Doctor en Farmacología / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento en el Repositorio Académico, hasta diciembre de 2016 / Los astrocitos responden a un estímulo inflamatorio modificando su morfología y su patrón de expresión génica y participando en la formación de la cicatriz glial, en el caso de lesión traumática. La cicatriz glial se relaciona con la generación de un ambiente no permisivo para la regeneración axonal, el que contiene además moléculas responsables de la pobre reparación existente en el sistema nervioso central. Entre estas moléculas destacan los proteoglicanos de Condroitin sulfato secretado por los astrocitos que forman la cicatriz glial, la proteína Nogo presente en la membrana de los oligodendrocitos y, muy importantemente para este estudio, la glicoproteína Thy-1, presente en la superficie neuronal. Por muchos años, nuestro laboratorio ha estado enfocado en estudiar las funciones y modo de señalización de Thy-1, proteína anclada por un tallo glicosilfosfatidil inositol a la cara externa de la membrana plasmática. Evidencias indican que Thy-1 participa en la inhibición del crecimiento axonal y en mediar interacciones célula - célula. Hemos mostrado además que el efecto de Thy-1 ocurre por medio de dos receptores, la Integrina αvβ3 y Sindecán-4 presentes en los astrocitos de línea DITNC1. La interacción de Thy-1 con sus receptores por tiempos cortos induce un aumento de la adhesión de los astrocitos, mientras que la estimulación prolongada con Thy-1 induce la migración de estas células. La interacción de Thy-1 con sus receptores induce en los astrocitos la activación de cascadas transduccionales que llevan al aumento en la actividad, temporalmente diferenciado, de las GTPasas RhoA y Rac1 entre otros. Además Thy-1 induce la salida de ATP desde el astrocito que resulta en la activación del receptor P2X7 y la entrada de calcio extracelular. Se sabe que estas señales son necesarias para la adhesión de estas células; sin embargo, ¿Cómo sale el ATP de los astrocitos en respuesta a Thy-1? ¿Se requiere de este ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7 para la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1? Son preguntas que buscamos responder en este trabajo. Por otro lado, resultados de nuestro laboratorio muestran que, contrario a lo encontrado para los astrocitos DITNC1, astrocitos de cultivo primario no responden a Thy-1 y expresan niveles muy bajos de la Integrina β3. Además, se ha descrito que astrocitos primarios aumentan la expresión de esta Integrina en condiciones de daño por derrame cerebral. Dado que los astrocitos sufren cambios morfológicos y migran en condiciones proinflamatorias para reparar el daño, es posible que las diferentes respuestas observadas en los astrocitos primarios y los de línea celular frente al estímulo de Thy-1 se deban a los distintos niveles de integrina expresada por ambos tipo de células. Por lo tanto, en este estudio proponemos que la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1 requiere de la salida del ATP al espacio extracelular – por mecanismos aún por dilucidar – y de la activación del receptor P2X7. Además, que la baja expresión de la Integrina β3 no permite a los astrocitos de cultivo primario responder a Thy-1. Para estudiar la salida de ATP desde el astrocito y qué vías están involucradas se realizaron mediciones de ATP extracelular por técnicas de luminiscencia, incorporación de sondas fluorescentes a las células, medición de cinéticas de calcio intracelular, entre otras. Para evaluar los requerimientos en la migración inducida por Thy-1 se llevaron a cabo ensayos de cierre de herida y ensayos de polaridad celular. La participación de las distintas moléculas en los mecanismos estudiados se analizó con el uso de inhibidores farmacológicos, bloqueadores de canales o antagonistas de receptores, también se utilizó herramientas de modificación de la expresión génica de las moléculas estudiadas. Para monitorear la respuesta de los astrocitos primarios al estímulo de Thy-1, se realizó cultivos de astrocitos corticales, los que fueron tratados o no con citoquinas proinflamatorias como TNFα. Se analizó cambios de expresión de la Integrina β3 por Western Blot frente a este tratamiento. La respuesta migratoria de los astrocitos tratados con o sin TNFα, frente al estímulo de Thy-1 se realizó por ensayo de cierre de herida en distintas condiciones, como silenciando o sobreexpresando la Integrina β3. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que Thy-1 induce la salida de ATP, requiriendo la presencia de ambos sitios de interacción con sus receptores. Mutación en el sitio de unión a integrinas anula completamente la respuesta, mientras que la mutación en el sitio de unión a Sindecán-4 disminuye y retrasa la respuesta. Se demuestra en este trabajo que la salida de ATP ocurre a través de los hemicanales Conexina 43 y Panexina 1, abriéndose estos hemicanales por medio de un mecanismo que requiere de aumentos de calcio intracelular proveniente del retículo endoplásmico y que sale al citoplasma a través del receptor de IP3R. La salida de ATP es necesaria para el aumento en el área promedio de la adhesión focal y el aumento en el número de adhesiones focales por célula inducida por estimulaciones cortas con Thy-1. Estimulaciones prolongadas llevan a un aumento en la polaridad celular y en la migración de los astrocitos DITNC1, efecto que también requiere de la apertura de hemicanales, la presencia de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. La estimulación de los astrocitos con BzATP, agonista del receptor P2X7, a altas concentraciones estimula la migración celular, mientras que bajas concentraciones, por si solas, no provocan este efecto. Sin embargo, nuestros estudios muestran que frente a una estimulación concomitante de Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina y BzATP a bajas concentraciones es suficiente para inducir la migración de los astrocitos DITNC1 sugiriendo que el aumento extracelular de ATP requiere de la actividad del sitio de unión a Integrina de Thy-1. Estos resultados indican además que la activación del receptor P2X7 por ATP (o BzATP) y la ruta activada río debajo de la interacción de Thy-1 con probablemente Síndecan-4 (Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina posee sitio de unión a heparina intacto) son necesarias para inducir la migración de los astrocitos. Los astrocitos de cultivo primario cambiaron su fenotipo tras ser expuestos a la citoquina pro-inflamatoria TNFα, aumentando la expresión de las proteínas Integrina β3, GFAP y receptor P2X7, lo que permitió también a los astrocitos migrar en respuesta a Thy-1. Ensayos realizados con astrocitos primarios en que se sobre-expresa o silencia el gen codificante para la Integrina β3, demostraron que la respuesta a Thy-1 luego del tratamiento con agentes pro-inflamatorios, es dependiente de la expresión de dicha Integrina. Se demostró además que la migración de estos astrocitos inducida por Thy-1 también requiere de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. Estos datos aportan al entendimiento del papel que tienen los astrocitos en el desarrollo de una respuesta inflamatoria tras un daño al sistema nervioso central. Además, aportan antecedentes interesantes sobre cómo una interacción neurona – astrocito, a través de Thy-1 y sus receptores, regula la migración de los astrocitos modificando la señalización intracelular, la permeabilidad de la célula y generando un fenómeno de transactivación que induce cambios en el comportamiento celular. Comprender cómo cambia el comportamiento de los astrocitos frente a la interacción con Thy-1 es importante para generar oportunidades terapéuticas y posibles blancos farmacológicos para contrarrestar la inhibición del crecimiento axonal relacionada con esta interacción. