Los resultados de esta tesis doctoral han permitido profundizar en el reconocimiento y clasificación del linfoma de células del manto (MCL), basándonos en dos subtipos poco habituales. Por un lado, hemos estudiado las muestras de los pacientes de MCL que no presentan la traslocación principal t(11;14), característica que ha sido objeto de discusión al pensar que el diagnóstico de MCL podía no ser el correcto. Por otro lado, hemos estudiado los MCL con presentación clínica indolente, larga supervivencia, y que no requieren tratamiento durante largos períodos de tiempo, particularidad llamativa en los pacientes de MCL. En las dos primeras publicaciones de esta tesis hemos profundizado en el estudio de los MCL ciclina D1 negativos. Hemos demostrado que el factor de transcripción SOX11, además de sobreexpresarse en MCL ciclina D1 positivos, es un biomarcador útil para identificar los MCL ciclina D1 negativos. Además, caracterizamos genéticamente estos casos y mostramos que el 55% presenta traslocaciones de la CCND2 predominantemente con cadenas ligeras de los genes de las inmunoglobulinas. El perfil de alteraciones genómicas estudiado con arrays de alta densidad ha demostrado que las alteraciones genéticas secundarias entre los MCL ciclina D1 negativos y positivos son muy similares. Los casos de MCL ciclina D1 negativos tienen características clínicas y patológicas similares a los ciclina D1 positivos. Las translocaciones de CCND2 junto con la expresión de SOX11 son herramientas de diagnóstico muy útiles en la identificación de los MCL ciclina D1 negativos para que éstos puedan beneficiarse de los mismos protocolos terapéuticos usados en los MCL convencionales. En el tercer trabajo de esta tesis, nos hemos centrado en el reconocimiento del grupo de pacientes de MCL que no necesita tratamiento durante largos periodos de tiempo, idea que está modificando la manera de entender el MCL, ya que en general está considerado un linfoma agresivo que requiere un tratamiento inmediato. En este trabajo nos basamos en el estudio de Fernandez et al.1 en que se comparó un grupo de pacientes de MCL con comportamiento clínico indolente con un grupo de pacientes con MCL convencional (agresivo). Ambos grupos de muestras tenían un perfil de expresión global similar, sugiriendo que pertenecen a la misma enfermedad, pero también diferían en la expresión de una pequeña firma de 13 genes que estaba altamente expresada en los casos convencionales de MCL pero era negativa en los tumores de los pacientes con comportamiento indolente. Por lo que en el presente estudio, diseñamos y validamos un ensayo de PCR cuantitativa, seleccionando tres genes de la firma de perfil de expresión génica: SOX11, HDGFRP3 y DBN1 que permiten clasificar los casos en uno de estos dos grupos. El subgrupo con baja expresión de los tres genes incluye principalmente los pacientes con clínica indolente, afectación no-ganglionar, genes de las inmunoglobulinas hipermutados, y una supervivencia significativamente superior en comparación a los casos con expresión alta. Además, los MCL leucémicos sin afectación ganglionar y con alta expresión de los tres genes tienen una supervivencia significativamente inferior y un comportamiento clínico más agresivo que los pacientes con firma de expresión baja sin afectación ganglionar. En cuanto a las alteraciones genéticas, tanto los MCL con alta o baja expresión de los tres genes tenían una supervivencia significativamente inferior si presentan alteraciones en 17p. Por tanto, concluimos que la evaluación de la firma de los tres genes junto con el estudio de 17p/TP53 en muestras leucémicas puede ayudar a identificar un subgrupo particular de MCL y determinar la evolución clínica de estos los pacientes. Por tanto, estos estudios pueden proporcionar una evaluación más precisa del MCL y una ayuda en la decisión de tratamiento más adecuado para cada paciente. / In the first publication of this thesis we have studied the cyclin D1-negative mantle cell lymphomas (MCL). These cases are not well characterized due to the difficulties in their recognition. Overexpression of the transcription factor SOX11 has been observed in conventional MCL. In this study we demonstrated that SOX11 was highly expressed in cyclin D1-negative MCL, thus SOX11 expression is a highly specific marker for both cyclin D1-positive and negative MCL. In the second study we investigated 40 cyclin D1-negative MCL. Chromosomal rearrangements of CCND2 were detected in 55% of the cases and frequently with light chain immunoglobulin (IG) genes as partners. The genomic profile of the cyclin D1-negative cases analyzed by high resolution arrays were similar to the cyclin D1-positive MCL. This characterization of a large series of cyclin D1-negative MCL indicates that these tumors are clinically and biologically similar to the cyclin D1-positive MCL and provides a basis for the proper identification and clinical management of these patients. In the third publication, we studied the clinical and biological features of mantle cell lymphoma with a more indolent disease and long survival. The expression of 3 genes (SOX11, HDGFRP3, DBN1) selected from a gene expression signature distinguishing conventional an indolent MCL was studied in 68 leukemic MCL by quantitative PCR. An unsupervised analysis segregated two groups of MCL based on the expression levels of these genes. The tumors with low expression presented mainly with a non-nodal disease, had more frequently mutated IG, fewer genomic alterations, remained untreated more frequently and longer time, and had a better outcome than the tumors with high expression. The presence of 17p/TP53 alterations had an adverse effect on the outcome of both subgroups of MCL. The detection of the 3-gene signature may help to identify this particular subtype of MCL.

