Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os tripomastigotas metacíclicos de Trypanosoma cruz; expressam as glicoproteínas de superfícies GP82 e GP90 de maneira estágio-específica, as quais estão implicadas na invasão da célula hospedeira. Embora as proteínas não sejam expressam e os RNAm GP82 e GP90 fracamente detectáveis em epimastigotas, ensaios de transcrição em núcleos isolados mostraram que eles são transcritos constitutivamente nos dois estágios. Este resultado indica que o acúmulo de transcritos nas formas metacíclicas não é devido a um aumento na transcrição dos genes GP82 e GP90. Para investigar se a estabilidade dos RNAm seria a responsável pelas diferenças nos níveis destes RNAm, parasitas foram tratados com actinomicina D ou cicloheximida. Quando tratados com actinomicina D, as meia-vidas dos transcritos GP82 e GP90 foram maiores que 8 h em tripomastigotas metacíclicos e menor que 0,5 h e 2 h em epimastigotas, respectivamente. Na presença de cicloheximida, os níveis de RNAm GP82 e GP90 caíram levemente, enquanto que em epimastigotas os níveis destes RNAm aumentaram após 8 h de tratamento. Este efeito sugere um mecanismo de estabilização atuando em tripomastigotas metacíclicos e de desestabilização em epimastigotas, os quais parecem ser mediados por elementos presentes na 3' -UTR destes transcritos. Nós mostramos que a 3'-UTR da GP82 gera uma expressão maior do gene repórter GFP em tripomastigotas metacíclicos do que em epimastigotas. Consistente com este achado, análises de "northern blot" mostram que os RNAm GP82 e GP90 são mobilizados para os polissomas e conseqüentemente traduzidos apenas em tripomastigotas metacíclicos. Estes resultados sugerem que a estabilidade destes RNAm envolve interações com elementos regulatórios positivos e negativos na 3' -UTR. Estudos para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na estabilidade dos RNAm GP82 e GP90 estão em progresso em nosso laboratório. / Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes express the developmentally regulated GP82 and GP90 glycoproteins, which are implicated in host cell invasion. Although GP82 and GP90 mRNAs and proteins are not present and the mRNAs barely detectable in epimastigotes, nuclear run-on analysis showed that they are transcribed in both stages. This result indicates that accumulation of transcripts in metacyclic forms is not due to increased transcription of the GP82 and GP90 genes. To investigate whether mRNA stability may be responsible for the differences in the steady-state levels of these mRNAs, parasites were treated with actinomycin D or cycloheximide. When treated with actinomycin D, the half-lives estimated for GP82 and GP90 transcripts were longer than 8 h in metacyclic trypomastigotes and less than 0.5 h and 2 hours in epimastigotes, respectively. In the presence of cycloheximide, the levels of GP90 and GP82 mRNA decayed slightly after 8 h in metacyclic trypomastigotes, whereas in epimastigotes the levels of these mRNAs increased. This effect suggests a stabilizing mechanism acting in metacyclic trypomastigotes and a destabilizing mechanism in epimastigotes which could be mediated by an element present in the 3’-UTR of the transcripts. We show that the 3’-UTR of GP82 causes higher expression of the green fluorescent protein reporter gene in metacyclic trypomastigotes than in epimastigotes. Consistent with this finding, northern blot analysis showed that GP82 and GP90 mRNAs were mobilized to polysomes and consequently translated, but only in metacyclic trypomastigotes. These results suggest that the stability of these mRNAs involves interactions between positive and negative regulatory elements in the 3’-UTR. Work is ongoing to better understanding the mechanisms involved in changes in GP82 and GP90 mRNA stability. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los astrocitos son el tipo celular más abundante de la glia en el Sistema Nervioso Central y cuando son expuestos a factores sanguíneos durante un daño cerebral, éstos se vuelven “reactivos”, cambiando su forma estrellada a una de tipo fibroblasto. Los astrocitos “reactivos” también proliferan y migran al sitio dañado para formar la cicatriz glial, constituyendo uno de los mayores impedimentos para que ocurra la regeneración neuronal. Se piensa que estos cambios morfológicos que sufren los astrocitos in vivo, podrían tener una relación con los gatillados in vitro por Thy-1, una glicoproteína neuronal muy abundante, que se une a la Integrina αVβ3 en la membrana de astrocitos provocando cambios dramáticos en la forma de estas células. Con estos antecedentes se planteó la hipótesis de que la estimulación sostenida de la Integrina αVβ3por Thy-1 provoca la migración y/o proliferación de astrocitos, activando vías de transducción de señales que involucran a las proteínas quinasa PI3-K y Erk, respectivamente. Para poner a prueba esta hipótesis, se utilizaron ensayos in vitro de cicatrización de herida, la cual consiste en la remoción de una porción de células desde una monocapa de astrocitos en cultivo de la línea celular de rata DI-TNC1 con punta de pipeta y el subsecuente monitoreo de la migración de éstos al área libre de células después de la estimulación con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Adicionalmente, se realizaron en paralelo, análisis de Inmunofluorescencia indirecta a diferentes tiempos para la visualización de estructuras de avance como filopodios y lamelipodios en los astrocitos del borde de la herida estimulados con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Para demostrar la participación de la enzima PI3-K, los ensayos de cicatrización de herida se realizaron en presencia de inhibidores específicos de esta quinasa como son LY294002 y Wortmanina y mediante técnica de Inmunoblot se determinaron los niveles de fosforilación de un sustrato de esta enzima, la proteína Akt, en los astrocitos estimulados con el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A. Para determinar si el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A inducía cambios en la proliferación y viabilidad de los astrocitos, se utilizaron técnicas de MTS y de exclusión de azul de tripán, así como también se analizó el ciclo proliferativo de éstas células por citometría de flujo. Los resultados demuestran que Thy-1: 1) Induce la migración de los astrocitos DI-TNC1 al sitio de la herida; 2) Induce una mayor formación de estructuras de avance y migración como filopodios y lamelipodios, en los astrocitos del borde de la herida; 3) No induce proliferación ni aumento de la viabilidad de los astrocitos como tampoco cambios significativos en el ciclo proliferativo de éstas células; y 4) La quinasa PI3-K está implicada en la migración de los astrocitos estimulados por Thy-1. En conjunto, estos datos sugieren que la interacción de Thy-1 con la Integrina αVβ3 en la membrana de los astrocitos estimula cambios morfológicos llevando a estas células a una mayor adhesión celular para luego inducir su migración. Cabe destacar que la secuencia de eventos observados in vitro en este trabajo es similar a lo que ocurre en el proceso de astrogliosis, en el cual luego de un daño cerebral, los astrocitos se tornan reactivos, migran al sitio dañado y producen la cicatrización de la herida / Financiamiento: FIRCA 1R03TW006024 - FONDECYT 1040390 - FONDECYT 1070699

O Trypanosoma cruzi expressa um grupo de glicoprotcinas de superfície, denominadas Tc-85, que pertencem à superfumília gêmca das gp85/traus-sialidases. Nosso laboratório clonou e caracterizou um membro da fumília Tc85 (Tc85-11), cuja região carboxila tenninal (clone Tc85-1) adere em laminina e em células de mamífero. Usando peptídeos sintéticos, correspondendo em seqüência à Tc85-1, caracterizou-se o motivo mais conservado da superfamilia gênica das gp85/trans-sialidases (VTVxNVFLYNR), o qual não adere em laminina. Esse motivo foi chamado peptídeo J. Por cromatografia de extratos de membrana de cardiomiócitos em coluna de afmidade contendo peptídeo J, foi isolada uma molécula de 30kDa identificada como sendo a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase. A porção extracelular da subunidade β3 da Na+, K+ ATPase foi clonada e a interação in vitro desta proteína com peptídeo J foi observada. Deste modo, é sugerido aqui que a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase pode ter um papel importante na interação do parasita com a célula hospedeira. / Abstract not available.