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo aparecen numerosas preguntas nuevas, por ejemplo qué vías se relacionan con la apertura de los hemicanales y cómo estas rutas se conectan con cambios en la adhesividad y migración de los astrocitos. Importante será también comprender el papel que tiene Síndecan-4 en la liberación de ATP inducida por Thy-1 y en la respuesta de los astrocitos de cultivo primario a Thy-1 en un contexto inflamatorio. Finalmente, llevar este conocimiento obtenido en modelos celulares a un modelo animal con perspectivas de tratamiento sería un objetivo clave para reforzar esta investigación / Astrocytes respond to inflammatory stimuli by modifying their morphology and gene expression pattern, and participate in the formation of the glial scar in the case of a traumatic lesion. This glial scar represents a non-permissive environment for axonal regeneration that harbors many inhibitory molecules thought to be responsible for the poor capacity of neurons in the Central Nervous System to repair themselves. In this context, molecules like Chondroitin sulfate proteoglycans secreted by astrocytes, the Nogo protein present on the surface of oligodendrocytes and, importantly for our studies, the neuronal surface glycosyl phosphatidylinositol protein Thy-1, all are highly relevant. For many years, our laboratory has focused on the study of Thy-1 function and signaling. We have shown that Thy-1 inhibits axonal growth and engages in cell-cell interactions. We have also demonstrated that these effects are elicited through the interaction with two receptors present in DITNC1 astrocytes: αvβ3 Integrin and Syndecan-4. We have observed that short-term interaction of Thy-1 with these two receptors enhances astrocyte adhesion; however, following prolonged stimulation, Thy-1 induces astrocyte migration. Thy-1 interaction with its receptors induces the activation of signal transduction pathways in astrocytes that increase RhoA and Rac1 GTPase activity with different kinetics. Thy-1 also induces ATP release from the astrocytes, resulting in the activation of the P2X7 receptor and entry of extracellular calcium. We know that these signals are necessary for astrocyte adhesion. However, how ATP is released in response to Thy-1 remains to be determined. Also whether extracellular ATP and P2X7 receptor activation are required for DITNC1 astrocyte migration induced by Thy-1 is unknown. These and related questions we sought to answer with the studies described in this thesis. On the other hand, results from our laboratory have shown that, in contrast to DITNC1 cells, primary astrocytes in culture do not respond to Thy-1 and express very low levels of β3 integrin, which however increase under pro-inflammatory conditions, such as those produced in the brain by a stroke. Because astrocytes undergo morphological changes and migrate under these conditions in an attempt to limit and repair the damage, we hypothesized that the different responses observed in DITNC1 cells and primary astrocytes, after Thy-1 stimulation, are due to the different levels of integrin expression observed in the two types of cells. Therefore, in this study we propose that DITNC1 cell migration induced by Thy-1 requires ATP release into the extracellular space – by still unknown mechanisms – and P2X7 receptor activation. Furthermore, we hypothesize that primary astrocytes do not respond to Thy-1 due to their low levels of β3 Integrin expression. In order to study ATP release from the astrocytes, and the signaling pathways involved, we measured extracellular ATP by luminescence techniques, and evaluated calcium kinetics by loading the cells with fluorescent probes, and follow fluorescent dye uptake. To assess the requirements of astrocyte migration induced by Thy-1, we performed wound healing and cell polarity assays. The participation of the different molecules in the mechanisms under study was analyzed by the use of pharmacological inhibitors, channel blockers or receptor antagonists. Also, expression of some of these molecules was modified using shRNA and siRNA or other approaches. Primary astrocyte responses to Thy-1 were monitored in cortical astrocytes treated or not treated with pro-inflammatory cytokines, such as TNFα. Then, changes in β3 Integrin expression were analyzed by Western Blotting, and astrocyte migration was evaluated using the wound healing assay under different conditions, including silencing or overexpression of β3 Integrin. The results shown in this study indicate that ATP release induced by Thy-1 required the interaction with both αvβ3 Integrin and Syndecan-4 receptors. Mutation of the integrin-binding site completely abolished the response, while mutation in the heparin-binding domain decreased and delayed ATP release. We further demonstrate that ATP release occurred through Connexin 43 and Pannexin 1 hemichannels, which are opened by a mechanism that required an increase in intracellular calcium stored in the endoplasmic reticulum. This calcium was released to the cytoplasm through IP3R receptor activation. ATP release was necessary for the increase of both average focal adhesion area and the number of focal adhesions per cell induced by stimulation for short periods with Thy-1. Prolonged stimulation induced DITNC1 cell polarization and migration, and both of these effects required the opening of hemichannels, the presence of extracellular ATP and P2X7 receptor activation. Treatment of astrocytes with BzATP, a P2X7 receptor agonist, stimulated cell migration at high concentrations. However, our study shows that DITNC1 astrocytes treated with low concentrations of BzATP, which did not induce cell migration, were able to migrate upon co-stimulation with a mutant form of Thy-1 lacking the integrin-binding site, but with an intact heparin-binding domain, suggesting that increases in extracellular ATP requires the integrin-binding site of Thy-1. These results also indicate that activation of the P2X7 receptor by ATP (or BzATP) and downstream signaling induced by Thy-1 through Syndecan-4, are necessary for astrocyte migration. Primary astrocytes changed their phenotype after treatment with TNFα, increased the expression of β3 Integrin, GFAP and P2X7 receptor, and migrated in response to Thy-1. Furthermore, experiments in which β3 Integrin was overexpressed or silenced indicated that after treatment with pro-inflammatory agents, the observed responses to Thy-1 depended on the expression of this integrin. Migration of TNFα-treated astrocytes induced by Thy-1 also required extracellular ATP and the activation of the P2X7receptor. These results improve our understanding of the role that astrocytes play during an inflammatory response after damage to the Central Nervous System. They also uncover mechanisms relevant to how neuron-astrocyte interactions, established via neuronal Thy-1 and its astrocytic receptors, regulates astrocyte migration, modifies intracellular signaling, cell permeability and generates changes in cell behavior. These results set the stage for future studies that will yield a deeper understanding of how astrocytes change their behavior after interacting with Thy-1. These insights may eventually help in generating therapeutic opportunities and pharmacological targets to counteract the inhibition of axonal growth ascribed to interaction with astrocytes. With our results, new questions arise. For example, which pathways are related to the opening of hemichannels? How do these pathways regulate changes in adhesion and migration of astrocytes? What role does Syndecan-4 play in ATP release induced by Thy-1? What is the role of Syndecan-4 in primary astrocytes stimulated with Thy-1 under inflammatory conditions? Finally, it would be very interesting to compare these results with the responses that are observed in animal models. In conjunction, these approaches may eventually help to define new approaches for the treatment of patients with post-trauma brain damage / Conicyt