El melón (Cucumis melo) y el calabacín (Cucurbita pepo) son especies cucurbitáceas de gran importancia económica a nivel nacional y mundial. Para optimizar su producción se requiere de la obtención de nuevas variedades mejor adaptadas a los sistemas de cultivo, más resistentes frente a nuevas enfermedades o plagas y con mejores características organolépticas, que respondan a las cada vez mayores exigencias del mercado. La mejora debe realizarse de una forma eficiente y competitiva, apoyándose en los crecientes conocimientos genéticos en estas dos especies y en los últimos avances biotecnológicos. El desarrollo de herramientas genómicas con el fin de impulsar la mejora de estos cultivos es el principal objetivo de la presente Tesis doctoral. El desarrollo de marcadores moleculares es esencial para la construcción de mapas genéticos, para la realización de una selección más eficiente, para el análisis y cartografía de QTLs (Quantitative trait loci) y para el desarrollo de líneas de premejora, además de ser una herramienta fundamental para el análisis de la biodiversidad. En esta Tesis se han desarrollo y/o validado marcadores de alta calidad, de tipo microsatélite (Simple Sequence Repeats, SSRs) y SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), para estas dos especies. La generación de información de secuencia, necesaria para el desarrollo de este tipo de marcadores, ha cambiado en el transcurso de los trabajos presentados en la Tesis, habiéndose abordado finalmente la secuenciación del transcriptoma de melón mediante técnicas de secuenciación de alto rendimiento (NGS, Next generation sequencing). La obtención de grandes colecciones de SSRs y SNPs en ambas especies, resultado del ensamblaje de ESTs (Expressed Sequence Tags) procedentes de secuencias Sanger previamente disponibles y de las nuevas secuencias obtenidas por secuenciación masiva, ha supuesto un gran avance para estas especies no modelo, permitiendo la construcción de mapas más densos en melón y del primer mapa ba / Esteras Gómez, C. (2012). Desarrollo y aplicación de herramientas genómicas para la mejora de especies cucurbitáceas por calidad y resistencia a enfermedades [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/17046

Tesis por compendio / [EN] Eggplant (Solanum melongena L.) is one of the vegetables with highest content in phenolic compounds, giving eggplant a high antioxidant power and other bioactive beneficial health properties. This means that there is a growing demand among consumers concerned about a healthy diet. However, despite being a crop with a great economic importance worldwide, it is one of the least-studied Solanaceae (much less than tomato, pepper and potato), so it is necessary to carry out studies that contribute to the genetic improvement of eggplant to the commercial level so that the genetic diversity is increased and that is adapted to the demands of producers and consumers. The work carried out in this Thesis aims to obtain relevant information for the breeding programmes of eggplant through the study of genetic diversity and development and use of tools for the morphological characterization as well as increasing genetic diversity in élite germplasm for the development of programs aimed at obtaining high-value hybrids. For achieving this objective, commercial eggplant (semi-larga) black type, as well as other types, origins and varieties of local material are used. In the first part of the Thesis, we rely on the study of genetic diversity in S. melongena and the application of new tools to perform accurate morphological characterization and improve the process of selection of the breeding programs. This diversity studies have been conducted in three centres of origin side in different regions (Spain, Sri Lanka and China), in local materials of eggplant with different typologies, and new phenomic tools have been used for the morphological characterization of the fruit of the eggplant. In the second part of this work, we deal with the development of plant material to increase the genetic base of eggplant cultivars and with the implementation of various programmes for genetic improvement. For this we plan and develop different breeding programs according to different objectives, including the implementation of a programme of improvement of a local variety with protected geographical indication (IGP), and increasing the diversity and new "elite" material of black type eggplant through a program of genetic improvement. In summary, our work that shows that the study of the genetic diversity and the use of phenomics tools for morphological characterization, as well as the development of new plant material, is very useful for obtaining new varieties of eggplant as well as scientific and technical information of