Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As ações biológicas e os efeitos farmacológicos da bradicinina (BK) são mediados por dois receptores, um constitutivo (B2R) e outro induzido (B1R). No fígado, nós verificamos que a resposta hipertensiva portal à BK é mediada por receptores B2, mas não por receptores B1, tanto em ratos normais quanto naqueles submetidos a diferentes agentes de agressão hepática. Nesta última situação verificamos que há aumento da expressão de B1R com a progressão para a cirrose. O objetivo deste trabalho é verificar se o B1R está envolvido no processo de fibrogênese. Para tanto 3 modelos experimentais de fibrose foram utilizados em camundongos knockout de B1R (KOB1R) e selvagens: a) com injeções intraperitoniais (ip) de CCl4 (6 semanas); b) injeções ip de soro de porco (10 semanas) e c) ligadura do ducto biliar (BDL). Após uma semana da última injeção, os fígados foram exanguinados, retirados, pesados e processados. A fibrose foi avaliada por análise histológica (coloração com Picrus-Sirius), e quantificada pelo programa AxionVision 4.5 da Carl Zeiss. Avaliação da fibrogênese foi estudada pela expressão de “heat shock protein”-47 (HSP 47) analisada por Western Blotting. A indução da fibrose com CCl4 foi obtida com sucesso nos camundongos selvagens e KOB1R, com o tradicional padrão de formação de septos hexagonais. O modelo BDL apresentou fibrose com padrão característico de colestase em ambos animais. Pela análise morfométrica, a quantidade de colágeno (% da área total) nos animais KOB1R-CCl4 (1,9 ± 0,3, n=5) é significativamente maior (ANOVA, p = 0,006) que nos animais selvagensCCl4 (1,0 ± 0,2, n=7), bem como quando comparado com o respectivo controle (KOB1R–óleo) (0,4 ± 0,3%, n=3). Por outro lado, a quantidade de colágeno nos animais KOB1R-BDL (3,1 ± 1,4, n=5) é significativamente menor que nos selvagens (16,1 ± 3,1, n=6). A expressão de HSP 47 está significativamente (t-test, p = 0,04) aumentada nos animais KOB1R (10,6 ± 1,6 x 106 UA), comparada aos animais selvagens (6,1 ± 1,3 x 106 UA), ambos tratados com CCl4, confirmando o pior padrão de fibrose observado também na quantificação morfométrica. No modelo de BDL, houve também maior expressão de HSP 47 nos animais KOB1R que nos animais selvagens Em conclusão, nossos resultados demonstram a participação do sistema calicreína-cinina na fibrogênese hepática e sugere que a ativação do B1R protege o fígado da fibrose hepática no modelo de CCl4, mas não no modelo BDL. Estes dados são importantes considerando o potencial terapêutico com o uso de agonistas no tratamento e/ou prevenção da fibrose. / The biological and pharmacological effects of bradykinin (BK) are mediated by a constitutive B2 and induced B1R. In the liver, we verified that the portal hypertensive response to BK is mediated by B2R, but not by B1R, in normal rats and those submitted to different kind of hepatic injury. In the latter, we also verified an increased expression of B1R in relation to the progression of the cirrhosis. The aim of this work is to analyze the role of BK in the fibrogenesis in wild and knockout of B1R (KOB1R) mice. Three models of fibrosis were used: a) intraperitoneal (ip) injection of of CCl4 (6 weeks); b) ip injection of porcine serum (10 weeks) and c) bile duct ligation (BDL). After one week of injection, the liver were exsanguinated, removed, weighted and processed. Fibrosis was evaluated by histological analysis (Picrus-Sirius staining) and quantified by AxionVision 4.5 software (Carl Zeiss). Fibrogenesis was evaluated by heat shock protein-47 (HSP 47) expression by Western Blotting. Porcine serum did not induce fibrosis in all animals. CCl4 induced fibrosis in wild and KOB1R in the traditional pattern with hexagonal septa. BDL resulted in fibrosis with the characteristic pattern of colestasis. By morphometric analysis, hepatic collagen (% of total area) of KOB1R-CCl4 (1,9 ± 0,3, n=5) was significantly higher (ANOVA, p = 0,006) than in wild-CCl4 (1,0 ± 0,2, n=7). On the other hand, hepatic collagen in KOB1R-BDL (3,1 ± 1,4, n=5) is lower than in wild mice (16,1 ± 3,1, n=6). The liver HSP 47 expression in CCl4 model is significantly (t-test, p = 0,04) higher in KOB1R (10,6 ± 1,6 x 106 UA), compared to wild mice (6,1 ± 1,3 x 106 UA). Interestingly, hepatic HSP 47 expression in KOB1R was also higher than in wild mice. In conclusion, our results suggested that bradykinin participates in the