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El objetivo de este trabajo fue demostrar que la glutatión transferasa M2-2 humana (GST M2-2), protege a los astrocitos de los efectos tóxicos del aminocromo, ya que en estudios in vitro utilizando la enzima recombinante, se demostró que esta enzima conjuga aminocromo con glutation reducido (GSH), formando un metabolito resistente a agentes oxidativos biológicos, bloqueando de esta forma los efectos neurotoxicos generados por aminocromo. GST M2-2 está presente en la sustancia nigra y en astrocitos. Para demostrar la función protectora de esta enzima, se infectó la línea celular de astrocitos humanos U373MG con retrovirus (Gammaretroviridae), los cuales llevan en su genoma un plasmidio con los RNA interferentes (siRNA), necesarios para generar una disminución total o parcial de la expresión de esta enzima. Se utilizaron tres siRNA, los cuales van dirigidos a distintas zonas del RNAm, con el fin de producir secuencias erróneas que impidan la síntesis de la proteína funcional. De los tres interferentes utilizados, todos ellos generaron una disminución de la expresión de la enzima GST M2-2 en diferente magnitud, uno de ellos, el denominado arbitrariamente siGST 6, logró una disminución de la expresión de la enzima de un 82%, siendo éste el mayor nivel alcanzado. Para los ensayos de toxicidad se sintetizó y purificó aminocromo y se agregó a la línea celular de astrocitos humanos U373MG. Se realizó una curva de toxicidad utilizando diferentes concentraciones de aminocromo, (0, 50, 100, 200, 300 y 500 uM) y se evaluó su toxicidad tanto en la línea celular U373MG wild type como en la línea celular U373MG infectada con los distintos interferentes. Los resultados sugieren que la línea celular U373MG wild type es más resistente a los efectos tóxicos generados por aminocromo, debido principalmente a la presencia de la enzima GST M2-2. En aquellas células infectadas con los interferentes se produjo una mayor mortalidad, directamente proporcional al grado de inhibición de la enzima GST M2-2, lo que demuestra y comprueba que esta enzima conjuga aminocromo y bloquea los efectos tóxicos de este / Proyecto FONDECYT 1061083 y Beca Fogarty Internacional Research Collaboration Award (FIRCA), RCA R03 TW07044-1

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Bioquímica / Los astrocitos colaboran con las neuronas en el normal desarrollo de sus actividades metabólicas, y más aún son capaces de participar activamente en su protección frente a estímulos potencialmente dañinos. Se ha demostrado, que la enzima glutatión-S-transferasa M2-2 (GSTM2-2) de astrocitos es capaz de conjugar glutatión con aminocromo, un producto de oxidación de la dopamina, y por ello es que se propone como hipótesis que la enzima Glutation-S-transferasa M2-2 producida por astrocitos les confiere protección, y protege neuronas tipo dopaminérgicas de los efectos tóxicos de aminocromo. Para validar esta hipótesis es que en primera instancia se determinó la capacidad de los astrocitos humanos U373MG (glioblastoma) de captar aminocromo mediante utilización de aminocromo tritiado, observándose una incorporación máxima a los 40 minutos, la que es parcialmente inhibida por tratamientos con exceso de dopamina, imipramina y nomifensina. Mediante western blot se determinó que la presencia del aminocromo en los cultivos celulares provoca un aumento en la cantidad proteína, además de detectarse aumento en la actividad enzimática, ambos cambios de manera dependiente de la concentración, en donde 100 μM de aminocromo aumenta 2,1 veces la cantidad de la enzima en 3 horas. Se detectó mediante western blot la presencia de la proteína GSTM2-2 en los medios condicionados de células U373MG, aumentando 2,7 veces al exponer las células a aminocromo 50 μM por 3 horas en relación al control sin aminocromo. La línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y es susceptible a toxicidad inducida por aminocromo, determinada por citometría de flujo, por lo que se probaron los medios condicionados de las células U373MG que contenían la enzima GSTM2-2 sobre cultivos de SH-SY5Y, evidenciándose la capacidad de proteger a células SH-SY5Y de la muerte inducida por exposición a 10 μM de aminocromo, y dicha protección frente a la muerte celular es dependiente de la internalización de la proteína GSTM2-2 por parte de las células SH-SY5Y, tal como se demostró (i) por captación de 14C-GSTM2-2 liberado por células U373MG, proceso inhibido por un antisuero contra GSTM2-2, (ii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de U373MG tratados con antisuero contra GSTM2-2, (iii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de células U373MGsiGST6, que expresan un siRNA contra GSTM2-2. En conclusión, nuestros resultados demuestran que las células U373MG protegen las células SH-SY5Y contra la toxicidad inducida por aminocromo, por un mecanismo que involucraría la liberación de GSTM2-2 al medio condicionado y la subsecuente internalización de esta enzima por parte de las células SH-SY5Y. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo de protección de neuronas dopaminérgicas mediado por astrocitos / Astrocytes collaborate with neurons in the normal development of their metabolic activities, and to a greater extent, they are able to actively participate in their protection from potentially harmful stimuli. It has been shown that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 (GSTM2-2) from astrocytes is able to conjugate glutathione to aminochrome, an oxidation product of dopamine. Therefore the hypothesis proposed is that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 produced by astrocytes protect them, and also protects dopaminergic neurons from the toxic effects of aminochrome. To validate this hypothesis, we assessed the ability of human astrocytes U373MG (glioblastoma) to capture aminochrome by using tritiated aminochrome, reaching an incorporation peak at 40 minutes, which is partially inhibited by treatment with excess dopamine, imipramine and nomifensine. Using western blot, we determined that the presence of aminochrome in cell cultures causes an increase in the protein amount, besides the increasing enzymatic activity, both changes depending on the aminochrome concentration, with 100 μM aminochrome increasing 2.1 times the amount of the enzyme in 3 hours. The presence of protein GSTM2-2 was detected by western blot in conditioned media from U373MG cells, increasing 2.7 times after the exposure to 50 uM aminochrome for 3 hours compared to the control without aminochrome. The neuroblastoma cell line SH-SY5Y is susceptible to aminochrome-induced toxicity, determined by flow cytometry, then U373MG cells conditioned media containing the enzyme GSTM2-2 cultures were tested on SH-SY5Y, demonstrating the ability to protect SH-SY5Y against aminochrome-induced cells death, and that protection against cell death is dependent on internalization of the GSTM2-2 protein by SH-SY5Y cells. This internalization was demonstrated by (i) uptake of 14C-GSTM2-2 released by U373MG cells, process inhibited by an antiserum against GSTM2-2, (ii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media from U373MG treated with antiserum against GSTM2-2, (iii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media of U373MGsiGST6 cells expressing siRNA against GSTM2-2. In conclusion, our results demonstrate that U373MG cells protect SH-SY5Y cells against aminochrome-induced toxicity, by a mechanism which would involve the release of GSTM2-2 to the conditioned medium and subsequent internalization of this enzyme by SH-SY5Y cells. These results suggest a novel mechanism of protection of dopaminergic neurons mediated by astrocytes / Conicyt; Fondecyt