interest to other researchers and breeders. We have also found that "public-private research" interaction allows a synergistic collaboration in obtaining plant material and information of interest for vegetables breeding. / [ES] La berenjena (Solanum melongena L.) es una de las hortalizas más ricas en compuestos fenólicos, lo cual le confiere un alto poder antioxidante y otras propiedades bioactivas beneficiosas para la salud. Ello hace que haya una demanda creciente entre consumidores preocupados por una dieta saludable. Sin embargo, a pesar de ser un cultivo con una gran importancia económica a nivel mundial, es una de las solanáceas menos estudiadas (mucho menos que tomate, pimiento y patata), por lo que es necesario realizar estudios que contribuyan a la mejora genética de la berenjena a nivel comercial de forma que amplíen la diversidad genética y que permitan adaptarse a las demandas de productores y consumidores. El trabajo realizado en esta Tesis pretende obtener información relevante para los programas de mejora genética de berenjena mediante el estudio de la diversidad genética y el desarrollo y uso de herramientas para la caracterización morfológica, así como el aumento de la diversidad genética en el germoplasma élite de los programas de desarrollo de híbridos de alto valor. Para ello se utiliza material vegetal tanto de la berenjena comercial tipo negra (semi-larga), como material de otros tipos, orígenes y variedades locales. En una primera parte de la Tesis, nos basamos en el estudio de diversidad genética en S. melongena y en la aplicación de nuevas herramientas para realizar una caracterización morfológica precisa y mejorar el proceso de selección en los programas de mejora. Para ello se han realizado estudios de diversidad en tres centros de origen secundarios de distintas regiones (España, Sri Lanka y China), en materiales locales de berenjena con distintas tipologías, y se han utilizado nuevas herramientas fenómicas para la caracterización morfológica del fruto de la berenjena. Como segunda parte de este trabajo, abordamos el desarrollo de material vegetal para el incremento de la base genética de los cultivares de berenjena e implementación de distintos programas de mejora genética. Para ello se plantean y ejecutan diferentes programas de mejora según los objetivos explícitos, incluyendo la realización de un programa de mejora para una variedad local con Indicación Geográfica Protegida (IGP), e incrementando la diversidad y la obtención de nuevos materiales de élite de berenjena tipo negra mediante un programa de mejora genética. En definitiva, nos encontramos con un trabajo que muestra que el estudio de la diversidad genética y el desarrollo y utilización de herramientas fenómicas para la caracterización morfológica, además de la obtención de material vegetal nuevo, es de gran utilidad para el desarrollo de nuevas variedades de berenjena, así como para obtener información científico-técnica de interés para otros investigadores y mejoradores. También hemos constatado que la interacción "investigación pública-privada" permite una colaboración sinérgica en la obtención de material vegetal e información de interés en la mejora de hortícolas. / [CA] L'albergina (Solanum melongena L.) és una de les hortalisses més riques en compostos fenòlics, el que li confereix un alt poder antioxidant i altres propietats bioactives beneficioses per a la salut. Aquest fet fa que hi haja una demanda creixent entre els consumidors preocupats per una dieta saludable. No obstant això, a pesar de ser un cultiu amb una gran importància econòmica a nivell mundial, és una de les solanàcies menys estudiades (molt menys que tomaca, pimentó i creïlla) , per la qual cosa és necessari realitzar estudis que contribuïsquen a la millora genètica de l'albergina a nivell comercial de manera que amplien la diversitat genètica i que permeten adaptar-se a les demandes de productors i consumidors. El treball realitzat en esta Tesi pretén obtindre informació rellevant per als programes de millora genètica d'albergina per mitjà de l'estudi de la diversitat genètica i el desenvolupament i ús de ferramentes per a la caracterització morfològica, així com l'augment de la diversitat genètica en el germoplasma elit dels programes de desenvolupament d'híbrids d'alt valor. Per a això s'utilitza material vegetal tant de l'albergina comercial de tipus negra (semi-llarga), com material d'altres tipus, orígens i varietats locals. En una primera part de la Tesi, ens basem en l'estudi de diversitat genètica en S. melongena i en l'aplicació de noves ferramentes per a realitzar una caracterització morfològica precisa i millorar el procés de selecció en els programes de millora. Per a això s'han realitzat estudis de diversitat en tres centres d'origen