El limfoma de cèl•lules del mantell (LCM) és una neoplàsia heterogènia en relació a les característiques clíniques, biològiques i moleculars que presenten els pacients. La morfologia, l’immunofenotip i el genotip no són suficients per explicar aquesta gran diversitat. Encara que es considera una neoplàsia agressiva alguns pacients segueixen un curs clínic indolent sense la necessitat de tractament en el moment del diagnòstic i presenten una supervivència llarga. Els resultats d’aquesta tesi demostren que els LCM amb elevada càrrega mutacional en els gens de les immunoglobulines (IGHV)(<97% d’identitat amb la línia germinal) utilitzen preferencialment certes famílies de gens IGHV, suggerint la presència de processos de selecció antigènica com a mecanisme de patogènesi d’aquesta neoplàsia i donant importància a la caracterització del receptor de les cèl•lules B (BCR). Els LCM amb gens IGHV mutats (M-LCM) presenten una menor complexitat genòmica, són preferencialment negatius per a l’expressió del factor de transcripció SOX11 i presenten afectació ganglionar amb més freqüència que els casos sense mutacions (U-LCM). Per altra banda, el perfil d’expressió gènica entre casos amb i sense mutacions en els gens IGHV, també mostra expressió diferencial de programes cel•lulars relacionats amb poblacions de cèl•lules B normals incidint amb la ontogènia d’ambdós grups. El perfil d’expressió de microRNAs també permet diferenciar entre dos grups de pacients amb diferent supervivència, reforçant la idea de la presència de dos subgrups que pertanyen a una mateixa entitat. La identificació i la correcte identificació d’aquests pacients de limfoma de cèl•lules del mantell són rellevants per al posterior maneig i tractament dels mateixos. / Mantle cell lymphoma is a malignant and heterogeneous disease regarding the clinical, biological and molecular characteristics presented by patients, all of them with the translocation t(11;14) and CCND1 overexpression. Although is considered an aggressive neoplasm some patients follow and indolent clinical course without treatment at the time of diagnosis and long survival. The results of this studies demonstrate that LCM with high mutational load in the immunoglobulins genes (IGHV) (<97% of identity with the germ line) use preferentially specific IGHV gene families, suggesting the presence of antigenic selection process as a mechanism of pathogenesis of this neoplasm and giving importance to the characterization of the B cell receptor. The LCM cases with IGHV mutated genes (M-LCM) present less genomic complexity are preferentially negative for the expression of the transcriptor factor SOX11 and also present lymphadenopathies more frequently compared with the IGHV unmutated cases (U-LCM). Furthermore, the gene expression profile between cases with and without IGHV mutations also shows differential expression of cellular programs related to normal B cell populations maybe related with the ontogeny for both groups. The expression profile of microRNAs also differentiates between two groups of patients with different survival and other molecular characteristics, reinforcing the idea of the presence of two subgroups that belong to the same entity. The correct identification and classification of these patients are relevant for subsequent handling and treatment of the patients.