O Trypanosoma cruzi expressa um grupo de glicoprotcinas de superfície, denominadas Tc-85, que pertencem à superfumília gêmca das gp85/traus-sialidases. Nosso laboratório clonou e caracterizou um membro da fumília Tc85 (Tc85-11), cuja região carboxila tenninal (clone Tc85-1) adere em laminina e em células de mamífero. Usando peptídeos sintéticos, correspondendo em seqüência à Tc85-1, caracterizou-se o motivo mais conservado da superfamilia gênica das gp85/trans-sialidases (VTVxNVFLYNR), o qual não adere em laminina. Esse motivo foi chamado peptídeo J. Por cromatografia de extratos de membrana de cardiomiócitos em coluna de afmidade contendo peptídeo J, foi isolada uma molécula de 30kDa identificada como sendo a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase. A porção extracelular da subunidade β3 da Na+, K+ ATPase foi clonada e a interação in vitro desta proteína com peptídeo J foi observada. Deste modo, é sugerido aqui que a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase pode ter um papel importante na interação do parasita com a célula hospedeira. / Abstract not available.

O prion celular (PrPc) é uma glicoproteína ligada à membrana plasmática por uma âncora de GPI (glycosylphosphatidylinositol). A sua isoforma anormal (PrPsc) é uma molécula infecciosa que causa várias doenças neurodegenerativas em mamíferos. A etiologia dessas doenças está associada a uma mudança conformacional pós-traducional de PrPc que ocorre após sua internalização (Prusiner, 1998). Na tentativa de desvendar as funções fisiológicas de PrPc, nosso grupo tem identificado e caracterizado as interações celulares que PrPc participa. A primeira delas é a interação entre PrPc e STI1 (Stress Inducible Protein 1). Essa interação transduz sinalização por cAMP e PKA levando a neuroproteção contra morte celular programada (Chiarini e cols, 2002; Zanata e cols, 2002). A segunda é a interação específica que existe entre PrPc e as proteínas da matriz extracelular, laminina e vitronectina, contribuindo para os processos neuronais, tais como crescimento, manutenção (Graner e cols., 2000 a e b) e regeneração dos neuritos (Hajj e cols., submetido), além da formação de memória de curta e longa duração (Coitinho e cols., submetido). Na primeira parte deste trabalho, procuramos investigar os genes regulados pelos sinais resultantes dessas interações e também pela remoção de PrPc usando a técnica de \"differential display\'\' RT-PCR. Na segunda parte do trabalho, caracterizamos que a interação PrPc - laminina é capaz de induzir uma sinalização transitória de cálcio, a qual ocorre mesmo na ausência de cálcio do meio extracelular. PrPc é uma molécula que cicla continuamente entre a membrana plasmática e os compartimentos intracelulares. Estudos recentes têm correlacionado o processo de internalização de PrPc com alguns dos seus papeis fisiológicos, tais como, homeostase de Cu2 + (Brown, 2001 ), interação com receptor de laminina (Gauczynski e cols, 2001) e até na conversão de PrPc para PrPsc (McKinley e cols, 1991; Arnold e cols, 1995). Portanto, na terceira parte deste trabalho, caracterizamos a localização e o tráfego celular de PrPc mostrando que PrPc está localizado na membrana plasmática e em compartimentos intracelulares e que trafega pelo Golgi, membrana plasmática, endossomos iniciais e de reciclagem. Foram mapeados ainda domínios na região amino-terminal responsáveis pela internalização de PrPc e na região carboxi-terminal como participantes da via secretora. Este trabalho contribuiu para o esclarecimento de alguns eventos biológicos relacionados à sinalização e ao tráfego de PrPc. Estes achados são de grande importância para a determinação das funções celulares de PrPc e ainda dos mecanismos envolvidos com as doenças relacionadas com esta molécula. / The