secundaris de distintes regions (Espanya, Sri Lanka i Xina), en materials locals d'albergina amb distintes tipologies, i s'han utilitzat noves ferramentes fenòmiques per a la caracterització morfològica del fruit de l'albergina. Com a segona part d'este treball, abordem el desenvolupament de material vegetal per a l'increment de la base genètica dels cultivars d'albergina i implementació de distints programes de millora genètica. Per a això es plantegen i executen diferents programes de millora segons els objectius explícits, incloent la realització d'un programa de millora per a una varietat local amb Indicació Geogràfica Protegida (IGP), i incrementant la diversitat i l'obtenció de nous materials d'elit d'albergina tipus negra per mitjà d'un programa de millora genètica. En definitiva, ens trobem amb un treball que mostra que l'estudi de la diversitat genètica i el desenvolupament i utilització de ferramentes fenómiques per a la caracterització morfològica, a més de l'obtenció de material vegetal nou, és de gran utilitat per al desenvolupament de noves varietats d'albergina, així com per a obtindre informació cientificotècnica d'interés per a altres investigadors i milloradors. També hem constatat que la interacció "investigació pública-privada" permet una col·laboració sinèrgica en l'obtenció de material vegetal i informació d'interés en la millora d'hortícoles. / Hurtado Ricart, M. (2016). Mejora genética de la berenjena (S. melongena L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61386 / Compendio

Many countries in the global south - which harbour the majority of the world’s biodiversity - face serious resource limitations and a lack of access to affordable sequencing services. Furthermore, biodiversity research and monitoring of non-model, threatened and/or cryptic species often relies on low-quality non-invasive genetic samples. In situ conservation genomics approaches optimised for field conditions and low-quality DNA can help empower local researchers and meet their needs. To do so, however, accessible and reproducible sequencing and genotyping alternatives are needed. I designed a SNP panel as a field-friendly genotyping approach for two species of Amazonian primates using both high- and low-quality DNA samples, and two different sequencing platforms, Illumina and Nanopore. I used 14 high-quality genomes to identify a set of 210 SNPs that allow for identification of species (twelve SNPs), sex (twelve SNPs) and individual identity (186 SNPs) in two species of tamarins, Leontocebus weddelli and Saguinus imperator. Primers, adapters and indexes were designed in a Genotyping-in-Thousands by sequencing approach that is compatible with both sequencing platforms. This approach is based on sequencing multiplexed PCR products of a few hundred target SNPs to genotype thousands of individuals in a single sequencing run. In an effort to make conservation genomics more accessible, the reproducible pipeline to obtain the informative SNPs is being modulated with Snakemake, a workflow management system. / Muchos países en el sur global - los cuales poseen la mayoría de la biodiversidad mundial - enfrentan serias limitaciones de recursos y una falta de acceso a servicios económicos de secuenciación. Con frecuencia, la investigación y el monitoreo de biodiversidad y especies no-modelo, amenazadas y/o crípticas, dependen de muestras genéticas no-invasivas de baja calidad. La genómica de la conservación in situ optimizada para condiciones de campo y ADN de baja calidad puede empoderar a investigadorxs locales y ayudarles a responder a sus necesidades. Para ello, sin embargo, se requieren alternativas accesibles y reproducibles de secuenciación y genotipado. Diseñé un panel de SNPs como una aproximación de genotipado apta para el campo y dirigida a dos especies de primates amazónicos con el uso de ADN de baja y alta calidad, y dos plataformas de secuenciación (Illumina y Nanopore). Usé 14 genomas de alta calidad para encontrar 210 SNPs que permiten la identificación de la especie (doce SNPs), del sexo (doce SNPs) y de la identidad individual (186 SNPs) en dos especies de pichicos, Leontocebus weddelli y Saguinus imperator. Los cebadores, adaptadores e índices fueron diseñados con un enfoque de Genotyping-in-Thousands by sequencing (Genotipado en los miles por secuenciación) que es compatible con ambas plataformas de secuenciación. Este método está basado en la secuenciación de productos de PCR multiplexados de unos cientos de SNPs para genotipar miles de individuos en una sola corrida de secuenciación. En un intento de mejorar la accesibilidad de la genómica de la conservación, el proceso reproducible para obtener a los SNPs informativos está siendo modulado con Snakemake, un sistema de manejo de flujos de trabajo.