fibrogenesis, and probably activation of B1R protects liver from hepatic fibrosis in the CCl4 model, but not in BDL model. This data is important considering the potential therapeutic with the use of agonist in the threatment and/or prevention of liver fibrosis. / FAPESP: 02/05260-6 / FAPESP: 06/58533-0 / FAPESP: 08/55928-0 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Barroso Patrícia (barroso.p2010@gmail.com) on 2013-04-04T19:59:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação milton galdino 05062012 - DEFINITIVA.pdf: 2594051 bytes, checksum: 1b7dc66215e94866d37e7c0e7c6430df (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-04T19:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação milton galdino 05062012 - DEFINITIVA.pdf: 2594051 bytes, checksum: 1b7dc66215e94866d37e7c0e7c6430df (MD5) Previous issue date: 2011 / A Linfadenite Caseosa, causada por Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis, é uma enfermidade de alta prevalência nos rebanhos de pequenos ruminantes da região semi-árida brasileira, trazendo grandes prejuízos particularmente para os pequenos produtores, pois a criação desses animais é a principal atividade de subsistência nesta região. O presente trabalho teve como objetivo avaliar aspectos da resposta imune de camundongos da linhagem C57/Black 6 selvagem e C57/Black 6 Knockout para o óxido nítrico (KO-NO), durante a infecção experimental por C. pseudotuberculosis. A utilização de animais Knockout possibilitou a compreensão da atuação de alguns tipos celulares do sistema imune frente ao patógeno, já que se sabe que o óxido nítrico é um importante agente na eliminação de microrganismos intracelulares. Para tanto, foram utilizados e eutanasiados 28 animais em dois tempos (7 e 14 dias), divididos em quatro grupos, a saber: grupo 1 – controle – com 4 animais selvagens; grupo 2 - infectado por C. pseudotuberculosis – com 10 animais selvagens; grupo 3 – controle – com 4 animais KO-NO; e grupo 4 – infectado por C. pseudotuberculosis – com 10 animais KO-NO. Na metodologia avaliamos a suscetibilidade de camundongos KO-NO, na infecção, verificando que animais C57/Black 6 KO-NO são susceptíveis à infecção por C. pseudotuberculosis com mortalidade observada a partir do 4º dia, o que indica a importância dessa molécula na defesa inata contra essa bactéria. No estudo de células do lavado peritoneal os neutrófilos foram as células encontradas em maior número no infiltrado dos animais KO-NO, o que pode indicar um mecanismo compensatório pela ausência do óxido nítrico. Com o estudo do baço observou-se a presença de linfócitos, com predomínio de TCD8 entre as células esplênicas de ambos os grupos, o que sugere a importância dessa sub-população na resposta imune contra esse microorganismo. A partir da presença de granulomas verificou-se a maior presença nos animais KO-NO infectados com 7 dias, sendo os linfonodos os mais afetados, o que aponta também para uma tentativa compensatória de conter a infecção; constatou-se uma maior recuperação bacteriana de linfonodo mesentério nos camundongos KO-NO, provavelmente devido a sua maior capacidade de escape. Foi realizado também o estudo de anticorpos séricos, através da detecção de IgG total e subclasses, o qual foi observado uma produção 14 dias pós infecção, tanto nos animais selvagens como nos KO-NO, similar aos animais controle, o que indica uma resposta humoral tardia por esse tipo de anticorpo para esse microorganismo. Os resultados obtidos sugerem a importância do óxido nítrico no processo de combate à infecção por este microrganismo, posto que os animais KO-NO para esta substância foram os mais afetados pelo processo infeccioso instalado. / Universidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde

Introdução: Os fitoesteróis (FE) são reconhecidos por reduzirem a concentração plasmática de LDL-colesterol, sendo importantes coadjuvantes no tratamento da hipercolesterolemia moderada. Entretanto, estudos publicados recentemente demonstram resultados conflitantes em relação à eficiência dos FE na prevenção da aterosclerose. Além disso, algumas investigações evidenciaram que o aumento da concentração plasmática de FE está positivamente relacionado ao risco de desenvolvimento de aterosclerose. Com a finalidade de elucidar a sua ação sobre esses parâmetros, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de FE no desenvolvimento da aterosclerose em camundongos com ablação gênica para o