Los resultados de esta tesis doctoral han permitido profundizar en el reconocimiento y clasificación del linfoma de células del manto (MCL), basándonos en dos subtipos poco habituales. Por un lado, hemos estudiado las muestras de los pacientes de MCL que no presentan la traslocación principal t(11;14), característica que ha sido objeto de discusión al pensar que el diagnóstico de MCL podía no ser el correcto. Por otro lado, hemos estudiado los MCL con presentación clínica indolente, larga supervivencia, y que no requieren tratamiento durante largos períodos de tiempo, particularidad llamativa en los pacientes de MCL. En las dos primeras publicaciones de esta tesis hemos profundizado en el estudio de los MCL ciclina D1 negativos. Hemos demostrado que el factor de transcripción SOX11, además de sobreexpresarse en MCL ciclina D1 positivos, es un biomarcador útil para identificar los MCL ciclina D1 negativos. Además, caracterizamos genéticamente estos casos y mostramos que el 55% presenta traslocaciones de la CCND2 predominantemente con cadenas ligeras de los genes de las inmunoglobulinas. El perfil de alteraciones genómicas estudiado con arrays de alta densidad ha demostrado que las alteraciones genéticas secundarias entre los MCL ciclina D1 negativos y positivos son muy similares. Los casos de MCL ciclina D1 negativos tienen características clínicas y patológicas similares a los ciclina D1 positivos. Las translocaciones de CCND2 junto con la expresión de SOX11 son herramientas de diagnóstico muy útiles en la identificación de los MCL ciclina D1 negativos para que éstos puedan beneficiarse de los mismos protocolos terapéuticos usados en los MCL convencionales. En el tercer trabajo de esta tesis, nos hemos centrado en el reconocimiento del grupo de pacientes de MCL que no necesita tratamiento durante largos periodos de tiempo, idea que está modificando la manera de entender el MCL, ya que en general está considerado un linfoma agresivo que requiere un tratamiento inmediato. En este trabajo nos basamos en el estudio de Fernandez et al.1 en que se comparó un grupo de pacientes de MCL con comportamiento clínico indolente con un grupo de pacientes con MCL convencional (agresivo). Ambos grupos de muestras tenían un perfil de expresión global similar, sugiriendo que pertenecen a la misma enfermedad, pero también diferían en la expresión de una pequeña firma de 13 genes que estaba altamente expresada en los casos convencionales de MCL pero era negativa en los tumores de los pacientes con comportamiento indolente. Por lo que en el presente estudio, diseñamos y validamos un ensayo de PCR cuantitativa, seleccionando tres genes de la firma de perfil de expresión génica: SOX11, HDGFRP3 y DBN1 que permiten clasificar los casos en uno de estos dos grupos. El subgrupo con baja expresión de los tres genes incluye principalmente los pacientes con clínica indolente, afectación no-ganglionar, genes de las inmunoglobulinas hipermutados, y una supervivencia significativamente superior en comparación a los casos con expresión alta. Además, los MCL leucémicos sin afectación ganglionar y con alta expresión de los tres genes tienen una supervivencia significativamente inferior y un comportamiento clínico más agresivo que los pacientes con firma de expresión baja sin afectación ganglionar. En cuanto a las alteraciones genéticas, tanto los MCL con alta o baja expresión de los tres genes tenían una supervivencia significativamente inferior si presentan alteraciones en 17p. Por tanto, concluimos que la evaluación de la firma de los tres genes junto con el estudio de 17p/TP53 en muestras leucémicas puede ayudar a identificar un subgrupo particular de MCL y determinar la evolución clínica de estos los pacientes. Por tanto, estos estudios pueden proporcionar una evaluación más precisa del MCL y una ayuda en la decisión de tratamiento más adecuado para cada paciente. / In the first publication of this thesis we have studied the cyclin D1-negative mantle cell lymphomas (MCL). These cases are not well characterized due to the difficulties in their recognition. Overexpression of the transcription factor SOX11 has been observed in conventional MCL. In this study we demonstrated that SOX11 was highly expressed in cyclin D1-negative MCL, thus SOX11 expression is a highly specific marker for both cyclin D1-positive and negative MCL. In the second study we investigated 40 cyclin D1-negative MCL. Chromosomal rearrangements of CCND2 were detected in 55% of the cases and frequently with light chain immunoglobulin (IG) genes as partners. The genomic profile of the cyclin D1-negative cases analyzed by high resolution arrays were similar to the cyclin D1-positive MCL. This characterization of a large series of cyclin D1-negative MCL indicates that these tumors are clinically and biologically similar to the cyclin D1-positive MCL and provides a basis for the proper identification and clinical management of these patients. In the third publication, we studied the clinical and biological features of mantle cell lymphoma with a more indolent disease and long survival. The expression of 3 genes (SOX11, HDGFRP3, DBN1) selected from a gene expression signature distinguishing conventional an indolent MCL was studied in 68 leukemic MCL by quantitative PCR. An unsupervised analysis segregated two groups of MCL based on the expression levels of these genes. The tumors with low expression presented mainly with a non-nodal disease, had more frequently mutated IG, fewer genomic alterations, remained untreated more frequently and longer time, and had a better outcome than the tumors with high expression. The presence of 17p/TP53 alterations had an adverse effect on the outcome of both subgroups of MCL. The detection of the 3-gene signature may help to identify this particular subtype of MCL.