OBJETIVO GENERAL: Los astrocitos, el tipo celular más abundante en el sistema nervioso central (SNC) desempeñan un papel clave en la homeostasis, la neurotransmisión y, como tema central en esta tesis, en la neuroinflamación, es decir, el conjunto de reacciones del cerebro al trauma, las infecciones virales o bacterianas, o la neurodegeneración. El astrocito es extremadamente plástico, respondiendo a un amplio repertorio de estímulos fisiológicos o insultos patológicos con cambios morfológicos, migración, o cambios funcionales por modificación de su expresión génica. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la plasticidad astrocitaria en dos paradigmas distintos relacionados con la neuroinflamación. En el primer bloque hemos estudiado el efecto de un factor trófico de especial importancia en el SNC, el Factor Básico de Fibroblastos, o FGF2, en la expresión de genes inflamatorios astrocitarios. El FGF2 es un factor de crecimiento cuya expresión en el SNC adulto es muy alta, localizada principalmente en astrocitos, y que se regula a la alza en condiciones patológicas como el Alzheimer- alrededor de la placas de amiloide- o el ictus. Así como las propiedades tróficas del FGF2, y su papel en el desarrollo del cerebro, son ampliamente conocidos, su papel en la respuesta inflamatoria está pobremente caracterizado. En el segundo bloque hemos analizado la capacidad de fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINES) como el ibuprofeno y derivados (R-flurbiprofeno y CHF5074) los cuales, según estudios epidemiológicos, reducen la aparición de la enfermedad de Alzheimer, de modular la dinámica del citoesqueleto de actina astrocitario. METODOS/MODELOS: Modelo de inflamación (LPS o scratch-wound en cultivos primarios de astrocitos. Estudio expresion moléculas: RTPCR, Western Blot, inmunocitoquímica, ELISAS, GLISAS. Manipulación mecanística: inhibidores farmacológicos, sobreexpresión de proteínas mutantes dominantes negativos o constitutivamente activos. RESULTADOS: En los cultivos primarios mostramos que FGF2 modula de una manera bifásica la respuesta inflamatoria inducida por LPS aumentando en estadíos iniciales la expresión de genes inflamatorios como el de la quimocina MCP1 y de COX2 e inhibe la expresión de ICAM1 en estadíos más avanzados. Esta regulación es dependiente de las vías de señalización de ERK, JNK y FAK a través de la activación del receptor FGFR2 pero independiente del factor de trasncripción NF-kB. Mostramos también que el tratamiento de astrocitos con ibuprofeno y derivados produce un rápido cambio morfológico caracterizado por una retracción del soma y emisión de procesos dependiente de la modulación de las proteínas Rho-GTPasas RhoA, Rac1 y cdc42 e independiente de las diana “clásica” de los antiinflamatorios las ciclooxigenasas (COX2). Este fenotipo resulta en una capacidad migratoria acelerada en el caso del ibuprofeno o inhibida en el caso del R-Flurbiprofeno y CHF5074. CONCLUSIONES: Los resultados expuestos en esta tesis demuestran el papel inmunomodulador del FGF2 en la respuesta inflamatoria astrocitaria. Especulamos que el carácter bifásico de la respuesta permite los efectos beneficiosos de la inflamación pero evitando su cronificación. Además mostramos que los profenos son capaces de promover la aparición de fenómenos plásticos en astrocitos a través de la modulación de nuevas dianas como las Rho-GTPasas, abriendo nuevas perspectivas en la terapia de enfermedades neurodegenerativas en las que los astrocitos estén implicados. / GENERAL GOAL: Astrocytes, the main celular type in the Central Nervous System, play important roles in the homeostasis , neurotransmission and also in neuroinflammation. Astrocyte is a plastic celular type, wich is able to respond to a variety of physiologic and pathologic stimuli with morphological, migrational changes and also adaptating its gene expression. The goal of this thesis has been to study the astrocytic plasticity in two different paradigms related to neuroinflammation. In the first part of this thesis we have studiedd the effect of FGF2, a groth factor wich enriched expression in astrocytes wich and is upregulated during inflammatory conditions. The role of FGF2 in neuroinflammation is not known. In the second part we have analyzed the hability of some non-steroidal-antiinflammatory drugs (NSAIDS), wich are known to reduce the incidence of Alzheimer Disease, like ibuprofen and R-Flurbiprofen, in modulating astrocyte cytoskeleton dynamics. MODEL/METHOD: Inflammation model (LPS-induced or scratch-wound induced neuroinflammation in primary rat astrocytes). RNA and protein detection: Real Time PCR, Western Blot, ELISA, G-LISA. Molecular manipulation by pharmacological inhibition or overexpression of protein mutants. RESULTS: FGF2 regulates inflammatory gene expression in primary astrocytes in a biphasic manner: it potentiates LPS-induced MCP1 and COX2 expression in the first hours of the inflammatory reaction, while it inhibits ICAM expression in the later phases. This effect is dependen ton ERK, JNK and FAK signalling pathways by means of the activation of the FGFR2 but independent on NF-kB transcription factor. We also show that treatment of astrocytes with ibuprofen and derivatives produces astrocyte stellation wich involves the modulation of Rho-GTPases RhoA, Rac1 and cdc42. This effect is not dependent on COX the classical target of NSAID. This stellate phenotype results in changes in the migratoy capacity of astrocytes. CONCLUSIONS: FGF2 is an inmunomodulatory molecule in the inflammatoy reaction of astrocytes. We speculate that it’s biphasic regulation of inflammatory gene expression enables the beneficial effects of inflammation inhibiting its cronification. In addition we have shown that profens promotes plastyc phenomenoms in astrocyte by regulating new targets, like Rho-GTPases, opening new perspectives in neurodegenerative disorders where astrocytes may play a role.