BGV016047) with a high density of type IV trichomes was detected. These trichomes have been described to accumulate different types of chemical substances related to pest resistance. This thesis shows that this character is influenced by environmental factors such as plant and leave age. On the other hand, the genetic control of this character has been studied in two different genetic backgrounds, SLL x SP and SP x SLC. Two main QTLs have been detected in both families, on chromosome 9 and 11. In addition, the different F2 populations have revealed that this character could be under the control of other QTLs on chromosomes 2, 5, 6, 7 and 8. / This research was supported by the National Natural Science Foundation of USA Varitome project (NSF IOS 1564366). / Mata Nicolás, E. (2021). Utilización de una colección de germoplasma de tomate para la identificación de genes de interés [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172639 / TESIS / Compendio

Tesis por compendio / [ES] Desde el origen de los cítricos, hibridaciones naturales ancestrales, espontáneas o de cultivo a lo largo de miles de años, han ocasionado fenómenos de mezcla que han determinado la complejidad de la biología reproductiva de los cítricos cultivados hoy en día. El objetivo global de esta tesis doctoral es aumentar el conocimiento sobre diferentes aspectos reproductivos que son cruciales para la mejora y propagación de los cítricos y su interacción con las condiciones ambientales. El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido el análisis del efecto de la temperatura en la fase progámica de los cítricos. Hemos comprobado que las temperaturas altas redujeron el tiempo que necesitaban los tubos polínicos para llegar a los óvulos y también aceleraron la degeneración del pistilo, mientras que las bajas temperaturas produjeron los efectos opuestos. Sin embargo, los tubos polínicos pudieron llegar a los óvulos en todos los cruces estudiados. Es interesante señalar que observamos por primera vez en cítricos tanto la germinación del polen como el crecimiento del tubo polínico a 10ºC. Las mandarinas representan el 24% de la producción total de cítricos y la ausencia de semillas se valora como criterio de calidad en el mercado de la fruta fresca. La aptitud partenocárpica (AP) es la clave para la producción de frutos sin semillas cuando se combina con la autoincompatibilidad (AI) o la esterilidad. El segundo objetivo de esta tesis doctoral fue evaluar AP y AI para variedades de mandarina con características relevantes como progenitores para la mejora genética de mandarinas sin semillas. Para ello, desarrollamos un protocolo eficiente basado en la emasculación, la autopolinización manual y la polinización cruzada manual. Se observaron seis comportamientos diferentes entre las nueve variedades analizadas. Subrayar que más allá de la importancia crítica de la AI para la producción de frutos sin semillas, la AI es un obstáculo para los programas de mejora genética basados en hibridación, ya que reduce las posibilidades de cruzamiento. Esta circunstancia motivó el planteamiento del tercer objetivo de esta tesis doctoral. Dicho objetivo fue comparar la eficiencia de la ruptura de la reacción de AI por tres factores previamente identificados en otras especies: estrés por temperatura, polinización de yemas florales y poliploidización. Los tres métodos tuvieron éxito en la obtención de plantas autofecundadas, y la polinización de yemas florales resultó ser el método más eficiente. La selección asistida por marcadores (MAS) permite la selección de genotipos en la etapa de plántula, lo que la convierte en una herramienta poderosa, especialmente en especies de árboles con un largo período juvenil, como es el caso de los cítricos. El cuarto objetivo de esta tesis doctoral se centró por tanto en el desarrollo de marcadores SNPs asociados a poliembrionía y esterilidad masculina. Mediante estudios exhaustivos de asociación genética, identificamos una región genómica en el grupo de ligamiento 1 asociado con poliembrionía y una región genómica en el grupo de ligamiento 8 asociado con NPG. Se desarrollaron marcadores SNP cercanos a genes que tienen funciones relacionadas con la esterilidad masculina y con la poliembrionia para las dos regiones genómicas. Esta tesis doctoral proporciona nuevos conocimientos sobre la biología reproductiva de los cítricos y la influencia de la temperatura en ella. El conocimiento generado permitirá implementar de manera más eficiente los programas de mejora genética, particularmente aquellos destinados a la obtención de variedades sin semillas. Además, este conocimiento podrá utilizarse para ayudar en la respuesta a algunos de los desafíos más apremiantes que plantea el escenario actual de calentamiento global. / [CA] Des de que es van originar els cítrics, hibridacions naturals ancestrals, espontànies o de conreu, al llarg de milers d'anys, han ocasionat fenòmens de mescla que han determinat la complexitat de la biologia reproductiva dels cítrics actualment conreats. L'objectiu global d'aquesta tesi va ser augmentar el coneixement de diferents aspectes reproductius dels cítrics ¿especialment en la seua interacció amb les condicions ambientals¿ crucials per a la seua millora genética i reproducció, El nostre primer objectiu ha estat l'anàlisi de l'efecte de la temperatura en la fase progàmica dels cítrics. Hem comprovat que les temperatures càlides redueixen el temps necessari per arribar als òvuls pels tubs de pol·len i que també acceleren la degeneració del pistil; mentre les temperatures