cellular prion protein (PrPc) is a glycoprotein anchored to the plasma membrane by GPI (Glycosyl-phosphatidylinositol). Its abnormal isoform (PrPsc) is the infectious protein responsible for several neurodegenerative diseases. The main etiology of the prion diseases is related to conformational changes in the PrPc molecule, which occur after its internalization (Prusiner, 1998). In order to elucidate the physiological functions of PrPc, our group identified and characterized interactions between PrPc and other cellular molecules. The first is the interaction between PrPc and STI 1 (Stress Inducible Protein 1). This interaction has an important role in the neuroprotection against apoptosis through cAMP and PKA signaling (Chiarini et al., 2002; Zanata et al., 2002). PrPc also interacts with proteins of the extracellular matrix such as laminin and vitronetin. These interactions contribute for neurite outgrowth, maintenance and regeneration (Graner et al., 2000 a and b; Hajj et al., submitted) and also in memory formation (Coitinho et al., submitted). In the first part of this work we have applied the differential dysplay RTPCR technique in order to identify genes that are regulated by PrPc - STI 1 interaction and also by the deletion of PrPc. In the second part we have demonstrated that PrPc-laminin interaction induces transient calcium signaling in neuronal cells, which occurs even in the absence of extracellular calcium. PrPc cycles continuously between the plasma membrane and intracellular compartments. This mechanism is associated with some of the physiological function of PrPc, such as Cu2+ homeostasis (Brown, 2001 ), interaction with laminin receptor (Gauczynski et al., 2001 ), and PrPc conversion into PrPsc (McKinley et al., 1991; Arnold et al., 1995). Thus, in the third part of this project, we have characterized the PrPc localization at the cell surface and in intracellular compartments. The protein trafficking through Golgi apparatus, plasma membrane, early and recycling endosomes was also defined. Moreover, we have determinated that N-terminus PrPc domain is responsible for its internalization while C-terminus participates in PrPc delivery. Therefore, this work has contributed to elucidate biological events related to the cell signaling and trafficking of PrPc, which are important for the characterization of PrPc physiological functions and to understand the pathological mechanisms related to this molecule.

O prion celular (PrPc) é uma glicoproteína ligada à membrana plasmática por uma âncora de GPI (glycosylphosphatidylinositol). A sua isoforma anormal (PrPsc) é uma molécula infecciosa que causa várias doenças neurodegenerativas em mamíferos. A etiologia dessas doenças está associada a uma mudança conformacional pós-traducional de PrPc que ocorre após sua internalização (Prusiner, 1998). Na tentativa de desvendar as funções fisiológicas de PrPc, nosso grupo tem identificado e caracterizado as interações celulares que PrPc participa. A primeira delas é a interação entre PrPc e STI1 (Stress Inducible Protein 1). Essa interação transduz sinalização por cAMP e PKA levando a neuroproteção contra morte celular programada (Chiarini e cols, 2002; Zanata e cols, 2002). A segunda é a interação específica que existe entre PrPc e as proteínas da matriz extracelular, laminina e vitronectina, contribuindo para os processos neuronais, tais como crescimento, manutenção (Graner e cols., 2000 a e b) e regeneração dos neuritos (Hajj e cols., submetido), além da formação de memória de curta e longa duração (Coitinho e cols., submetido). Na primeira parte deste trabalho, procuramos investigar os genes regulados pelos sinais resultantes dessas interações e também pela remoção de PrPc usando a técnica de \"differential display\'\' RT-PCR. Na segunda