receptor de LDL (LDLr-KO). Métodos: Os animais foram alimentados durante 16 semanas, com dieta rica em gordura (40% do valor calórico total da dieta), suplementada (grupo FE; 2%, n=10) ou não (Controle; n=10) com FE. Foram avaliadas as concentrações plasmáticas e hepáticas de colesterol, triglicérides, FE (beta-sitosterol, campesterol e latosterol). Na aorta dos animais, determinaram-se as concentrações de colesterol total, colesterol livre e éster e FE, além do infiltrado de macrófagos e infiltrado de lípides. Nos macrófagos do peritôneo dos animais, os quais assemelham-se aos presentes na artéria, avaliou-se a expressão de RNA mensageiro dos genes envolvidos no efluxo e influxo de colesterol (ABCA1, ABCG1, LOX1 e CD36). Também determinou-se as concentrações de FE no intestino e baço dos animais. Resultados: Conforme esperado, o consumo de FE induziu elevação plasmática dos principais FE, campesterol e de beta-sitosterol, reduzindo a concentração de colesterol no plasma. Houve aumento nas concentrações hepáticas de triglicérides e FE, entretanto, não foram observadas diferenças entre os grupos nas expressões de RNA mensageiro de genes lipolíticos (CPT, PPAR alfa) e lipogênicos (SREBP1-c, MTP, LXR e PPAR gamma) no fígado. Não houve, também, alteração no SREBP2, gene relacionado à síntese de colesterol. O conteúdo de colesterol total na artéria foi menor nos animais do grupo FE, não diferindo entre as formas livre e éster. As concentrações de FE na artéria foram iguais entre os grupos. A área de lesão no grupo FE foi menor em relação ao grupo-controle. A suplementação com FE induziu redução na expressão de RNA mensageiro de ABCG1, não interferindo na expressão dos outros genes estudados na artéria. Conclusão: Os achados deste estudo demonstram que a elevação de FE no plasma não induziu o seu acúmulo na parede da artéria e preveniu o desenvolvimento da aterosclerose / Introduction: The plasma cholesterol-reducing effect of hytosterols (PS) is well recognized and they are considered important adjuncts in the treatment of moderate hypercholesterolemia. However, recent studies have shown conflicting results regarding the efficiency of PS in the prevention of atherosclerosis. In addition, some studies showed that the increase in plasma PS concentration is positively correlated to the risk of atherosclerosis. In order to elucidate its action on these parameters, the objective of this study was to evaluate the effects of PS supplementation in the development of atherosclerosis in LDL receptor knock-out mice (LDLr -KO). Methods: The animals were fed during 16 weeks with high fat diet (40 % of calories as fat), supplemented (PS group, 2%, n = 10) or not (Control, n = 10) with PS. Plasma and liver concentrations of cholesterol, triglycerides, PS (beta - sitosterol, campesterol and lathosterol) were evaluated. In the aorta of the animals, the concentrations of total cholesterol, free cholesterol, cholesterol ester and PS, besides macrophage and lipids infiltration were determined. The mRNA expression of genes involved in cholesterol efflux and influx (ABCA1, ABCG1, LOX1 and CD36) were evaluated, in peritoneum macrophage, which resemble those present in the artery. It was also determined the intestine and spleen PS concentrations from the animals of both groups. Results: As expected, PS supplementation induced increasing plasma concentration of the main PS, campesterol and beta -sitosterol and reducing cholesterol plasma concentration. It was observed an increase so intestine and spleen PS concentrations. There was an increase in hepatic triglyceride concentrations and PS, however, no differences were observed between the groups of hepatic mRNA expression of lipolytic (CPT, PPARalfa) and lipogenic genes (SREBP1c, MTP, CPT, LXR, and PPAR gamma). There was no difference on SREBP2, gene related to cholesterol synthesis. The content of total cholesterol in the artery was lower in PS group animals however did not differ between the free and ester forms. Artery PS concentrations did not differ between groups. The lesion area in the PS group was lower than in the control group. PS supplementation induced reduction in mRNA expression of ABCG1, not affecting the expression of other genes studied in artery. Conclusion: The findings of this study demonstrate that the elevation of plasma PS concentration did not induce its accumulation in the arterial wall and prevented the development of atherosclerosis