fredes van produeixen els efectes contraris. No obstant això, els tubs pol·línics van poder arribar als òvuls en totes les creus estudiades. Curiosament, vam observar per primera vegada als cítrics tant la germinació del pol·len com el creixement del tub pol·línic a 10ºC. Les mandarins representen el 24% de la producció total de cítrics i l'absència de llavors és un criteri de qualitat crucial en el mercat de la fruita fresca. La capacitat partenocàrpica (PA) és la clau per a la producció de fruites sense llavors quan s'acobla a l'autoincompatibilitat (SI) o l'esterilitat. El segon objectiu d'aquesta tesi doctoral va ser avaluar PA i SI per a varietats de mandarines amb característiques rellevants com a progenitors per a la millora genètica de mandarines sense llavors. Amb aquesta finalitat, hem desenvolupat un protocol eficient basat en l'emasculació, l'autopol·linització manual i la pol·linització creuada manual. Es van observar sis comportaments diferents entre les nou varietats analitzades. Subratllar que, enllà de la importància crítica del SI en la producció de fruites sense llavors, el SI és alhora un obstacle per als programes de millora basats en la hibridació, ja que redueix les possibilitats d'encreuament. Aquesta circumstància va motivar el plantejament del tercer objectiu d'aquesta tesi doctoral. Aquest objectiu va ser comparar l'eficiència de la ruptura de la reacció SI per tres factors identificats prèviament en altres espècies: estrès per temperatura, pol·linització de rovells florals i poliploidització. Els tres mètodes van tenir èxit en l'obtenció de plantes autofecundades, i la pol·linització de rovells florals va resultar ser el mètode més eficient. La selecció assistida per marcadors (MAS) en l'etapa de plàntules permet la selecció de genotips diana, la qual cosa la converteix en una eina potent, especialment en espècies d'arbres amb període juvenil llarg, com els cítrics. El quart objectiu d'aquesta tesi doctoral se centra en el desenvolupament de marcadors SNPs associats a la poliembriona i l'esterilitat masculina. Estudis exhaustius d'associació genètica, vam identificar una regió genòmica al grup de lligament 1 associada a la poliembrionia i una regió genòmica al grup de lligament 8 associada amb NPG. Es van desenvolupar marcadors SNP estretament relacionats amb gens implicats per a les dues regions genòmiques. Aquesta tesi doctoral proporciona nous coneixements sobre la biologia reproductiva dels cítrics i la influència de la temperatura sobre ella. El coneixement generat permetrà implementar de manera més eficient els programes de millora genètica, especialment aquells destinats a l'obtenció de varietats sense llavors. A més, aquest coneixement es podrà utilitzar en la complexa resposta a alguns dels reptes més urgents que planteja l'escenari actual d'escalfament global. / [EN] Since the origin of citrus, ancestral natural hybridizations, thousands of years of cultivation and admixture phenomenon have resulted in the complexity of the reproductive biology of today's cultivated citrus. The global objective of this PhD was to increase our knowledge on different reproductive aspects that are crucial for citrus breeding and propagation and their interaction with environmental conditions. Temperature in the progamic phase is critical for the success of plant sexual reproduction. Pollen grain germination, stigmatic receptivity and pollen tube growth are the main components of this phase. The analysis of temperature effect on the progamic phase of citrus was our first objective. Using three compatible crosses within the Citrus genus, we evaluated, with this method, the effect of four temperature regimes in every process during the progamic phase. Warm temperatures reduced the time needed by pollen tubes to reach the ovules and also accelerate pistil degeneration while cold temperatures produced the opposite effects. However, pollen tubes were able to reach the ovules in all crosses studied. Interestingly, we observed for the first time in citrus both pollen germination and pollen tube growth at 10ºC. Mandarins account for 24% of total citrus production and seedlessness is a crucial quality criterion for the mandarin fresh fruit market. Parthenocarpic ability (PA) is the key for seedless fruit production when it is coupled with self-incompatibility (SI) or sterility. The second objective of this PhD dissertation was to evaluate PA and SI for mandarin varieties with relevant characteristics as parents for seedless mandarin breeding. For this purpose, we developed an efficient protocol based on emasculation, hand self-pollination and hand cross-pollination. Pollen performance was analysed by histological observations, together with fruit set and seed production. Six different behaviors were observed among the nine varieties analysed. Beyond the critical importance of SI for seedless fruit production, SI is an obstacle for breeding programs based on hybridization as it reduces crossing possibilities. The third objective of this PhD dissertation was to compare the efficiency of the SI reaction breakdown by three factors previously identified in other plant species: temperature stress, bud pollination and polyploidization. The three methods were successful in recovering selfed plants, and bud pollination was the most efficient approach. Chromosome doubling was also efficient, but involved developing tetraploid plants. Cold temperature stress allowed us to obtain a few diploid selfed plants. However, this method proved much more complex to apply than bud pollination in