Tesis por compendio / [ES] La medicina actual se dirige hacia un enfoque más personalizado basándose en el diagnóstico molecular del paciente a través del estudio de biomarcadores específicos. Aplicando este principio molecular, el diagnóstico, pronóstico y selección de la terapia se apoyan en la identificación de variaciones específicas del genoma humano, como variaciones de un único nucleótido (SNV). Para detectar estos biomarcadores se dispone de una amplia oferta de tecnologías. Sin embargo, muchos de los métodos en uso presentan limitaciones como un elevado coste, complejidad, tiempos de análisis largos o requieren de personal y equipamiento especializado, lo que imposibilita su incorporación masiva en la mayoría de los sistemas sanitarios. Por tanto, existe la necesidad de investigar y desarrollar soluciones analíticas que aporten información sobre las variantes genéticas y que se puedan implementar en diferentes escenarios del ámbito de la salud con prestaciones competitivas y económicamente viables. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar estrategias innovadoras para resolver el reto de la detección múltiple de variantes genéticas que se encuentran en forma minoritaria en muestras biológicas de pacientes, cubriendo las demandas asociadas al entorno clínico. Las tareas de investigación se centraron en la combinación de reacciones de discriminación alélica con amplificación selectiva de DNA y el desarrollo de sistemas ópticos de detección versátiles. Con el fin de atender el amplio abanico de necesidades, en el primer capítulo, se presentan resultados que mejoran las prestaciones analíticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la incorporación de una etapa al termociclado y de un agente bloqueante amplificando selectivamente las variantes minoritarias que fueron monitorizadas mediante fluorescencia a tiempo real. En el segundo capítulo, se logró la discriminación alélica combinando la ligación de oligonucleótidos con la amplificación de la recombinasa polimerasa (RPA), que al operar a temperatura constante permitió una detección tipo point-of-care (POC). La identificación de SNV se llevó a cabo mediante hibridación en formato micromatriz, utilizando la tecnología Blu-Ray como plataforma de ensayo y detección. En el tercer capítulo, se integró la RPA con la reacción de hibridación alelo especifica en cadena (AS-HCR), en formato array para genotipar SNV a partir de DNA genómico en un chip. La lectura de los resultados se realizó mediante un smartphone. En el último capítulo, se presenta la síntesis de un nuevo reactivo bioluminiscente que se aplicó a la monitorización de biomarcadores de DNA a tiempo real y final de la RPA basada en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), eliminando la necesidad de una fuente de excitación. Todas las estrategias permitieron un reconocimiento especifico de la variante de interés, incluso en muestras que contenían tan solo 20 copias de DNA genómico diana. Se consiguieron resultados sensibles (límite de detección 0.5% variante/total), reproducibles (desviación estándar relativa < 19%), de manera sencilla (3 etapas o menos), rápida (tiempos cortos de 30-200 min) y permitiendo el análisis simultaneo de varios genes. Como prueba de concepto, estas estrategias se aplicaron a la detección e identificación en muestras clínicas de biomarcadores asociados a cáncer colorrectal y enfermedades cardiológicas. Los resultados se validaron por comparación con los métodos de referencia NGS y PCR, comprobándose que se mejoraban los requerimientos técnicos y la relación coste-eficacia. En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo posibilitaron desarrollar herramientas de genotipado con propiedades analíticas competitivas y versátiles, aplicables a diferentes escenarios sanitarios, desde hospitales a entornos con pocos recursos. Estos resultados son prometedores al dar respuesta a la demanda de tecnologías alternativas para el diagnóstico molecular personalizado. / [CA] La medicina actual es dirigeix cap a un enfocament més personalitzat basant-se en el diagnòstic molecular del pacient a través de l'estudi de biomarcadors específics. Aplicant aquest principi molecular, el diagnòstic, pronòstic i selecció de la teràpia es recolzen en la identificació de variacions específiques del genoma humà, com variacions d'un únic nucleòtid (SNV). Per a detectar aquests biomarcadors, es disposa d'una àmplia oferta de tecnologies. No obstant això, molts dels mètodes en ús presenten limitacions com un elevat cost, complexitat, temps d'anàlisis llargues o requereixen de personal i equipament especialitzat, la qual cosa impossibilita la seua incorporació massiva en la majoria dels sistemes sanitaris. Per tant, existeix la necessitat d'investigar i desenvolupar solucions analítiques que aporten informació sobre les variants genètiques i que es puguen implementar en diferents escenaris de l'àmbit de la salut amb prestacions competitives i econòmicament viables. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha sigut desenvolupar estratègies innovadores per a resoldre el repte de la detecció múltiple de variants genètiques que es troben en forma minoritària en mostres biològiques de pacients, cobrint les demandes associades a l'entorn clínic. Les tasques d'investigació es van centrar en la combinació de reaccions de discriminació al·lèlica amb amplificació selectiva de DNA i al desenvolupament de sistemes òptics de detecció versàtils. Amb la finalitat d'atendre l'ampli ventall de necessitats, en el primer capítol, es presenten resultats que milloren les prestacions analítiques de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant la incorporació d'una etapa al termociclat i d'un agent bloquejant amplificant selectivament les variants minoritàries que van ser monitoritzades mitjançant fluorescència a temps real. En el segon capítol, es va aconseguir la discriminació