Sepse é a primeira causa de morte em Unidades de Terapia Intensiva. A gravidade dessa doença é considerada conseqüência de um desequilíbrio da resposta inflamatória e, apesar dos avanços em diagnóstico e tratamento, os índices de mortalidade se mantêm inalterados. O papel dos receptores Fc de immunoglobulinas nesta situação é pouco esclarecido. Tais receptores deflagram respostas imunes opostas, que dependem do receptor envolvido e podem ser tanto ativatórias, quanto inibitórias. As respostas ativatórias são atribuídas a um motivo chamado ITAM, enquanto as inibitórias são relacionadas ao motivo ITIM. Camundongos apresentam dois receptores de IgG ativatórios (FcγRI e FcγRIII), que portam motivos ITAM, associados a uma sub-unidade conhecida como cadeia gamma, assim como um receptor de IgG que apresenta um motivo ITIM na sua porção intra-citoplasmática (FcγRII). Este trabalho teve como objetivo o estudo do papel destes receptores em bacteremias e sepse. Para isso, utilizamos um modelo de peritonite induzida por ligadura e punção cecal. Este projeto descreve pela primeira vez, um papel importante do FcRγII na indução de apoptose em linfócitos B, durante infecção bacteriana severa. Nossos resultados colocaram em evidência, ainda, o fato de que animais deficientes em cadeia gamma apresentam mortalidade diminuída, quando submetidos a esse modelo de peritonite, e que essa diminuição é associada a menores valores de TNFα no soro e nos fluidos peritoneais, menor recrutamento peritoneal de células inflamatórias, assim como a um surpreendente aumento na fagocitose de E. coli. Hemocultura e cultura do lavado peritoneal desses animais revelaram uma flora multimicrobiana, enquanto camundongos selvagens apresentaram uma forte predominância de E. coli e um número total bastante superior de bactérias. Esse papel inibitório da cadeia gamma pode estar relacionado a mecanismos de auto-tolerância. Lisado total de células peritoneais de camundongos deficientes em cadeia gamma apresentam fosforilação aumentada de diversas proteínas, quando comparados a lisados obtidos, a partir de camundongos selvagens. Estudos semelhantes realizados com camundongos transgênicos para o receptor de IgA (FcαRI), entretanto, não demonstraram um papel crucial desse receptor nesta doença. Este trabalho abre, portanto, novas perspectivas para o tratamento de doenças infecciosas, através de intervenção sobre a cadeia gamma e coloca em rediscussão os conceitos atuais de ITAM e ITIM. / Sepsis is the first cause of death in Critical Care Units and despite the development in its diagnosis and treatment, mortality remains unaffected. The role of immunoglobulin Fc receptors in sepsis is not clearly understood. These receptors initiate opposing responses, depending on their aggregation by the ligand and can induce activating or inhibitory responses. The activating responses are attributed to a motif known as ITAM, and the inhibitory responses to another one called ITIM. Mice express two activating IgG receptors (FcγRI et FcγRIII) which have ITAM motifs in the intracytoplasmic domain of an associated subunit, called the FcRγ chain, as well as an inhibitory IgG receptor which possesses an ITIM motif in its intracytoplasmic domain. The objective of this work is to study the importance of these receptors in bacteremia and in sepsis. To this aim, we have used a peritonitis model, induced by cecal ligation and puncture (CLP). This project describes for the first time, an important role of FcγRII in B lymphocytes apoptosis. Moreover, our results show that FcRγ chain knockout mice have a decreased mortality in this model, which is associated to diminished TNFα serum and peritoneal fluids levels, to a reduced recruitment of peritoneal inflammatory cells and to a surprising increase in E. coli phagocytosis. Blood and peritoneal fluid cultures have shown a polymicrobial flora 24 hours post-CLP for FcRγ-chain deficient mice, whereas wild-type mice present a strong predominance of E. coli in the same cultures and an increased bacteria total count. Lysates from FcRγ-chain deficient peritoneal cells revealed augmented phosphorylation of many proteins, as compared to wild-type cells. This FcRγ chain inhibitory role could be related to self-tolerance mechanisms. This work opens new perspectives for the treatment of bacterial diseases, proposing FcRγ chain targeting and the reexamination of the actual concepts of ITAM and ITIM.