specific breeding programs. Marker-assisted selection (MAS) allows the selection of target genotypes at the seedling stage, making it a powerful tool, especially in tree species with long juvenile period, such as citrus. The 4th objective of this PhD dissertation focuses on the development of SNPs markers associated with polyembryony and male sterility. Through genetic association studies, we identified a genomic region in linkage group 1 associated with polyembryony and a genomic region on linkage group 8 associated with NPGA. SNP markers closely linked with implied genes were developed for the two genomic regions. Overall, this PhD dissertation provides new insights into citrus reproductive biology and the influence of temperature on it. The knowledge generated will allow to implement breeding programs more efficiently, particularly those aimed at obtaining seedless varieties. This knowledge can eventually be used to respond to some of the most pressing challenges posed by the current global warming scenario. / Montalt Resurrección, R. (2023). Assessment of Citrus Reproductive Biology for Seedless Mandarin Production and its Interaction with Temperature [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193856 / Compendio

[EN] Eggplant (Solanum melongena L.) is one of the vegetables with highest content in phenolic compounds, giving eggplant a high antioxidant power and other bioactive beneficial health properties. This means that there is a growing demand among consumers concerned about a healthy diet. However, despite being a crop with a great economic importance worldwide, it is one of the least-studied Solanaceae (much less than tomato, pepper and potato), so it is necessary to carry out studies that contribute to the genetic improvement of eggplant to the commercial level so that the genetic diversity is increased and that is adapted to the demands of producers and consumers. The work carried out in this Thesis aims to obtain relevant information for the breeding programmes of eggplant through the study of genetic diversity and development and use of tools for the morphological characterization as well as increasing genetic diversity in élite germplasm for the development of programs aimed at obtaining high-value hybrids. For achieving this objective, commercial eggplant (semi-larga) black type, as well as other types, origins and varieties of local material are used. In the first part of the Thesis, we rely on the study of genetic diversity in S. melongena and the application of new tools to perform accurate morphological characterization and improve the process of selection of the breeding programs. This diversity studies have been conducted in three centres of origin side in different regions (Spain, Sri Lanka and China), in local materials of eggplant with different typologies, and new phenomic tools have been used for the morphological characterization of the fruit of the eggplant. In the second part of this work, we deal with the development of plant material to increase the genetic base of eggplant cultivars and with the implementation of various programmes for genetic improvement. For this we plan and develop different breeding programs according to different objectives, including the implementation of a programme of improvement of a local variety with protected geographical indication (IGP), and increasing the diversity and new "elite" material of black type eggplant through a program of genetic improvement. In summary, our work that shows that the study of the genetic diversity and the use of phenomics tools for morphological characterization, as well as the development of new plant material, is very useful for obtaining new varieties of eggplant as well as scientific and technical information of interest to other researchers and breeders. We have also found that "public-private research" interaction allows a synergistic collaboration in obtaining plant material and information of interest for vegetables breeding. / [ES] La berenjena (Solanum melongena L.) es una de las hortalizas más ricas en compuestos fenólicos, lo cual le confiere un alto poder antioxidante y otras propiedades bioactivas beneficiosas para la salud. Ello hace que haya una demanda creciente entre consumidores preocupados por una dieta saludable. Sin embargo, a pesar de ser un cultivo con una gran importancia económica a nivel mundial, es una de las solanáceas menos estudiadas (mucho menos que tomate, pimiento y patata), por lo que es necesario realizar estudios que contribuyan a la mejora genética de la berenjena a nivel comercial de forma que amplíen la diversidad genética y que permitan adaptarse a las demandas de productores y consumidores. El trabajo realizado en esta Tesis pretende obtener información relevante para los programas de mejora genética de berenjena mediante el estudio de la diversidad genética y el desarrollo y uso de herramientas para la caracterización morfológica, así como el aumento de la diversidad genética en el germoplasma élite de los programas de desarrollo de híbridos de alto valor. Para ello se utiliza material vegetal tanto de la berenjena comercial tipo negra (semi-larga), como material de otros tipos, orígenes y variedades locales. En una primera parte de la Tesis, nos basamos en el estudio de diversidad genética en S. melongena y en la aplicación de nuevas herramientas para realizar una caracterización morfológica precisa y mejorar el proceso de selección en los programas de mejora. Para ello se han realizado estudios de diversidad en tres centros de origen