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:14Z : No. of bitstreams: 1 000851655.pdf: 1706170 bytes, checksum: 990d3d441221c8d5284639c96fcf57c8 (MD5) / Os tumores cerebrais primários mais comuns são denominados gliomas. Eles são definidos patologicamente pela presença de características histológicas e imuno-histoquímicas que evidenciam diferenciação glial. De acordo com a suposta linhagem de origem, eles são classificados como astrocitomas, oligodendrogliomas ou ependimomas. Dentre eles, os astrocitomas são os mais comuns e agressivos. O tratamento atualmente utilizado inclui remoção cirúrgica seguida de quimioterapia com temozolamida (TMZ) e radioterapia, porém sua eficácia é muito baixa devido à alta resistência das células tumorais. Buscando encontrar genes associados com a elevada resistência dos astrocitomas, realizamos um estudo anterior de expressão gênica diferencial utilizando uma coleção de genes de reparo de DNA. Nesta análise foram identificados sete genes significantemente superexpressos em glioblastoma multiforme (GBM), o tipo mais agressivo de astrocitoma. Estes genes são: APEX1, BRCA2, BRIP1, EXO1, NEIL3, RAD54L e XRCC2. Através de RT-PCR quantitativo, avaliamos os níveis de expressão destes genes em um painel expandido de 54 casos clínicos de astrocitomas de diferentes graus de malignidade e em 5 linhagens celulares de GBM. Todos os genes analisados mostraram-se mais expressos nos astrocitomas, com exceção de RAD54L em amostras de astrocitoma de grau II. Além disso, a superexpressão dos 7 genes avaliada isoladamente não exerce influência direta na sobrevida dos pacientes. Evidenciou-se ainda a superexpressão mais acentuada de EXO1 e NEIL3, que foram selecionados para realização de ensaios funcionais de silenciamento, e avaliação do ciclo celular e taxas de apoptose/morte efetiva das células. Estes ensaios foram realizados com as linhagens celulares T98G e U138MG, que apresentaram maiores níveis de expressão destes genes. Nos ensaios funcionais, observamos que o silenciamento... / Gliomas are the most common type of primary brain cancers. They are pathologically defined by the presence of histological and immunehistochemical characteristics that evidence glial differentiation. According to the hypothetical cell of origin they are classified in: astrocytomas, oligodendrogliomas and ependimomas. Among them, astrocytomas are the more common and aggressive type. The treatment currently used for GBM includes surgical resection of tumor followed by chemotherapy with temozolamide (TMZ) and radiotherapy, but this protocol is still insufficient due to the high resistance of cancer cells. Searching for repair genes associated with the high resistance of astrocytomas, we developed a previous study of differential gene expression using a collection of DNA repair genes. In this analysis, we identified seven genes significantly overexpressed in glioblastoma multiforme (GBM), namely: APEX1, BRCA2, BRIP1, EXO1, NEIL3, RAD54L and XRCC2. Using quantitative RT-PCR, we evaluated the expression of these genes in an expanded panel of samples with 54 clinical cases of different grade astrocytomas and five GBM cell lines. All genes showed expression significantly higher in astrocytomas, except RAD54L in grade II astrocytomas. Moreover, the overexpression of this 7 genes evaluated individually doesn't exert direct influence upon patient's survival rate. Remarkably, EXO1 and NEIL3 showed the higher fold changes and were chosen for functional silencing assays. This experiments were performed with T98G and U138MG cell lines that showed the higher expression levels among the GBM cell lines analyzed. In the functional assays, we observed that the silencing of EXO1 or NEIL3 doesn't induce changes in the apoptosis and cell death rates and doesn't change the distribution of cells in cycle. Beyond this, the silencing of this two genes doesn't sentisizes cells to ionizing radiation.

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T22:49:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_KarinadeBrito_D.pdf: 8050913 bytes, checksum: f9c7d621391d6f3f99413a9c27749530 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Durante o curso da encefalomielite autoimmune experimental ocorre uma grave redução das funções motoras e sensitivas. Esses eventos têm sido classicamente atribuídos ao processo desmielinizante da doença. Em ratos, os sinais clínicos da doença desaparecem 5 dias após completa tetraplegia, indicando que o processo desmielinizante não é a única causa da rápida evolução da doença. Assim sendo, investigamos as alterações sinaptológicas e o processo inflamatório induzidos pela encefalomielite autoimune experimental (EAE) em motoneurônios medulares e sua relação com o surto e remissão da doença. Para esse estudo, foram utilizados ratos Lewis, fêmeas de 7 semanas. Os animais foram induzidos à EAE por meio de dose única de proteína básica de mielina emulsificada com adjuvante completo de Freund e sacrificados no 13º dia após indução (surto grau 3) e no 26º dia (remissão da doença). Também, para investigar a possibilidade de que o tratamento com acetato de glatirâmer, uma droga imunomoduladora baseada na estrutura de aminoácidos da proteína básica de mielina, interfira no processo de plasticidade sináptica, os animais foram induzidos à EAE, tratados com AG diariamente e sacrificados após 2 semanas. Os grupos experimentais foram divididos em: estudo da aposição sináptica durante surto e remissão da doença e tratamento dos animais induzidos à EAE com AG. Assim, os espécimes foram processados para análise através de imunohistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão. Nossos resultados indicaram que os componentes gliais (astrócitos e microglia), estimulados pela inflamação, desempenham papel ativo no processo de retração sináptica em motoneurônios alfa. Apresentamos evidências de que a eliminação de terminais sinápticos contribui para a perda da função motora observada no curso da doença e que o imunomodulador AG não só possui efeito antiinflamatório, mas também influencia diretamente na plasticidade de elementos neurais no microambiente medular. Reforçam, também, que um processo agudo de inflamação pode colaborar diretamente para a recuperação e sobrevivência neuronal, uma vez que as células inflamatórias produzem citocinas e fatores neurotróficos no microambiente medular / Abstract: During the course of experimental autoimmune encephalomyelitis, a massive loss of motor and sensitive function occurs, which has been classically attributed to the demyelination process. In rats, the clinical signs disappear within 5 days following complete tetraplegia, indicating that demyelination might not be the only cause for the rapid evolution of the disease. The immunomodulador glatiramer acetate (GA) has been shown significantly reduce the seriousness of the symptoms during the exacerbation of the disease. However, little is known about its effects on the spinal motoneurons and on their afferents. The present work investigated the occurrence of experimental autoimmune encephalomyelitis-induced changes of the synaptic covering of spinal motoneurons during exacerbation and after remission and investigated whether GA has a direct influence on synapse plasticity and on the deafferentiation of motoneurons during the course of EAE in rats. Lewis rats were subjected to EAE associated with GA or placebo treatment. The animals were sacrificed after fifteen days of treatment. For the both cases the spinal cords was processed for immunohistochemical analysis (IH) and electron transmission microscopy. The terminals were typed with transmission electron microscopy as C-, F- and Stype. Immunohistochemical analysis of synaptophysin, glial fibrillary acidic protein and the microglia/macrophage marker F4/80 were also used in order to draw a correlation between the synaptic changes and the glial reaction. The ultrastructural analysis showed that, during exacerbation, there was a strong retraction of both F- and S-type terminals. In this sense, both the covering as well as the