parte do trabalho, caracterizamos que a interação PrPc - laminina é capaz de induzir uma sinalização transitória de cálcio, a qual ocorre mesmo na ausência de cálcio do meio extracelular. PrPc é uma molécula que cicla continuamente entre a membrana plasmática e os compartimentos intracelulares. Estudos recentes têm correlacionado o processo de internalização de PrPc com alguns dos seus papeis fisiológicos, tais como, homeostase de Cu2 + (Brown, 2001 ), interação com receptor de laminina (Gauczynski e cols, 2001) e até na conversão de PrPc para PrPsc (McKinley e cols, 1991; Arnold e cols, 1995). Portanto, na terceira parte deste trabalho, caracterizamos a localização e o tráfego celular de PrPc mostrando que PrPc está localizado na membrana plasmática e em compartimentos intracelulares e que trafega pelo Golgi, membrana plasmática, endossomos iniciais e de reciclagem. Foram mapeados ainda domínios na região amino-terminal responsáveis pela internalização de PrPc e na região carboxi-terminal como participantes da via secretora. Este trabalho contribuiu para o esclarecimento de alguns eventos biológicos relacionados à sinalização e ao tráfego de PrPc. Estes achados são de grande importância para a determinação das funções celulares de PrPc e ainda dos mecanismos envolvidos com as doenças relacionadas com esta molécula. / The cellular prion protein (PrPc) is a glycoprotein anchored to the plasma membrane by GPI (Glycosyl-phosphatidylinositol). Its abnormal isoform (PrPsc) is the infectious protein responsible for several neurodegenerative diseases. The main etiology of the prion diseases is related to conformational changes in the PrPc molecule, which occur after its internalization (Prusiner, 1998). In order to elucidate the physiological functions of PrPc, our group identified and characterized interactions between PrPc and other cellular molecules. The first is the interaction between PrPc and STI 1 (Stress Inducible Protein 1). This interaction has an important role in the neuroprotection against apoptosis through cAMP and PKA signaling (Chiarini et al., 2002; Zanata et al., 2002). PrPc also interacts with proteins of the extracellular matrix such as laminin and vitronetin. These interactions contribute for neurite outgrowth, maintenance and regeneration (Graner et al., 2000 a and b; Hajj et al., submitted) and also in memory formation (Coitinho et al., submitted). In the first part of this work we have applied the differential dysplay RTPCR technique in order to identify genes that are regulated by PrPc - STI 1 interaction and also by the deletion of PrPc. In the second part we have demonstrated that PrPc-laminin interaction induces transient calcium signaling in neuronal cells, which occurs even in the absence of extracellular calcium. PrPc cycles continuously between the plasma membrane and intracellular compartments. This mechanism is associated with some of the physiological function of PrPc, such as Cu2+ homeostasis (Brown, 2001 ), interaction with laminin receptor (Gauczynski et al., 2001 ), and PrPc conversion into PrPsc (McKinley et al., 1991; Arnold et al., 1995). Thus, in the third part of this project, we have characterized the PrPc localization at the cell surface and in intracellular compartments. The protein trafficking through Golgi apparatus, plasma membrane, early and recycling endosomes was also defined. Moreover, we have determinated that N-terminus PrPc domain is responsible for its internalization while C-terminus participates in PrPc delivery. Therefore, this work has contributed to elucidate biological events related to the cell signaling and trafficking of PrPc, which are important for the characterization of PrPc physiological functions and to understand the pathological mechanisms related to this molecule.