secundarios de distintas regiones (España, Sri Lanka y China), en materiales locales de berenjena con distintas tipologías, y se han utilizado nuevas herramientas fenómicas para la caracterización morfológica del fruto de la berenjena. Como segunda parte de este trabajo, abordamos el desarrollo de material vegetal para el incremento de la base genética de los cultivares de berenjena e implementación de distintos programas de mejora genética. Para ello se plantean y ejecutan diferentes programas de mejora según los objetivos explícitos, incluyendo la realización de un programa de mejora para una variedad local con Indicación Geográfica Protegida (IGP), e incrementando la diversidad y la obtención de nuevos materiales de élite de berenjena tipo negra mediante un programa de mejora genética. En definitiva, nos encontramos con un trabajo que muestra que el estudio de la diversidad genética y el desarrollo y utilización de herramientas fenómicas para la caracterización morfológica, además de la obtención de material vegetal nuevo, es de gran utilidad para el desarrollo de nuevas variedades de berenjena, así como para obtener información científico-técnica de interés para otros investigadores y mejoradores. También hemos constatado que la interacción "investigación pública-privada" permite una colaboración sinérgica en la obtención de material vegetal e información de interés en la mejora de hortícolas. / [CA] L'albergina (Solanum melongena L.) és una de les hortalisses més riques en compostos fenòlics, el que li confereix un alt poder antioxidant i altres propietats bioactives beneficioses per a la salut. Aquest fet fa que hi haja una demanda creixent entre els consumidors preocupats per una dieta saludable. No obstant això, a pesar de ser un cultiu amb una gran importància econòmica a nivell mundial, és una de les solanàcies menys estudiades (molt menys que tomaca, pimentó i creïlla) , per la qual cosa és necessari realitzar estudis que contribuïsquen a la millora genètica de l'albergina a nivell comercial de manera que amplien la diversitat genètica i que permeten adaptar-se a les demandes de productors i consumidors. El treball realitzat en esta Tesi pretén obtindre informació rellevant per als programes de millora genètica d'albergina per mitjà de l'estudi de la diversitat genètica i el desenvolupament i ús de ferramentes per a la caracterització morfològica, així com l'augment de la diversitat genètica en el germoplasma elit dels programes de desenvolupament d'híbrids d'alt valor. Per a això s'utilitza material vegetal tant de l'albergina comercial de tipus negra (semi-llarga), com material d'altres tipus, orígens i varietats locals. En una primera part de la Tesi, ens basem en l'estudi de diversitat genètica en S. melongena i en l'aplicació de noves ferramentes per a realitzar una caracterització morfològica precisa i millorar el procés de selecció en els programes de millora. Per a això s'han realitzat estudis de diversitat en tres centres d'origen secundaris de distintes regions (Espanya, Sri Lanka i Xina), en materials locals d'albergina amb distintes tipologies, i s'han utilitzat noves ferramentes fenòmiques per a la caracterització morfològica del fruit de l'albergina. Com a segona part d'este treball, abordem el desenvolupament de material vegetal per a l'increment de la base genètica dels cultivars d'albergina i implementació de distints programes de millora genètica. Per a això es plantegen i executen diferents programes de millora segons els objectius explícits, incloent la realització d'un programa de millora per a una varietat local amb Indicació Geogràfica Protegida (IGP), i incrementant la diversitat i l'obtenció de nous materials d'elit d'albergina tipus negra per mitjà d'un programa de millora genètica. En definitiva, ens trobem amb un treball que mostra que l'estudi de la diversitat genètica i el desenvolupament i utilització de ferramentes fenómiques per a la caracterització morfològica, a més de l'obtenció de material vegetal nou, és de gran utilitat per al desenvolupament de noves varietats d'albergina, així com per a obtindre informació cientificotècnica d'interés per a altres investigadors i milloradors. També hem constatat que la interacció "investigació pública-privada" permet una col·laboració sinèrgica en l'obtenció de material vegetal i informació d'interés en la millora d'hortícoles. / Hurtado Ricart, M. (2016). Mejora genética de la berenjena (S. melongena L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61386 / TESIS

[EN] Tomato spotted wilt virus is one of the most widespread and economically important viruses worldwide. It infects a large number of plant species, being the tomato and pepper the most affected. TSWV is transmitted from one plant to another by various species of thrips in a circulative and propagative manner, being Flankliniella occidentalis the main vector. The best strategy for disease control in tomato and pepper has been breeding resistant cultivars, but only tomato with the gene Sw-5 and pepper with gene Tsw have been effective against a wide spectrum of TSWV isolates, but resistance-breaking isolates often arise. To obtain a more effective and durable control is necessary: A) the genetic and biological characterization of conventional and resistance-breaking isolates of TSWV; B) the understanding the evolutionary and epidemiological factors involved in the emergence and dispersion of resistance-breaking isolates; C) the development of tools for viral detection and quantification; and D) evaluation of new sources of resistance (total