El limfoma de cèl•lules de mantell (MCL) i la leucèmia limfàtica crònica (CLL) són dues neoplàsies limfoides fins al moment incurables, per la qual cosa requereixen la recerca de nous fàrmacs. La identificació de noves dianes terapèutiques per al MCL i la CLL, i del mecanisme molecular d’actuació d’aquests fàrmacs en aquestes neoplàsies, té una gran rellevància translacional. El concepte de medicina personalitzada està basat en l’ús de teràpies dirigides a través d’un coneixement profund dels mecanismes moleculars d’acció d’aquests agents. Amb l’augment del coneixement sobre l’etiologia del càncer, s’han descobert noves dianes alterades específicament en les cèl•lules tumorals. Entre elles, la sobreexpressió de les HDACs, que provoca un estat epigenètic aberrant a la cèl•lula. Això ha motivat el desenvolupament del vorinostat, un inhibidor de les HDACs. Els resultats obtinguts demostren el vorinostat és efectiu i selectiu per a les cèl•lules tumorals de MCL. A nivell molecular, el vorinostat en el MCL indueix l’acetilació de les histones de la regió promotora dels gens de les proapoptòtiques de la família de Bcl-2 BH3-only BIM, BMF i NOXA, que són activats transcripcionalment. Totes tres proteïnes, Bmf, Bim i Noxa, cooperen en el procés d’apoptosi. A més, el vorinostat és sinèrgic amb l’agent que mimetitza les BH3-only, ABT-263. En els últims anys, s’ha identificat un gran nombre de cinases, que regulen moltes vies de supervivència i proliferació cel•lulars, que estan específicament activades i sobreexpressades en cèl•lules tumorals. En particular, recentment les cinases associades al receptor de cèl•lules B (BCR) han esdevingut un focus d’atenció important, ja que està activament implicat en la patogènesi de les neoplàsies limfoides. En aquesta tesi, hem analitzat l’efecte anti-tumoral de l’inhibidor multi-cinasa sorafenib en la CLL i el MCL. Els nostres resultats confirmen que el sorafenib indueix apoptosi selectiva en cèl•lules de CLL i de MCL, fins i tot en els casos de més mal pronòstic de la CLL. A nivell molecular, els nostres resultats han demostrat que el sorafenib indueix una desfosforilació ràpida, sostinguda i simultània de les cinases associades al BCR, Syk i de la família Src cinases. En la CLL i el MCL a temps d’incubació molt curts, el sorafenib provoca una disminució traduccional de l’anti-apoptòtica Mcl-1 alhora que de ciclina D1, sobreexpressada en el MCL. Tant Mcl-1 com ciclina D1 participen en l’apoptosi induïda per sorafenib, la disminució de Mcl-1 altera directament els senyals anti-apoptòtics, mentre que el sorafenib, a més de disminuir els nivells de ciclina D1, també allibera Bax del segrestament per part de ciclina D1, finalment activant mecanismes d’apoptosi caspasa-dependents i independents com AIF. El sorafenib també modula les interaccions del microambient amb la CLL i el MCL. En aquest sentit, s’ha demostrat que el sorafenib bloqueja la migració induïda per la quimiocina CXCL12 via inhibició de FAK, una cinasa substrat de Src que regula i promou la invasió. El complex Src-FAK afecta múltiples proteïnes, com ara les del citoesquelet d’actina. En consistència, el sorafenib bloqueja la reorganització del citoesquelet en cèl•lules de MCL estimulades amb CXCL12. Les cèl•lules estromals del microambient dels teixits, com ara el moll d’os i els teixits limfoides secundaris, interaccionen amb el tumor i en promouen el seu creixement i resistència a fàrmacs. En aquest context, s’ha demostrat que, en presència de l’estroma del microambient, les