al·lèlica combinant el lligament d'oligonucleòtids amb l'amplificació de la recombinasa polimerasa (RPA), que en operar a temperatura constant va permetre una detecció tipus point-of-care (POC). La identificació de SNV es va dur a terme mitjançant hibridació en format micromatriu, utilitzant la tecnologia Blu-Ray com a plataforma d'assaig i detecció. En el tercer capítol, es va integrar la RPA amb la reacció d'hibridació al·lel específica en cadena (AS-HCR), en format matriu per a genotipar SNV a partir de DNA genòmic en un xip. La lectura dels resultats es va realitzar mitjançant un telèfon intel·ligent. En l'últim capítol, es presenta la síntesi d'un nou reactiu bioluminescent que es va aplicar al monitoratge de biomarcadors de DNA a temps real i final de la RPA basada en la transferència d'energia de ressonància de bioluminescència (BRET), eliminant la necessitat d'una font d'excitació. Totes les estratègies van permetre un reconeixement específic de la variant d'interès, fins i tot en mostres que només contenien 20 còpies de DNA genòmic diana. Es van aconseguir resultats sensibles (límit de detecció 0.5% variant/total), reproduïbles (desviació estàndard relativa < 19%), de manera senzilla (3 etapes o menys), ràpida (temps curts de 30-200 min) i permetent l'anàlisi simultània de diversos gens. Com a prova de concepte, aquestes estratègies es van aplicar a la detecció i identificació en mostres clíniques de biomarcadors associats a càncer colorectal i a malalties cardiològiques. Els resultats es van validar per comparació amb els mètodes de referència NGS i PCR, comprovant-se que es milloraven els requeriments tècnics i la relació cost-eficàcia. En conclusió, les investigacions dutes a terme van possibilitar desenvolupar eines de genotipat amb propietats analítiques competitives i versàtils, aplicables a diferents escenaris sanitaris, des d'hospitals a entorns amb pocs recursos. Aquests resultats són prometedors en donar resposta a la demanda de tecnologies alternatives per al diagnòstic molecular personalitzat. / [EN] Current medicine is moving towards a more personalized approach based on the patients' molecular diagnosis through the study of specific biomarkers. Diagnosis, prognosis and therapy selection, applying this molecular principle, rely on identifying specific variations in the human genome, such as single nucleotide variations (SNV). A wide range of technologies is available to detect these biomarkers. However, many of the employed methods have limitations such as high cost, complexity, long analysis times, or requiring specialized personnel and equipment, making their massive incorporation in most healthcare systems impossible. Therefore, there is a need to research and develop analytical solutions that provide information on genetic variants that can be implemented in different health scenarios with competitive and economically feasible performances. The main objective of this thesis has been to develop innovative strategies to solve the challenge of multiple detection of genetic variants that are found in a minority amount in patient samples, covering the demands associated with the clinical setting. Research tasks focused on the combination of allelic discrimination reactions with selective DNA amplification and the development of versatile optical detection systems. In order to meet the wide range of needs, in the first chapter, the analytical performances of the polymerase chain reaction (PCR) were improved by incorporating a thermocycling step and a blocking agent to amplify selectively minority variants that were monitored by real-time fluorescence. In the second chapter, allelic discrimination was achieved by combining oligonucleotide ligation with recombinase polymerase amplification (RPA), which operates at a constant temperature, allowing point-of-care (POC) detection. SNV identification was carried out by hybridization in microarray format, using Blu-Ray technology as the assay platform and detector. RPA was integrated with allele-specific hybridization chain reaction (AS-HCR), in an array format to genotype SNV from genomic DNA on a chip in the third chapter. The reading of the results was performed using a smartphone. In the last chapter, a new bioluminescent reagent was synthesized. It was applied to real-time and endpoint DNA biomarker monitoring based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), eliminating the need for an excitation source. All the strategies allowed specific recognition of the target variant, even in samples containing as few as 20 copies of target genomic DNA. Sensitive (limit of detection 0.5% variant/total), reproducible (relative standard deviation < 19%), simple (3 steps or less), fast (short times of 30-200 min) results were achieved, allowing simultaneous analysis of several genes. As proof of concept, these strategies were applied to detect and identify biomarkers associated with colorectal cancer and cardiological diseases in clinical samples. The results were validated by comparison with reference methods such as NGS and PCR, proving that the technical requirements and cost-effectiveness were improved. In conclusion, the developed research made it possible to develop genotyping tools with competitive analytical properties and versatile, applicable to different healthcare scenarios, from hospitals to limited-resource environments. These results are promising since they respond to the demand for alternative technologies for personalized molecular diagnostics. / The authors acknowledge the financial support received from the Generalitat Valenciana PROMETEO/2020/094, GRISOLIA/2014/024 PhD Grant and GVA-FPI-2017 PhD grant, the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO projects CTQ2016-75749-R and PID2019-110713RB-I00 and European Regional Development Fund (ERDF). / Lázaro Zaragozá, A. (2022). Study of Strategies for Genetic Variant Discrimination