or partial, estimated as the difficulty to viral infection or/and accumulation) or tolerance (total or partial, estimated as the difficulty to symptoms development and damage without affecting viral infection). In this work, TSWV isolates from Spanish tomato and pepper crops have been biologically and molecularly characterized. The complete genome of three TSWV isolates with different biotypes were sequenced: N (unable to infect Sw-5 resistant tomato and Tsw resistant pepper), T (tomato Sw-5 resistance-breaking), and P (pepper Tsw resistance-breaking). No correlation between genetic variation and the ability of overcoming resistance was found. These nucleotide sequences and others retrieved from the GenBank database were used to develop RT-qPCR, with high sensitivity and dynamic range. Primers and one TaqMan MGB were designed from conserved sequence stretches with the aim of detecting and quantifying any TSWV isolate. It was not possible to develop a molecular method to differentiate between conventional and resistance-breaking isolates since there is no correlation between genotype and biotype. Instead, two TaqMan MGB probes were designed to quantify the two main genotypes (according to the M segment) in mixed infections. RT-qPCR was used to evaluate TSWV accumulation in non-resistant tomato, non-resistant pepper and Datura stramonium (an important reservoir), as well as in the main vector F. occidentalis, which was considered to evaluate transmission efficiency. The results showed that resistance breakdown was not associated to a fitness cost (tradeoff) in the infectivity of susceptible hosts or transmissibility by thrips and that the resistance-breaking isolates have the same potential for dispersion in field as the conventional isolates. Finally, the information obtained from the previous studies and the RT-qPCR technique were used to evaluate the resistance and tolerance to TSWV of a new accession of Capsicum baccatum. In addition to considering the genetic and biological variation of TSWV, a new approach was used based on analysis of longitudinal data (those measured in the same individuals over time). The resistance level was estimated with two variables: A) absolute fitness, calculated from the variation in time of the viral titer, quantified by RT-qPCR; and B) infectition survival, the median time in which the virus was detected in a plant by ELISA. The tolerance level was estimated as symptom survival, the median time in which a plant developed severe symptoms. This analysis showed that this new accession is partially resistant and totally tolerant to TSWV conventional and resistance-breaking isolates and therefore is a good candidate for a pepper breeding program / [ES] Tomato spotted wilt virus (TSWV) es uno de los virus más extendidos y de mayor importancia económica del mundo. Infecta a un gran número de especies vegetales, siendo los cultivos de tomate y pimiento los más afectados. Este virus se transmite de una planta a otra por trips en una manera propagativa y circulativa, siendo Flankliniella occidentalis el más eficaz. El cultivo de variedades resistentes de tomate y pimiento permitió el control de la enfermedad, ya que estos genes inducen una respuesta hipersensible impidiendo la infección sistémica del virus. Sin embargo, con frecuencia aparecen aislados del virus capaces de superar estas resistencias. Para obtener un control de la enfermedad más eficaz y duradero es necesario: A) la caracterización genética y biológica de los aislados del TSWV que superan y no superan las resistencias; B) el estudio de los factores evolutivos y epidemiológicos implicados en la aparición y establecimiento de los aislados que superan las resistencias; C) el desarrollo de herramientas que permitan la detección y cuantificación de estos aislados virales; y D) la evaluación de nuevas fuentes de resistencia o tolerancia. En este trabajo se han caracterizado biológicamente y molecularmente diferentes aislados del TSWV procedentes de cultivos de tomate y pimiento de España. Se determinó la secuencia nucleotídica del genoma completo de tres aislados españoles correspondientes a tres biotipos: N (incapaz de infectar variedades resistentes de tomate o pimiento); T (supera la resistencia Sw-5 de tomate); y P (supera la resistencia Tsw de pimiento). No se encontró correlación entre la variación genética y la capacidad de superar la resistencia. Estas secuencias nucleotídicas y otras obtenidas de la base de datos Genbank se utilizaron para desarrollar una técnica basada en la RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR) que permite detectar el virus con un alto grado de sensibilidad y cuantificar en un amplio rango dinámico. Se diseñaron los iniciadores y una sonda TaqMan MGB a partir de segmentos de secuencia conservados para que fueran válidos para todos los aislados del TSWV. También se desarrollaron dos sondas Taqman que permitían cuantificar diferencialmente variantes genéticas del virus en infecciones mixtas. La RT-qPCR se utilizó para evaluar la acumulación de varios aislados del TSWV en tomate sin Sw-5, pimiento sin Tsw y Datura stramonium, así como, en su principal vector F. occidentalis que se usó para evaluar la eficiencia de la transmisión. Se observó que la superación de la resistencia no suponía un coste en la eficacia biológica (fitness) tanto en la multiplicación del virus en estas plantas como en la transmisión por trips. Por tanto, los aislados que superan las resistencias tienen la misma capacidad de dispersión en campo que los aislados convencionales. Por