cèl•lules de MCL i CLL esdevenen resistents als agents quimioterapèutics habituals i el sorafenib és capaç de resensibilitzar-les. Tant la proliferació com l’activació del BCR en la CLL són majors en el gangli limfàtic que en sang. En aquest sentit, s’ha demostrat que el sorafenib és més efectiu en cèl•lules de CLL derivades de gangli limfàtic que les respectives derivades de moll d’os i de sang perifèrica. L’estimulació del BCR en la CLL també provoca la secreció de les citocines atraients de cèl•lules accessòries CCL3 i CCL4, que el sorafenib bloqueja amb eficiència. Globalment, els treballs que constitueixen aquesta tesi doctoral suposen una contribució important en el coneixement del mecanisme molecular d’acció del vorinostat i el sorafenib, fàrmacs nous que podrien ser efectius per al tractament d’aquestes dues entitats, el MCL i la CLL. / Mantle cell lymphoma (MCL) and chronic lymphocytic leukemia (CLL) are two incurable B-lymphoid malignancies, thus new therapeutic strategies are required. In the recent years, anti-tumor therapy has focused on pathways specifically altered in cancer cells. Among them, overexpression of histone deacetylases (HDACs) is a common feature. This led to the development of the HDAC inhibitor vorinostat. This thesis has shown that vorinostat could become a new therapeutic approach for MCL. The results show that vorinostat is effective and selective for MCL cells. The molecular mechanism of action of vorinostat involves acetylation of the histones in the gene promoter of the pro-apoptotic BH3-only from Bcl-2 family, BMF, BIM and NOXA, which induces its transcriptional activation. The respective proteins cooperate in the apoptosis induction. Moreover, vorinostat synergizes with the BH3-only mimetic ABT-263 in MCL. Plenty of kinases that have been recognized to regulate survival and proliferation pathways are overexpressed in tumor cells. In this work, we analyzed the anti-tumor effect of sorafenib, a multi-kinase inhibitor approved by the FDA, in CLL and MCL. Sorafenib induces selective apoptosis in CLL and MCL cells, being also effective in poor prognosis cases of CLL. At the molecular level, sorafenib dephosphorylates the B-cell receptor (BCR) associated kinases, specifically Syk and the Src family kinases. In CLL and MCL, sorafenib inhibits Mcl-1 and cyclin D1 translation. Mcl-1 downregulation is directly impairing anti-apoptotic signals. As for cyclin D1, sorafenib releases Bax from cyclin D1 sequestering. Both processes are involved in apoptosis induction, which occurs through caspase-dependent and independent mechanisms. In addition, sorafenib blocks CXCL12-induced migration and actin polymerization via FAK inhibition, a Src kinase substrate that regulates migration. Stromal cells from the microenvironment interact with and promote tumor growth and drug resistance. In this context, MCL and CLL cells become resistant to conventional chemotherapeutic drugs in the presence of stromal microenvironment, which is counteracted by sorafenib. Activation of the BCR and proliferation in CLL cells is higher in the lymph node microenvironments, a setting where sorafenib has been demonstrated to be more effective. BCR stimulation also leads to CCL3 and CLL4 chemoattractant cytokines secretion in CLL, that sorafenib blocks efficiently. Overall, this thesis is an important contribution to the understanding of the molecular mechanism of action of vorinostat and sorafenib, new drugs that might be effective for the treatment of these two entities, MCL and CLL.