and Detection by Optosensing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185216 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] Hemos utilizado descriptores convencionales y digitales para caracterizar germoplasma español, con el fin de evaluar la variabilidad y probar la eficiencia de esos métodos para diferenciar los materiales. Los resultados muestran gran diversidad dentro de la colección. Además, el fenotipado digital fue capaz de proporcionar una separación más potente. Finalmente, se seleccionó un subconjunto 17 descriptores capaz de distinguir entre accesiones, explicando el 81.81% de la varianza total. Los rasgos del fruto son los más relevantes para la separación entre variedades. Estos hallazgos serán útiles para la recuperación de las variedades tradicionales y el manejo del germoplasma. Las variedades tradicionales más apreciadas de México poseen una aptitud extraordinaria para ser usados como materiales de pre-mejora. Por lo tanto, nos propusimos estudiar la diversidad fenotípica y genotípica de estos materiales, así como el efecto de la polinización abierta en la fijación de las características. La caracterización morfológica y genética de la progenie mostró niveles similares de uniformidad y heterocigocidad a aquellos mostrados por las líneas parentales, sugiriendo que el sistema de reproducción por polinización abierta es eficiente en términos de alcanzar uniformidad agronómica, preservando un cierto grado de diversidad genética. Los estudios genéticos del germoplasma aportan información de gran utilidad. Se utilizó el GBS para estudiar una colección de Capsicum spp. española con el fin de arrojar luz sobre las relaciones filogenéticas de las variedades locales y evaluar su diversidad. Las accesiones europeas mostraron estar estrechamente relacionadas. Además, el origen y tipo de fruto fueron los principales factores que determinaron estructura genética. Los estudios de filogenia también mostraron una estrecha relación entre las accesiones española y mexicana. Los valores Tajima D fueron consistentes con selección positiva en los grupos de C. annuum relacionados con la domesticación. C. baccatum surge como una importante fuente de variabilidad genética y proporcionando a los investigadores la oportunidad de seleccionar individuos para ser introducidos en programas de mejora para el contenido en compuestos bioactivos y resilientes a las condiciones del cambio climático. Por ello, decidimos caracterizar una colección de C. baccatum y C. annuum. Se observó una gran influencia del sistema de cultivo sobre el contenido nutricional donde las concentraciones vieron favorecidas bajo cultivo al aire libre. Asimismo, las accesiones control de C. annuum mostraron concentraciones superiores para la mayoría de compuestos para los dos ambientes. Por otro lado, la buena respuesta C. baccatum demuestra que existe la posibilidad de mejorar estos materiales bajo las condiciones mediterráneas y un alto contenido en compuestos bioactivos. Por último, bajo nuestras condiciones, una ración de pimiento puede aportar entre un 70% y un 120% de la dosis diaria recomendada de ácido ascórbico y entre un 10% y un 60% de la dosis recomendada de minerales. La mejora de las variedades de pimiento para la absorción y uso del fósforo es de suma importancia en la tarea actual de reducir significativamente la necesidad de fertilizantes. El objetivo de este trabajo fue caracterizar una colección de pimiento frente a bajos insumos de fósforo. En general, las condiciones de estrés condujeron a una reducción significativa de la biomasa. Además, el tratamiento de bajo fósforo estimuló el desarrollo de la raíz lateral y pelos radiculares. Además, la concentración de fósforo en los tejidos vegetales disminuyó significativamente. Esta respuesta fue notoriamente superior en las raíces, mostrando la capacidad de movilizar el fósforo hacia otros órganos. Esto proporciona evidencias de la existencia de variabilidad dentro de Capsicum para la eficiencia del uso del fósforo susceptible de ser utilizada en lo / [CA] Hem utilitzat descriptors convencionals i digitals per a caracteritzar una col·lecció de varietats espanyoles, amb la finalitat d'avaluar la variabilitat i provar l'eficiència d'aqueixos mètodes per a diferenciar els materials. Els resultats mostren una gran diversitat dins de la col·lecció. A més, el fenotipat digital va permetre una separació més potent. Finalment, es va seleccionar un subconjunt de 17 descriptors digitals per a distingir entre accessions, explicant el 81.81% de la variància total. Els trets del fruit són els més rellevants per a la separació entre varietats. Aquestes troballes seran útils per a la recuperació de les varietats tradicionals i el maneig del germoplasma. Moltes de les varietats tradicionals més benvolgudes es poden trobar a Mèxic y posseeixen una aptitud extraordinària per a ser usats com a materials de pre-millora. Per tant, ens vam proposar estudiar la diversitat fenotípica i genotípica d'aquests materials, així com l'efecte de la pol·linització oberta en la fixació de les característiques morfològiques i en la fixació genètica. La caracterització morfològica y genètica va mostrar nivells similars d'uniformitat de la progènie a aquells mostrats per les línies parentals, sugerint que la reproducció de pol·linització oberta és eficient en termes d'aconseguir uniformitat agronòmica i alhora preservant un cert grau de diversitat genètica, un fet d'enorme rellevància per a l'adaptació a les condicions de canvi climàtic. Els estudis genètics del germoplasma existent aporten informació de gran utilitat. En la present tesi es va utilitzar el GBS per a estudiar una col·lecció de Capsicum spp. amb la finalitat de llançar llum sobre les relacions filogenètiques de les varietats locals i avaluar la seua diversitat i estructura. Les accessions europees estaven estretament relacionades. A més, les característiques