Sialidose é uma doença neurossomática causada pela deficiência congênita da neuraminidase-1 (Neu1), enzima envolvida na regulação do catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. Com o acúmulo de sialoglicoconjugados, ocorre comprometimento sistêmico e neurológico. Achados histológicos musculares incluem expansão da matriz extracelular (MEC) devido à proliferação anormal de fibroblastos, invasão das fibras musculares por componentes da MEC, fragmentação do citoplasma, formação vacuolar e atrofia das fibras musculares. Entretanto o mecanismo da atrofia muscular na deficiência de Neu1 não está completamente esclarecido, sendo o objetivo desse estudo. Desnervou-se o músculo gastrocnêmio direito de camundongos com deficiência de Neu1 (Neu1 -/-) e de controles Neu1 +/+. Os animais foram eutanasiados 0, 3, 7, 14 e 21 dias pós desnervação. Os músculos desnervados e contralaterais foram submetidos às seguintes análises: 1) histologia geral e medida da área transversa das fibras; 2) autofagia, através da avaliação da presença de vacúolos autofágicos por estudo ultraestrutural e da análise da expressão da proteína LC3; 3) ativação do sistema lisossomal, por reação de fosfatase ácida e análise da expressão proteica de catepsina L e lamp1; 4) deposição de colágeno e infiltração de tecido conjuntivo no tecido muscular; 5) níveis das proteínas Akt e GSK3b; 6) expressão dos atrogenes MuRF1 e Atrogina-1; 7) níveis da proteína MyoD, relacionada à diferenciação muscular; e 8) expressão dos genes Neu1, Neu2, Neu3 e Neu4. Os animais Neu1-/- apresentaram menor peso corporal e muscular compararando-se com animais Neu1 +/+. Houve redução progressiva da área das fibras dos músculos desnervados em relação aos músculos contralaterais. Os animais Neu1-/- apresentaram atrofia muscular basal, com aumento acentuado dos espaços endomisiais e perimisiais. Ocorreu formação de vacúolos autofágicos a partir de 14 dias de desnervação tanto em animais Neu1+/+ quanto em Neu1-/-. Os níveis de expressão proteica de catepsina L e de lamp1 aumentaram a partir de 14 dias de desnervação, mais notadamente em músculos desnervados de camundongos Neu1-/-. A expressão proteica de colágeno III mostrou-se aumentada em animais Neu1-/-, principalmente após desnervação. A expressão proteica da forma fosforilada do Akt (forma ativada) diminuiu após 21 dias de desnervação principalmente em músculos desnervados de animais Neu1+/+. Os níveis de PGSK3 b, forma inativa de GSK3b, diminuíram após a desnervação, em animais Neu1+/+ e animais Neu1-/-. Houve aumento na expressão gênica de Atrogina-1 e MuRF1 após 3 e 7 dias de desnervação, respectivamente; a expressão gênica de Atrogina-1 nos camundongos Neu1-/- teve um aumento atrasado, mostrando diferença significante após 7 dias de desnervação. Não houve diferença significativa entre níveis proteicos de MyoD. A expressão gênica de Neu1 mostrou-se elevada em músculos desnervados de animais Neu1+/+. Conclui-se, portanto, que a Neu1 parece atuar na regulação da massa muscular principalmente controlando o processo de ativação do sistema lisossomal, porém aparentemente sem afetar a autofagia / Sialidosis, a severe neurosomatic disease, results from congenital neuraminidase-1 (Neu1) deficiency. This enzyme regulates the catabolism of sialoglycoconjugates in the lysosomes. Systemic and neurologic manifestations occur due to the sialoglycoconjugates accumulation. In the mouse model for Neu1 deficiency, the muscle histologic findings include extracellular matrix (ECM) expansion, due to abnormal fibroblast proliferation, muscle fibers invasion by ECM components, cytoplasm fragmentation, vacuolar formation and muscle atrophy. Nevertheless the mechanisms of muscle atrophy in Neu1 deficiency are not completely known. This study was designed to investigate Neu1 involvement in muscle atrophy process. Denervation of gastrocnemius muscle was performed by sectioning sciatic nerve from Neu1 deficient mice (Neu1 -/-) and from normal control Neu1 +/+; the animals were euthanized 0, 3, 7, 14 and 21 days after denervation. Denervated and control muscles were collected