último, se utilizó la RT-qPCR y la información obtenida para evaluar la capacidad de resistencia y tolerancia al TSWV de una accesión de Capsicum baccatum. El nivel de resistencia se estimó a partir de dos variables: A) la eficacia absoluta, calculada a partir de la variación en el tiempo del título viral, cuantificado por RT-qPCR; y B) la infectividad, como la mediana del tiempo que tarda el virus en ser detectado en una planta por ELISA. El nivel de tolerancia se estimó como la mediana del tiempo que tarda una planta en mostrar síntomas graves. Esta nueva accesión es parcialmente resistente y totalmente tolerante tanto para aislados del TSWV convencionales como para aquellos capaces de infectar e inducir síntomas severos en variedades de pimiento con el gen Tsw. Por tanto, esta nueva variedad de C. baccatum es un buen candidato para usarlo en programas de mejora genética de pimiento. / [CAT] Tomato spotted wilt virus (TSWV) és un dels virus més estesos i de major importància econòmica del món. Infecta a un gran nombre d'espècies vegetals i els cultius de tomaca i pebrot són alguns dels més afectats. Aquest virus es transmet d'una planta a una altra, per trips de manera propagativa i circulativa, i Flankliniella occidentalis és el més eficaç. El cultiu de varietats resistents de tomaca i pebrot (en els quals s'han introduït per millora genètica els gens Sw-5 i Tsw, respectivament) va permetre el control de la malaltia, ja que aquests gens indueixen una resposta hipersensible i impedeixen la infecció sistèmica del virus (resistència total). No obstant açò, amb freqüència apareixen aïllats del virus que són capaços de superar aquestes resistències. Per a obtenir un control de la malaltia més eficaç i durador és necessari: A) la caracterització genètica i biològica dels aïllats del TSWV que superen i no superen les resistències; B) l'estudi dels factors evolutius i epidemiològics implicats en l'aparició i establiment dels aïllats que superen les resistències; C) el desenvolupament d'eines que permeten la detecció i quantificació d'aquests aïllats virals; i D) l'avaluació de noves fonts de resistència (total o parcial, que dificulten la infecció i multiplicació viral) o tolerància (total o parcial, que dificulten l'aparició de símptomes i danys encara que no tinguen un efecte en la infecció viral). En aquest treball s'han caracteritzat biològicament i molecularment diferents aïllats del TSWV procedents de cultius de tomaca i pebrot d'Espanya. Es va determinar la seqüència nucleotídica del genoma complet de tres aïllats espanyols corresponents a tres biotips: N (incapaç d'infectar varietats resistents de tomaca o pebrot); T (supera la resistència Sw-5 de tomaca); i P (supera la resistència Tsw de pebrot). Els resultats van mostrar que no hi havia una correlació entre la variació genètica i la capacitat de superar la resistència. Aquestes seqüències nucleotídiques i altres obtingudes de la base de dades Genbank es van utilitzar per a desenvolupar una tècnica basada en la RT-qPCR que permet detectar el virus amb un alt grau de sensibilitat i quantificar en un ampli rang dinàmic. Es van dissenyar els iniciadors i una sonda TaqMan MGB a partir de segments de seqüència conservats perquè foren vàlids per a tots els aïllats del TSWV. Tambe es van desenvolupar dos sondes Taqman que permetien quantificar diferencialment variants genètiques del virus en infeccions mixtes. La RT-qPCR es va utilitzar per a avaluar l'acumulació de diversos aïllats del TSWV en tomaca sense Sw-5, pebrot sense Tsw i Datura stramonium així com, en el seu principal vector F. occidentalis que es va usar per a avaluar l'eficiència de la transmissió. Es va observar que la superació de la resistència no suposava un cost en l'eficàcia biològica (fitness) tant en la multiplicació del virus en aquestes plantes com en la transmissió per trips. Per tant, els aïllats que superen les resistències tenen la mateixa capacitat de dispersió en camp que els aïllats convencionals. Finalment, es va utilitzar la RT-qPCR i la informació obtinguda per a avaluar la capacitat de resistència i tolerància d'una accessió de Capsicum baccatum al TSWV. El nivell de resistència es va estimar a partir de dues variables: A) l'eficàcia absoluta, calculada a partir de la variació en el temps del títol viral, quantificat per RT-qPCR; i B) la infectivitat, com la mitjana del temps que es tarda a detectar el virus en una planta per mitjèr d'ELISA. El nivell de tolerància es va estimar com la mitjana del temps que tarda una planta a mostrar símptomes greus. Aquesta nova accessió és parcialment resistent i totalment tolerant tant per a aïllats del TSWV convencionals com per a aquells capaços d'infectar i induir símptomes severs en varietats amb el gen Tsw. Per tant, aquesta nova varietat d / Debreczeni, DE. (2015). Caracterización de aislados del virus del bronceado del tomate (TSWV) que superan las resistencias de los genes Sw-5 en tomate y Tsw en pimiento. Identificación de una fuente de tolerancia en pimiento [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/51460 / TESIS