dels fruits i l'origen van ser els principals factors que van determinar la l'estructura genètica. Els estudis de filogènia també van mostrar una estreta relació entre les accessions espanyola i mexicana. Els valors del mètode estadístic Tajima D van ser consistents amb la selecció positiva en els grups de C. annuum relacionats amb la domesticació. C. baccatum sorgeix com una important font de variabilitat i proporcionant l'oportunitat de seleccionar individus per a programes de millora per al contingut en compostos bioactius i condicions del canvi climàtic. Ací es va caracteritzar una col·lecció de C. baccatum i C. annuum. Es va observar una gran influència del sistema de cultiu, on les compostos es van veure afavorides baix cultiu a l'aire lliure. C. annuum van mostrar concentracions superiors per a la majoria de compostos. La bona resposta de C. baccatum demostra que existeix la possibilitat de millorar aquests materials de cara a obtindre individus adaptats a les condicions mediterrànies i un alt contingut en compostos bioactius. Per ultime, sota les nostres condicions, una ració de pimentó pot aportar entre un 70% i un 120% de la dosi diària recomanada d'acidifique ascòrbic i entre un 10% i un 60% de la dosi recomanada de minerals. La millora de les varietats de pimentó per a l'absorció i ús del fòsfor és de suma importància en la tasca actual de reduir la necessitat de fertilitzants. L'objectiu va ser caracteritzar una col·lecció de pimentó enfront de baixos inputs de fòsfor. En general, les condicions d'estrés van conduir a una reducció de la biomassa. A més, va estimular el desenvolupament de l'arrel lateral i de pèls radiculars. A més, la concentració de fòsfor en els teixits vegetals va disminuir significativament. Aquesta resposta va ser notòriament superior en les arrels, mostrant la capacitat de mobilitzar el fòsfor acumulat cap a altres òrgans. Això proporciona evidències de l'existència de variabilitat dins de Capsicum per a l'eficiència de l'ús del fòsfor susceptible de ser utilitzada en / [EN] Herein we used conventional and digital descriptors to characterize a collection Spanish landraces in order to assess the diversity and to test the discriminating ability of said methods. A considerable variation was found for the collection. Digital phenotyping enabled a more powerful separation. We conclude by selecting a subset of 17 descriptors which enable to distinguish among closely related C. annuum accessions. Finally, fruit traits explained the highest percentage of variance for our collection. These findings will be useful to the recovery of heirloom peppers and will boost germplasm characterization and management in seed banks. Some of the most known landraces from Mexico encompass a remarkable aptitude to be used as pre-breeding materials. Hence, we studied the phenotypic and genotypic diversity within these materials and the open-pollination effect on the fixation of morphological characteristics and on the genetic fixation. Morphological and genetic analysis of the progeny showed similar or lower levels of genetic and morphological uniformity than those from progenitors, suggesting that open-pollinated program is efficient in terms of reaching enough agronomic uniformity, while preserving a certain degree of genetic diversity, of paramount importance for the adaptation to climate change. Germplasm genetic studies provide vital information. Herein we used GBS to study a Spanish collection of Capsicum spp. to shed light into phylogenetic relationships and to evaluate their diversity and structure. European accessions showed a close relationship. Furthermore, fruit traits and region of origin were the main factors defining population structure. Spanish and Mexican accessions showed a close phylogenetic relationship; Finally, Tajima's D statistic values were consistent with positive selection in the C. annuum clusters related to domestication. These findings provide relevant information on the origin and relationships of Spanish landraces and for future association mapping studies in pepper. C. baccatum represents a remarkable genetic pool that provides opportunity to select superior individuals to be used in breeding programs for improved bioactive compounds content and resilience to climate change materials. Hence, we characterized a collection of C. baccatum and C. annuum materials. Cultivation system had a major effect controlling fruit's nutrient profile. C. annuum controls presented higher concentrations for most compounds under both conditions. The good performance of C. baccatum accessions shows that there are opportunities to breed materials adapted to the Mediterranean conditions and with interesting properties, especially under open-field conditions. Finally, under our conditions, a serving of pepper cultivated could provide between 70% and 120% of the recommended dietary allowance for ascorbic acid and between 10% and 60% for minerals. Improving pepper varieties for their uptake and use of phosphorus would significantly reduce the need for fertilizer applications. Hence, we characterized the main adaptations, of a Capsicum spp. collection, to low phosphorus inputs. Overall, stress conditions lead to significant reduction of biomass. Stress treatment stimulated lateral root length and root hairs growth. Furthermore, concentration of this mineral in plant tissues decreased significantly. This response was notoriously higher in the roots, demonstrating a high ability to mobilise accumulated phosphorus to other plant organs, providing evidence that within the Capsicum genus there is usable variability for phosphorus use efficiency for breeding programs for low input adaptation. / Pereira Dias, L. (2019). Study and exploitation of varietal diversity for agroclimatic adaptation and nutritional content improvement in Capsicum spp [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/134055 / Compendio