Sepse é a primeira causa de morte em Unidades de Terapia Intensiva. A gravidade dessa doença é considerada conseqüência de um desequilíbrio da resposta inflamatória e, apesar dos avanços em diagnóstico e tratamento, os índices de mortalidade se mantêm inalterados. O papel dos receptores Fc de immunoglobulinas nesta situação é pouco esclarecido. Tais receptores deflagram respostas imunes opostas, que dependem do receptor envolvido e podem ser tanto ativatórias, quanto inibitórias. As respostas ativatórias são atribuídas a um motivo chamado ITAM, enquanto as inibitórias são relacionadas ao motivo ITIM. Camundongos apresentam dois receptores de IgG ativatórios (FcγRI e FcγRIII), que portam motivos ITAM, associados a uma sub-unidade conhecida como cadeia gamma, assim como um receptor de IgG que apresenta um motivo ITIM na sua porção intra-citoplasmática (FcγRII). Este trabalho teve como objetivo o estudo do papel destes receptores em bacteremias e sepse. Para isso, utilizamos um modelo de peritonite induzida por ligadura e punção cecal. Este projeto descreve pela primeira vez, um papel importante do FcRγII na indução de apoptose em linfócitos B, durante infecção bacteriana severa. Nossos resultados colocaram em evidência, ainda, o fato de que animais deficientes em cadeia gamma apresentam mortalidade diminuída, quando submetidos a esse modelo de peritonite, e que essa diminuição é associada a menores valores de TNFα no soro e nos fluidos peritoneais, menor recrutamento peritoneal de células inflamatórias, assim como a um surpreendente aumento na fagocitose de E. coli. Hemocultura e cultura do lavado peritoneal desses animais revelaram uma flora multimicrobiana, enquanto camundongos selvagens apresentaram uma forte predominância de E. coli e um número total bastante superior de bactérias. Esse papel inibitório da cadeia gamma pode estar relacionado a mecanismos de auto-tolerância. Lisado total de células peritoneais de camundongos deficientes em cadeia gamma apresentam fosforilação aumentada de diversas proteínas, quando comparados a lisados obtidos, a partir de camundongos selvagens. Estudos semelhantes realizados com camundongos transgênicos para o receptor de IgA (FcαRI), entretanto, não demonstraram um papel crucial desse receptor nesta doença. Este trabalho abre, portanto, novas perspectivas para o tratamento de doenças infecciosas, através de intervenção sobre a cadeia gamma e coloca em rediscussão os conceitos atuais de ITAM e ITIM. / Sepsis is the first cause of death in Critical Care Units and despite the development in its diagnosis and treatment, mortality remains unaffected. The role of immunoglobulin Fc receptors in sepsis is not clearly understood. These receptors initiate opposing responses, depending on their aggregation by the ligand and can induce activating or inhibitory responses. The activating responses are attributed to a motif known as ITAM, and the inhibitory responses to another one called ITIM. Mice express two activating IgG receptors (FcγRI et FcγRIII) which have ITAM motifs in the intracytoplasmic domain of an associated subunit, called the FcRγ chain, as well as an inhibitory IgG receptor which possesses an ITIM motif in its intracytoplasmic domain. The objective of this work is to study the importance of these receptors in bacteremia and in sepsis. To this aim, we have used a peritonitis model, induced by cecal ligation and puncture (CLP). This project describes for the first time, an important role of FcγRII in B lymphocytes apoptosis. Moreover, our results show that FcRγ chain knockout mice have a decreased mortality in this model, which is associated to diminished TNFα serum and peritoneal fluids levels, to a reduced recruitment of peritoneal inflammatory cells and to a surprising increase in E. coli phagocytosis. Blood and peritoneal fluid cultures have shown a polymicrobial flora 24 hours post-CLP for FcRγ-chain deficient mice, whereas wild-type mice present a strong predominance of E. coli in the same cultures and an increased bacteria total count. Lysates from FcRγ-chain deficient peritoneal cells revealed augmented phosphorylation of many proteins, as compared to wild-type cells. This FcRγ chain inhibitory role could be related to self-tolerance mechanisms. This work opens new perspectives for the treatment of bacterial diseases, proposing FcRγ chain targeting and the reexamination of the actual concepts of ITAM and ITIM.