Las variedades tradicionales de tomate son apreciadas por los consumidores, que están dispuestos a pagar mayores precios por recuperar el sabor del tomate. Este interés ha propiciado que los estudios referentes a estos materiales se hayan multiplicado durante los últimos años, aunque normalmente se ciñen a pocas variedades, pocas poblaciones por variedad, o a aspectos muy concretos de sus características. El presente trabajo aborda una caracterización de variedades tradicionales del levante español que permita reunir e integrar los resultados de caracterización morfo-agronómica, organoléptica, funcional y molecular, en un intento de poner en valor estos importantes recursos fitogenéticos. Dentro de las poblaciones de las variedades tradicionales evaluadas se han observado niveles elevados de variación en características morfo-agronómicas y funcionales. Dicha variación puede deberse a factores micro-ambientales o diferencias genotípicas, puesto que se trata de variedades población. No obstante, las diferencias observadas en los niveles de variación respecto a híbridos F1 empleados como control, sugiere que las diferencias genotípicas entre individuos no serían tan importantes como cabría pensar. La variación detectada entre poblaciones de la misma variedad es, en general, mayor en todos los niveles (morfo-agronómico, organoléptico, funcional y molecular). Aunque parece existir una cierta tendencia en el perfil organoléptico, funcional y morfológico para cada variedad, lo cierto es que los rangos de variación de estos perfiles entre distintas variedades se solapan. La selección diferencial realizada por cada agricultor dentro de variedad podría ser una de las principales causas de la elevada variabilidad detectada. A ésta se añade los efectos de la mezcla de semillas y los cruzamientos espontáneos que se han evidenciado en la evaluación de los materiales (tanto por segregación morfo-agronómica como por los niveles de heterocigosidad observada en algunas poblaciones). De esta forma, tras estos sucesos el agricultor aplicaría una elevada presión de selección para recuperar las características básicas externas de la variedad, pero la variación se mantendría, especialmente, en los caracteres internos. La elevada variabilidad entre las poblaciones de una misma variedad presenta varios problemas a la hora de abordar la promoción de su cultivo y su conservación in situ. Por un lado, la existencia de tanta variación complica que los consumidores asocien un morfotipo muy definido con un elevado estándar de calidad. Además, la falta de un ideotipo claro y relativamente uniforme, dificulta el registro de los materiales como variedades de conservación. Por otro lado, no todas las poblaciones de una variedad aglutinan una morfología y estructura del fruto adecuada, representativa de la variedad y que además manifieste el mejor sabor posible. Por ello, es conveniente llevar a cabo programas de depuración varietal en los que se realicen selecciones de las mejores poblaciones que reúnan las mejores características. Por otro lado, también sería recomendable realizar selecciones dentro de población en los casos en los que la variación intra-poblacional sea excesiva. En ocasiones, y de forma complementaria, podría contemplarse la introgresión de genes de resistencia a virosis en variedades tradicionales, como medida necesaria en aquellas zonas especialmente afectadas por determinadas enfermedades. De forma adicional, considerando el creciente interés por los alimentos saludables, la detección de variedades o poblaciones dentro de variedad que destaquen por un elevado valor funcional, puede contribuir a identificar un valor añadido que permita valorizar estas variedades tradicionales. En este contexto, se han encontrado poblaciones con niveles de vitamina C próximos a los mostrados por cultivares “Double Rich”, de licopeno dentro del rango de variación mostrado por cultivares “high pigment” y de β-caroteno comparables a los mejores resultados obtenidos en cultivares “high pigment”. Estos materiales resultan potencialmente útiles como fuentes de variación o pueden ser directamente aprovechables para ser reintroducidos en el mercado con un valor añadido contrastado. Aunque se ha encontrado variación para el contenido en polifenoles totales, éstos han sido intermedios. Finalmente, a la hora de realizar una adecuada identificación del ideotipo varietal, de depurar una variedad descartando poblaciones, de acelerar programas de introgresión de genes o simplemente para defender los mercados de calidad frente a fraudes que pretendan aprovechar los diferenciales de precio de las variedades tradicionales, es necesario contar con herramientas de caracterización molecular eficientes. En este trabajo se ha seleccionado y comprobado la efectividad de una colección de marcadores SNP para caracterizar variedades tradicionales de tomate y se han obtenido huellas moleculares para las variedades: “Centenares”, “Cuarenteno”, “De la pera”, “De pera”, “Flor de baladre”, “Gordo rojo”, “Moruno”, “Muchamiel”, “Negre”, “Pimiento”, “Valenciano” y “Tomaca gallega”. La tipificación varietal, la identificación de un valor añadido en las características organolépticas y funcionales de estos materiales, y la detección de perfiles moleculares que permitan autentificarlos, son elementos clave y necesarios para asegurar la protección de estos recursos genéticos. Estas actividades contribuirán a consolidar los mercados de calidad, satisfaciendo las demandas de los consumidores, y ofreciendo una alternativa de cultivo rentable a agricultores en sistemas minifundistas. / Cortés Olmos, C. (2015). Puesta en valor de variedades tradicionales de tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48532 / TESIS