and submitted to several analysis: 1) histological; 2) autophagic vacuoles formation, performed by ultrastructural analysis and LC3 protein expression; 3) acid phosphatase reaction, lamp1 and cathepsin L protein expression, to analyze lysosomal activation; 4) collagen deposition and fibrous formation; 5) proteins involved with muscle trophism, Akt and GSK3b; 6) MuRF1 and Atrogin-1 gene expression; 7) MyoD protein expression; 8) Neu1, Neu2, Neu3 and Neu4 genes expression. Neu1 -/- mice presented decreased body and muscle weight comparing to Neu1 +/+ animals. Muscle fiber cross-sectional area was reduced in denervated muscles comparing to contralateral muscles. Neu1 -/- mice muscles presented basal atrophy and increase of endomisial and perimisial spaces, which became more evident after denervation. After 14 days of denervation, autophagosome formation was noticed on Neu1 +/+ and Neu1-/- animals. Cathepsin L protein levels were increased after 14 and 21 days of denervation, especially in denervated muscles from Neu1 -/- mice. Lamp1 protein expression was increased in Neu1-/- animals. Type III collagen protein levels were increased in Neu1-/- animals. There were no significant differences between MyoD protein levels. P-Akt, active form of Akt protein levels, decreased after 21 days of denervation, especially in denervated muscles from control group animals, indicating that protein synthesis is decreased. P-GSK3b, inactive form of GSK3b decreased in denervated muscles from Neu1 -/- and Neu1 +/+ animals, which indicates that this protein remained activated during muscle atrophy process. There were significant differences in Atrogin-1 and MuRF1 gene expression levels after 3 and 7 days of denervation. Neu1 -/- animals muscles presented a delayed Atrogin-1 response. Neu1 gene expression was increased in denervated muscles from Neu1 +/+ mice. These findings suggest that Neu1 seems to act in the regulation of muscle mass mainly by controlling the process of lysosomal system activation, but apparently without affecting autophagy

Sialidose é uma doença neurossomática causada pela deficiência congênita da neuraminidase-1 (Neu1), enzima envolvida na regulação do catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. Com o acúmulo de sialoglicoconjugados, ocorre comprometimento sistêmico e neurológico. Achados histológicos musculares incluem expansão da matriz extracelular (MEC) devido à proliferação anormal de fibroblastos, invasão das fibras musculares por componentes da MEC, fragmentação do citoplasma, formação vacuolar e atrofia das fibras musculares. Entretanto o mecanismo da atrofia muscular na deficiência de Neu1 não está completamente esclarecido, sendo o objetivo desse estudo. Desnervou-se o músculo gastrocnêmio direito de camundongos com deficiência de Neu1 (Neu1 -/-) e de controles Neu1 +/+. Os animais foram eutanasiados 0, 3, 7, 14 e 21 dias pós desnervação. Os músculos desnervados e contralaterais foram submetidos às seguintes análises: 1) histologia geral e medida da área transversa das fibras; 2) autofagia, através da avaliação da presença de vacúolos autofágicos por estudo ultraestrutural e da análise da expressão da proteína LC3; 3) ativação do sistema lisossomal, por reação de fosfatase ácida e análise da expressão proteica de catepsina L e lamp1; 4) deposição de colágeno e infiltração de tecido conjuntivo no tecido muscular; 5) níveis das proteínas Akt e GSK3b; 6) expressão dos atrogenes MuRF1 e Atrogina-1; 7) níveis da proteína MyoD, relacionada à diferenciação muscular; e 8) expressão dos genes Neu1, Neu2, Neu3 e Neu4. Os animais Neu1-/- apresentaram menor peso corporal e muscular compararando-se com animais Neu1 +/+. Houve redução progressiva da área das fibras dos músculos desnervados em relação aos músculos contralaterais. Os animais Neu1-/- apresentaram atrofia muscular basal, com aumento acentuado dos espaços endomisiais e perimisiais. Ocorreu formação de vacúolos autofágicos a partir de 14 dias de desnervação tanto em animais Neu1+/+ quanto em Neu1-/-. Os níveis de expressão proteica de catepsina L e de lamp1 aumentaram