length of the remaining terminals suffered great reductions. However, the retracted terminals rapidly returned to apposition, although the mean length remained shorter. A certain level of sprouting may have occurred as, after remission, the number of F-terminals was greater than in the control group. The immunohistochemical analysis showed that the peak of synaptic loss was coincident with an increased macro- and microglial reaction. Interestingly, although the GA treatment preserved synaptophysin labelling, it did not significantly reduce the glial reaction, indicating that inflammatory activity was still present. Our results suggest that the major changes occurring in the spinal cord network during the time course of the disease may contribute significantly to the origin of the clinical signs as well as help to explain their rapid recovery and that the immunomodulator GA has a direct influence on the stability of nerve terminals in the spinal cord, which in turn may contribute to its neuroprotective effects during the course of multiple sclerosis / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:23:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zago_GabrielaMariotoni_M.pdf: 5451987 bytes, checksum: 84e15c6e492816ce6e4cc4c92760e544 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A barreira hematoencefálica (BHE) é a principal estrutura controladora da manutenção da homeostase do SNC. A perda da integridade da BHE em respostas inflamatórias do SNC, desencadeada por agentes neurotóxicos, têm sido associadas ao desenvolvimento de sinais neurológicos. O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) produz sinais e sintomas excitatórios em humanos e sua ação neurotóxica sugere habilidade potencial em alterar a permeabilidade da BHE. Nesse trabalho, o PNV foi utilizado como ferramenta para avaliar a susceptibilidade da BHE em diferentes regiões anatômicas cerebrais de ratos. Após injeção sistêmica do PNV (0.85 mg/Kg in 0.5 ml), os ratos anestesiados foram perfundidos 1, 2 e 5 h após a injeção, com solução fixadora à qual foi adicionado traçador extracelular eletron-opaco. Córtex motor fronto-parietal, substância cinzenta periaquedutal, núcleos da base e amigdala foram dissecados e processados para microscopia eletrônica de transmissão. O estado funcional da BHE foi avaliado considerando evidências do vedamento da barreira (edema vasogênico e extravasamento do traçador) e a resposta de elementos do tecido circunjacente (astrócitos, terminais sinápticos, populações de células). Além disso, foi investigada a expressão das proteínas GFAP, o principal filamento intermediário dos astrócitos, proteína S100, uma família de proteínas ligantes de cálcio e as citocinas pró-inflamatórias, IFN-? e TNF-a, através de marcação imunohistoquímica, no hipocampo e cerebelo. Logo após a administração do PNV, os animais mostraram sinais indicativos de envolvimento do SNC, SNP e SNA. Nossos resultados mostraram que todas as regiões analisadas apresentaram sinais morfológicos de reação defensiva, tais como migração de micróglia perivascular reativa, pés-vasculares astrocitário edemaciados e macrófagos ativos circulantes. Entretanto, apenas o córtex motor fronto-parietal mostrou número significante de vasos afetados em relação aos controles e às outras áreas anatômicas (1 h p.i.). Nos grupos controle, uma expressão basal de GFAP e S100B foi mantida inalterada durante os períodos de observação, enquanto nenhuma produção fisiológica das proteínas TNFa e INF? ocorreu. Por outro lado, a análise dos grupos tratados com PNV mostrou que, variavelmente, todas as proteínas investigadas aumentaram sua expressão no cerebelo e hipocampo ao longo do tempo após a injeção do veneno. O aumento da GFAP no cerebelo foi mais precoce e mais forte do que no hipocampo. Essa gliose mais evidente no cerebelo, provavelmente justifica estudos prévios, onde o extravasamento do traçador foi menor nessa região do que hipocampo, demonstrando assim, uma maior resistência da BHE do cerebelo. Outros mecanismos moleculares envolvidos poderiam ser a expressão de citocinas pró-inflamatórias TNFa e INF?, cuja modulação diferente em hipocampo e cerebelo de animais tratados com PNV, poderia também ter papel nas diferenças de permeabilidade da BHE vistas em ambas as áreas após PNV. Nosso trabalho dá suporte à hipótese de que os sinais e sintomas apresentados pelos animais durante o intervalo de tempo, após a injeção de PNV e o sacrifício, refletem alterações fisiológicas em curso, que por sua vez se revela ao nível histológico e ultraestrutural no desigual envolvimento da BHE nas diferente regiões cerebrais analisadas. Os vasos do córtex motor fronto parietal foram mais afetados pelo PNV, do que as demais regiões, confirmando a existência de diferenças regionais na capacidade do tecido local de mediar eventos requeridos para que ocorram as alterações da permeabilidade da BHE e para a invasão de populações celulares. O veneno de Phoneutria nigriventer representa uma importante substância natural, cuja complexa composição pode ser explorada em relação à ação de drogas que agem no SNC / Abstract: The blood¿brain barrier (BBB) is of pivotal importance to maintain homeostasis of the CNS, as it closely regulates the composition of the interstitial fluid in the brain. The loss of BBB integrity in CNS inflammatory responses triggered by neurotoxic agents has been associated with the development of neurological signs. Phoneutria nigriventer armed spider venom (PNV) produces excitatory signals and symptoms in humans, and its recognized neurotoxic action suggests a potential ability to alter BBB permeability. In this work, the PNV was used as tool to analyzing the BBB susceptibility of different rat brain anatomic regions. After PNV systemic injection (0.85 mg/ Kg in 0.5 ml) the rats were perfused at 1, 2 and 5 h post-injection (p.i.) with fixative solution to which had been added an electro-opaque extracellular tracer. Frontal-Parietal Motor Cortex, Periaqueductal Gray Matter, Base Nucleus and Amygdala were dissected and processed for routine transmission electron microscopy. The functional state of the BBB was evaluated considering evidences of the tightness of the barrier (vasogenic edema and tracer extravasation) and the response of elements of circumjacent tissue (astrocytes, synaptic endings, cells population). Besides, it was investigated the expression of the GFAP, the major intermediate filament of astrocytes, S100 protein, a family of calcium-binding proteins, and IFN-? and TNF-a pro-inflammatory cytokines, through imunohistochemistry labeling, in the hippocampus and cerebellum. Soon after PNV dministration the animals showed clinical signs indicative of peripheral, autonomic and central nervous system involvement. Our findings showed that all regions analyzed presented morphological signs of defensive reaction, such as migrating reactive perivascular microglia, swollen astrocytes end-feet and circulating active macrophages. However, only FPMC showed significant number of affected vessels in relation to controls and the other anatomic areas (1 h p.i.). A basal expression of GFAP and S100 was maintained unaltered along the periods of observation, whereas none physiologic production of TNFa and INF? proteins has occurred in control groups. In contrast, analysis of the PNV-treated groups showed that all investigated proteins variably enhanced its expression along the time-course after venom injection in cerebellum and hippocampus. The increase of GFAP