Las frutas y hortalizas presentan compuestos bioactivos beneficiosos para la salud humana. El desarrollo de variedades con un mayor contenido en este tipo de compuestos es de interés, ya que contribuye a satisfacer una demanda creciente por parte de los consumidores por productos con propiedades funcionales. Dentro de las hortalizas, la berenjena (Solanum melongena) presenta una alta actividad antioxidante, fundamentalmente derivada de su alto contenido en polifenoles, y se ha demostrado que presenta efectos beneficiosos para la salud humana. Entre los compuestos fenólicos de la berenjena destaca el ácido clorogénico, ya que se trata del más abundante en este cultivo y presenta múltiples propiedades beneficiosas para la salud. Esta Tesis Doctoral trata de la caracterización y mejora de la berenjena para obtener información relevante y material vegetal para el desarrollo de variedades de berenjena con un mayor contenido en compuestos bioactivos, en particular polifenoles. Para ello utilizamos la variación intraespecífica e interespecífica. Por otra parte, en una mejora integral se debe tener en cuenta no solo el carácter a mejorar, sino también aquellos caracteres de interés para el éxito de una variedad, por lo que también hemos estudiado otros caracteres relacionados con el incremento del contenido en polifenoles, como puede ser el pardeamiento del fruto, y así como otros caracteres de interés general en mejora. En una primera parte de esta Tesis Doctoral nos centramos en el estudio de la diversidad en berenjena común y especies relacionadas para los caracteres objeto de esta tesis y también para caracteres de interés agronómico. El objetivo es evaluar la diversidad, identificar fuentes de variación y estudiar las relaciones entre caracteres. En un primer estudio, evaluamos una colección de variedades tradicionales de berenjena, en la cual hemos encontrado una alta diversidad para caracteres de calidad funcional y pardeamiento. En este estudio encontramos que el contenido en ácido clorogénico está correlacionado positivamente con la actividad antioxidante y que la correlación con el pardeamiento es baja, demostrando que es posible seleccionar variedades de berenjena con alto contenido en ácido clorogénico y pardeamiento moderado. También comprobamos que incluso con baja actividad polifenol oxidasa (PPO) se puede producir pardeamiento significativo, sugiriendo que la actividad PPO no es el factor limitante para el pardeamiento en la colección estudiada. Con objeto de ampliar la diversidad genética de la berenjena para la mejora de compuestos bioactivos y otros caracteres de importancia hemos estudiado la diversidad en una colección de berenjenas escarlata (S. aethiopicum) y gboma (S. macrocarpon). La caracterización morfológica mediante descriptores convencionales y herramientas fenómicas (Tomato Analyzer) nos ha permitido estudiar las relaciones entre los distintos grupos de cultivares y especies silvestres relacionadas y determinar que los complejos berenjena escarlata y gboma son hipervariables. En esta colección hemos estudiado también la actividad reductora y el contenido en ácido clorogénico, encontrado una enorme variabilidad. En general, la berenjena escarlata presenta contenidos relativamente bajos, mientras que la berenjena gboma, en particular su ancestro silvestre S. dasyphyllum, presentan valores muy elevados. También hemos comprobado en cultivos celulares de macrófagos que las variedades con mayor contenido en ácido clorogénico presentan una mayor inhibición de la producción de óxido nítrico (NO) indicando propiedades beneficiosas para la salud. En la segunda parte de la Tesis Doctoral hemos evaluado el interés de la hibridación interespecífica para la mejora de la berenjena, en particular para el contenido en compuestos bioactivos. Hemos obtenido dos familias, incluyendo retrocruzamientos, entre la berenjena común (S. melongena) por una parte y la berenjena escarlata cultivada (S. aethiopicum) y la especie silvestre S. incanum por otra. Los resultados muestran que la fertilidad de los materiales derivados de la hibridación entre S. melongena y S. aethiopicum es baja y que se obtiene una baja eficiencia en los retrocruzamientos hacia S. melongena. Además, el bajo contenido en polifenoles de S. aethiopicum se comporta como dominante. En cambio el retrocruzamiento hacia S. aethiopicum proporciona muchas plantas con mayores niveles de fertilidad. Sugerimos, por tanto, que S. melongena puede ser una fuente de variación para la mejora en contenido en polifenoles de la berenjena escarlata. La familia obtenida por hibridación interespecífica entre S. melongena y S. incanum mostró altos niveles de fertilidad y en el primer retrocruce hacia S. melongena se encuentran individuos morfológicamente similares a la Resumen berenjena cultivada. El estudio de los compuestos fenólicos mostró que S. incanum es una buena fuente de variación para la mejora de la berenjena común, con valores muy superiores a los de la especie cultivada. En el primer retrocruce se encuentran ya individuos con alto contenido en ácido clorogénico y pardeamiento moderado, lo cual sugiere que es posible introgresar exitosamente el alto contenido en ácido clorogénico de S. incanum en el fondo genético de la berenjena cultivada. En definitiva, los trabajos realizados en esta Tesis Doctoral aportan nuevo conocimiento sobre la diversidad y relaciones entre caracteres implicados en la calidad funcional de la berenjena y otros caracteres de interés en la mejora genética de este cultivo. Los materiales seleccionados y obtenidos son de gran interés para el desarrollo de variedades comerciales de berenjena con propiedades bioactivas mejoradas. / Plazas Ávila, MDLO. (2015). Caracterización y mejora genética de la berenjena (Solanum melongena) para compuestos bioactivos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48563 / TESIS