a partir de 14 dias de desnervação, mais notadamente em músculos desnervados de camundongos Neu1-/-. A expressão proteica de colágeno III mostrou-se aumentada em animais Neu1-/-, principalmente após desnervação. A expressão proteica da forma fosforilada do Akt (forma ativada) diminuiu após 21 dias de desnervação principalmente em músculos desnervados de animais Neu1+/+. Os níveis de PGSK3 b, forma inativa de GSK3b, diminuíram após a desnervação, em animais Neu1+/+ e animais Neu1-/-. Houve aumento na expressão gênica de Atrogina-1 e MuRF1 após 3 e 7 dias de desnervação, respectivamente; a expressão gênica de Atrogina-1 nos camundongos Neu1-/- teve um aumento atrasado, mostrando diferença significante após 7 dias de desnervação. Não houve diferença significativa entre níveis proteicos de MyoD. A expressão gênica de Neu1 mostrou-se elevada em músculos desnervados de animais Neu1+/+. Conclui-se, portanto, que a Neu1 parece atuar na regulação da massa muscular principalmente controlando o processo de ativação do sistema lisossomal, porém aparentemente sem afetar a autofagia / Sialidosis, a severe neurosomatic disease, results from congenital neuraminidase-1 (Neu1) deficiency. This enzyme regulates the catabolism of sialoglycoconjugates in the lysosomes. Systemic and neurologic manifestations occur due to the sialoglycoconjugates accumulation. In the mouse model for Neu1 deficiency, the muscle histologic findings include extracellular matrix (ECM) expansion, due to abnormal fibroblast proliferation, muscle fibers invasion by ECM components, cytoplasm fragmentation, vacuolar formation and muscle atrophy. Nevertheless the mechanisms of muscle atrophy in Neu1 deficiency are not completely known. This study was designed to investigate Neu1 involvement in muscle atrophy process. Denervation of gastrocnemius muscle was performed by sectioning sciatic nerve from Neu1 deficient mice (Neu1 -/-) and from normal control Neu1 +/+; the animals were euthanized 0, 3, 7, 14 and 21 days after denervation. Denervated and control muscles were collected and submitted to several analysis: 1) histological; 2) autophagic vacuoles formation, performed by ultrastructural analysis and LC3 protein expression; 3) acid phosphatase reaction, lamp1 and cathepsin L protein expression, to analyze lysosomal activation; 4) collagen deposition and fibrous formation; 5) proteins involved with muscle trophism, Akt and GSK3b; 6) MuRF1 and Atrogin-1 gene expression; 7) MyoD protein expression; 8) Neu1, Neu2, Neu3 and Neu4 genes expression. Neu1 -/- mice presented decreased body and muscle weight comparing to Neu1 +/+ animals. Muscle fiber cross-sectional area was reduced in denervated muscles comparing to contralateral muscles. Neu1 -/- mice muscles presented basal atrophy and increase of endomisial and perimisial spaces, which became more evident after denervation. After 14 days of denervation, autophagosome formation was noticed on Neu1 +/+ and Neu1-/- animals. Cathepsin L protein levels were increased after 14 and 21 days of denervation, especially in denervated muscles from Neu1 -/- mice. Lamp1 protein expression was increased in Neu1-/- animals. Type III collagen protein levels were increased in Neu1-/- animals. There were no significant differences between MyoD protein levels. P-Akt, active form of Akt protein levels, decreased after 21 days of denervation, especially in denervated muscles from control group animals, indicating that protein synthesis is decreased. P-GSK3b, inactive form of GSK3b decreased in denervated muscles from Neu1 -/- and Neu1 +/+ animals, which indicates that this protein remained activated during muscle atrophy process. There were significant differences in Atrogin-1 and MuRF1 gene expression levels after 3 and 7 days of denervation. Neu1 -/- animals muscles presented a delayed Atrogin-1 response. Neu1 gene expression was increased in denervated muscles from Neu1 +/+ mice. These findings suggest that Neu1 seems to act in the regulation of muscle mass mainly by controlling the process of lysosomal system activation, but apparently without affecting autophagy