in cerebellum is more precocious and stronger than in hippocampus. A more prominent reactive gliosis by cerebellum over hippocampus would be supposedly one of the molecular events underlying the previous findings showing to be cerebellum BBB more resistant to leakage than hippocampus. Other possible molecular mechanism involved would be the expression of proinflammatory TNFa and INF? cytokines, whose different modulation in cerebellum and hippocampus of PNV-treated animals could be also involved in differences of permeation of BBB seen in both areas. Our study further support the idea that the symptomatic interval after systemic P. nigriventer spider venom injection is characterized by sequential physiologic changes that are reflected in histological and ultrastructural preparations and reveal that BBB impairment is unequal in different anatomical brain areas. The Fronto-Parietal Motor Cortex vessels are more targeted for PNV, confirming the existence of regional differences in the capacity of the local tissue of mediating the events required for the changes of BBB permeability and for cell invasion. Phoneutria nigriventer venom represents an important natural substance, whose complex composition should be explored in terms of CNS acting drugs / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los astrocitos son el tipo celular más abundante de la glia en el Sistema Nervioso Central y cuando son expuestos a factores sanguíneos durante un daño cerebral, éstos se vuelven “reactivos”, cambiando su forma estrellada a una de tipo fibroblasto. Los astrocitos “reactivos” también proliferan y migran al sitio dañado para formar la cicatriz glial, constituyendo uno de los mayores impedimentos para que ocurra la regeneración neuronal. Se piensa que estos cambios morfológicos que sufren los astrocitos in vivo, podrían tener una relación con los gatillados in vitro por Thy-1, una glicoproteína neuronal muy abundante, que se une a la Integrina αVβ3 en la membrana de astrocitos provocando cambios dramáticos en la forma de estas células. Con estos antecedentes se planteó la hipótesis de que la estimulación sostenida de la Integrina αVβ3por Thy-1 provoca la migración y/o proliferación de astrocitos, activando vías de transducción de señales que involucran a las proteínas quinasa PI3-K y Erk, respectivamente. Para poner a prueba esta hipótesis, se utilizaron ensayos in vitro de cicatrización de herida, la cual consiste en la remoción de una porción de células desde una monocapa de astrocitos en cultivo de la línea celular de rata DI-TNC1 con punta de pipeta y el subsecuente monitoreo de la migración de éstos al área libre de células después de la estimulación con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Adicionalmente, se realizaron en paralelo, análisis de Inmunofluorescencia indirecta a diferentes tiempos para la visualización de estructuras de avance como filopodios y lamelipodios en los astrocitos del borde de la herida estimulados con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Para demostrar la participación de la enzima PI3-K, los ensayos de cicatrización de herida se realizaron en presencia de inhibidores específicos de esta quinasa como son LY294002 y Wortmanina y mediante técnica de Inmunoblot se determinaron los niveles de fosforilación de un sustrato de esta enzima, la proteína Akt, en los astrocitos estimulados con el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A. Para determinar si el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A inducía cambios en la proliferación y viabilidad de los astrocitos, se utilizaron técnicas de MTS y de exclusión de azul de tripán, así como también se analizó el ciclo proliferativo de éstas células por citometría de flujo. Los resultados demuestran que Thy-1: 1) Induce la migración de los astrocitos DI-TNC1 al sitio de la herida; 2) Induce una mayor formación de estructuras de avance y migración como filopodios y lamelipodios, en los astrocitos del borde de la herida; 3) No induce proliferación ni aumento de la viabilidad de los astrocitos como tampoco cambios significativos en el ciclo proliferativo de éstas células; y 4) La quinasa PI3-K está implicada en la migración de los astrocitos estimulados por Thy-1. En conjunto, estos datos sugieren que la interacción de Thy-1 con la Integrina αVβ3 en la membrana de los astrocitos estimula cambios morfológicos llevando a estas células a una mayor adhesión celular para luego inducir su migración. Cabe destacar que la secuencia de eventos observados in vitro en este trabajo es similar a lo que ocurre en el proceso de astrogliosis, en el cual luego de un daño cerebral, los astrocitos se tornan reactivos, migran al sitio dañado y producen la cicatrización de la herida / Financiamiento: FIRCA 1R03TW006024 - FONDECYT 1040390 - FONDECYT 1070699

Doctor en Ciencias Mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias. / El estrés oxidativo y la desregulación de la señalización de calcio son señales importantes en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA). El factor de transcripción STAT3 tiene un rol crucial en el desarrollo y mantención del sistema nervioso. Recientemente, la pérdida de la actividad transcripcional de STAT3 ha sido ligada a la EA. En este trabajo, tratamos astrocitos primarios con los oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs), los cuales muestran una potente actividad sinaptotóxica, y estudiamos los efectos de los mediadores presentes en el medio condicionado de astrocitos tratados con AβOs (MCA+AβOs) en la depleción nuclear de STAT3 fosforilado en el residuo 727 (pSer-STAT3) en las neuronas. El tratamiento de los cultivos neuronales ricos en astrocitos con 0,5 μM de AβOs indujo en las neuronas una disminución significativa de pSer-STAT3, pero no de fosfotirosina 705-STAT3, la otra forma fosforilada de STAT3. Esta disminución no ocurrió en cultivos neuronales pobres en astrocitos revelando un rol fundamental de los astrocitos en esta respuesta. Para probar si los mediadores, liberados por los astrocitos en respuesta a los AβOs, induce la depleción nuclear de pSer-STAT3, cultivos neuronales pobres en astrocitos fueron tratados con MCA+AβOs, lo que causó depleción nuclear de pSer-STAT3 pero no modificó los niveles totales de STAT3. El uso de catalasa y hemoglobina extracelular previno la depleción nuclear de pSer-STAT3 causada por el MCA+AβOs, indicando que posiblemente el peróxido de hidrógeno y el óxido nítrico son los mediadores liberados por los astrocitos involucrados en esta respuesta. Además, el MCA+AβOs indujo un aumento significativo de la espresión y la secreción de la citoquina pro-inflamamtoria IL-6. El MCA+AβOs aumentó el tono oxidativo neuronal y generó en las neuronas señales de calcio mediadas por el receptor de ryanodina, que son esenciales para la depleción nuclear de pSer-STAT3. Usando adenovirus, se demostró que la inhibición de calcineurina abolió la depleción nuclear de pSer-STAT3 inducida por el MCA+AβOs: También se demostró que la activación de calcineurina produjo un leve aumento de la depleción nuclear y mayor defosforilación de pSer-STAT3 en las neuronas, revelando que si bien calcineurina participa en la depleción nuclear de pSer-STAT3, no es el único componente involucrado en el proceso. En suma, el MCA+AβOs generó una disminución significativa de los niveles de ARNm de genes de sobrevivencia Bcl-2 y survivina y un aumento de la razón pro-apoptótica Bax/Bcl-2. No obstante, el MCA+AβOs no promovió la apoptosis por si solo. El MCA+AβOs sensibilizó a la neuronas hacia la muerte apoptótica pero solo en presencia de NMDA a concentraciones excitotóxicas. Esta es la primera descripción que el MCA+AβOs promueve señales de calcio neuronales que regulan la distribución nuclear de pSer-STAT3 en las neuronas. En esta tesis se propone que los AβOs inducen la producción de peróxido de hidrógeno, óxido nitric e IL-6, lo cual aumenta el tono oxidativo neuronal, generando una señal de calcio que activa la fosfatasa calcineurina, la cual causa (en parte) la depleción nuclear de pSer-STAT3 y la pérdida de la actividad transcripcional protectora de STAT3. / Oxidative stress and dysregulation of calcium signaling are pivotal signs in a variety of neurodegenerative diseases, including Alzheimer´s disease (AD). The transcription factor STAT3 has a crucial role in the development and maintenance of the central nervous system. Recently, the loss of transcriptional activity of STAT3 has been linked to AD. In this work, we treated astrocytes with amyloid beta peptide oligomers (AβOs), which display potent synaptotoxic activity, and studied the nature and effects of astrocyte-conditioned medium treated with AβOs on the nuclear depletion of neuronal serine-727-phosphorylated STAT3 (pSer-STAT3). Treatment of mixed neuron-astrocyte cultures with 0.5 μM AβOs induced in neurons a significant decrease of nuclear pSer-STAT3, but not of phosphotyrosine-705 STAT3, the other form of STAT3 phosphorylation. This decrease did not occur in astrocyte-poor neuronal cultures revealing a pivotal role for astrocytes in this response. To test if mediators released by astrocytes in response to AβOs induce pSer-STAT3 nuclear depletion, we used conditioned medium derived from AβOs-treated astrocyte cultures (ACM+AβOs). Treatment of astrocyte-poor neuronal cultures with ACM+AβOs caused pSer-STAT3 nuclear depletion but did not modify overall STAT3 levels. Extracellular catalase and haemoglobin prevented the pSerSTAT3 nuclear depletion caused by AβOs, indicating that reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide could mediate this response. Besides, ACM+AβOs produced an increase of production and secretion of the pro-inflamamtory cytokine IL-6. Also, ACM+AβOs increased the neuronal oxidative tone and calcium signals in neurons, leading to a ryanodine-sensitive intracellular calcium signal that proved to be essential for pSer-STAT3 nuclear depletion. Using adenoviruses we showed that calcineurin inhibition abolished the nuclear depletion of pSer-STAT3 induced by ACM+AβOs and that calcineurin activation produced just a mild increase of the nuclear depletion of pSer-STAT3 in neurons, revealing that calcineurin participate in nuclear depletion of pSer-STAT3, however, it is not the only component involved in the process. In addition, ACM+AβOs generated decreased Bcl-2 and Survivin transcription and significantly increased Bax/Bcl-2 ratio but ACM+AβOs did not execute apoptosis itself. ACM+AβOs sensibilized neurons to apoptotic death when it was incubated in presence of NMDA at an excitotoxic concentration. This is the first description that ACM+AβOs and neuronal calcium signals jointly regulate pSer-STAT3 nuclear distribution in neurons. We propose that AβOs induce hydrogen peroxide, nitric oxide and IL-6 production, which by increasing the neuronal oxidative tone, generate a calcium signal that activates the phosphatase calcineurin, which cause (in part) pSer-STAT3 nuclear depletion and loss of STAT3 protective transcriptional activity. / -Beca CONICYT doctorado nacional N°21130445 y extensión de beca doctoral. -Proyecto Anillo ACT-1114 del Programa de investigación asociativa de CONICYT (PIA, adjudicado por el Dr. Marco Tulio Núñez) -Proyecto FONDECYT 1150736 (adjudicado por la Dra. Andrea Paula-Lima) -Proyecto FONDECYT 1130068 (adjudicado por el Dr. Marco Tulio Núñez) -Becas CONICYT de asistencia a congresos N°81140457 (2014) y N°81150376 (2015) También quiero agradecer a las siguientes instituciones internacionales que gracias a sus becas me permitieron asistir a diferentes cursos de neurociencia y a congresos internacionales de alto nivel: -International Society for Neurochemistry (ISN) por el financiamiento completo para asistir al curso “3rd ISN Latin American School of Advanced Neurochemistry” (Montevideo, Uruguay, 2014) y la beca para asistir al congreso “26th ISN-ESN biennal meeting” en Paris, Francia (2017). -International Brain Research Organization (IBRO) por el financiamiento completo para asistir al curso “IBRO-USCRC 10th Canadian School of Neuroscience” (Montreal, Canadá, 2016) y al congreso “10th Annual Canadian Neuroscience Meeting” en Toronto (2016) y por la beca para asistir al congreso “13th Conference Alzheimer and Parkinson Disease” en Viena, Austria (2017). -Francais Société des Neurosciences-IBRO quienes financiaron mi viaje a Bordeaux, Francia para asistir al congreso “NeuroFrance 2017” y buscar postdoc. -Grass Foundation, IBRO LATP y USCRC y a Society for Neuroscience quienes financiaron mi beca completa para participar en el curso: “Latinoamerican Training program 2018” en Valparaíso, Chile y quienes financiarán mi participación en el congreso Society for Neuroscience 2019 en Chicago, EEUU. / Diciembre 2019

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-23Bitstream added on 2014-06-13T19:36:21Z : No. of bitstreams: 1 godoy_gs_me_jabo.pdf: 837932 bytes, checksum: 779e6f97dccb483745e767a59be1738c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os astrócitos são células nervosas que participam da patogenia de diversas neuropatias que acometem os animais domésticos. Nas aves, a principal doença neurológica é a Encefalomalácia Nutricional causada pela deficiência de vitamina E. Com o objetivo de se estudar o comportamento do astrócitos, pelo exame imunoistoquímico, na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus, foi realizada a tentativa de indução desta doença. Utilizou-se para isto rações contendo deficiência de vitamina E no suplemento vitamínico-mineral e fontes de gordura oxidadas. Nos experimentos realizados não se obteve sucesso na indução da Encefalomalácia Nutricional, porém, em casos naturais reavaliados, constatou-se que os astrócitos participam na patogenia apresentando astrogliose e astrocitose nas áreas lesionadas e ao redor de vasos sangüíneos (barreira hemato-encefálica). Portanto, conclui-se que os astrócitos participam na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus e que, a etiologia da doença não é atribuída somente à deficiência de vitamina E na dieta. / The astrocytes are nervous cells which participate in the pathogenesis of various neuropathies of domestic animais. In poultry; the main neurologic disorder is Nutricional Encephalomalacia, caused by vitamin E deficiency. With the aim to study the behavior of astrocytes in the Nutricional Encephalomalacia pathogenesis in Gallus gallus domesticus, by immunohistochemistry, a trial of induction of the disorder was realized. Low vitamin E and oxidized oi! rations were prepared. There was no success in the experimental induction of Nutricional Encephalomalacia, however, in re-evaluated naturally occurring cases, it could be observed that astrocytes undergo astrogliosis and astocytosis in the lesioned area and around blood vessels (hemato-encephalic barrier). Altogether, it may be concluded that astrocytes participate in the pathogenesis of the poultry's Nutricional Encephalomalacia, and that the disorder is not only caused by diets with the lack of vitamin E.