Introdução: Os fitoesteróis (FE) são reconhecidos por reduzirem a concentração plasmática de LDL-colesterol, sendo importantes coadjuvantes no tratamento da hipercolesterolemia moderada. Entretanto, estudos publicados recentemente demonstram resultados conflitantes em relação à eficiência dos FE na prevenção da aterosclerose. Além disso, algumas investigações evidenciaram que o aumento da concentração plasmática de FE está positivamente relacionado ao risco de desenvolvimento de aterosclerose. Com a finalidade de elucidar a sua ação sobre esses parâmetros, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de FE no desenvolvimento da aterosclerose em camundongos com ablação gênica para o receptor de LDL (LDLr-KO). Métodos: Os animais foram alimentados durante 16 semanas, com dieta rica em gordura (40% do valor calórico total da dieta), suplementada (grupo FE; 2%, n=10) ou não (Controle; n=10) com FE. Foram avaliadas as concentrações plasmáticas e hepáticas de colesterol, triglicérides, FE (beta-sitosterol, campesterol e latosterol). Na aorta dos animais, determinaram-se as concentrações de colesterol total, colesterol livre e éster e FE, além do infiltrado de macrófagos e infiltrado de lípides. Nos macrófagos do peritôneo dos animais, os quais assemelham-se aos presentes na artéria, avaliou-se a expressão de RNA mensageiro dos genes envolvidos no efluxo e influxo de colesterol (ABCA1, ABCG1, LOX1 e CD36). Também determinou-se as concentrações de FE no intestino e baço dos animais. Resultados: Conforme esperado, o consumo de FE induziu elevação plasmática dos principais FE, campesterol e de beta-sitosterol, reduzindo a concentração de colesterol no plasma. Houve aumento nas concentrações hepáticas de triglicérides e FE, entretanto, não foram observadas diferenças entre os grupos nas expressões de RNA mensageiro de genes lipolíticos (CPT, PPAR alfa) e lipogênicos (SREBP1-c, MTP, LXR e PPAR gamma) no fígado. Não houve, também, alteração no SREBP2, gene relacionado à síntese de colesterol. O conteúdo de colesterol total na artéria foi menor nos animais do grupo FE, não diferindo entre as formas livre e éster. As concentrações de FE na artéria foram iguais entre os grupos. A área de lesão no grupo FE foi menor em relação ao grupo-controle. A suplementação com FE induziu redução na expressão de RNA mensageiro de ABCG1, não interferindo na expressão dos outros genes estudados na artéria. Conclusão: Os achados deste estudo demonstram que a elevação de FE no plasma não induziu o seu acúmulo na parede da artéria e preveniu o desenvolvimento da aterosclerose / Introduction: The plasma cholesterol-reducing effect of hytosterols (PS) is well recognized and they are considered important adjuncts in the treatment of moderate hypercholesterolemia. However, recent studies have shown conflicting results regarding the efficiency of PS in the prevention of atherosclerosis. In addition, some studies showed that the increase in plasma PS concentration is positively correlated to the risk of atherosclerosis. In order to elucidate its action on these parameters, the objective of this study was to evaluate the effects of PS supplementation in the development of atherosclerosis in LDL receptor knock-out mice (LDLr -KO). Methods: The animals were fed during 16 weeks with high fat diet (40 % of calories as fat), supplemented (PS group, 2%, n = 10) or not (Control, n = 10) with PS. Plasma and liver concentrations of cholesterol, triglycerides, PS (beta - sitosterol, campesterol and lathosterol) were evaluated. In the aorta of the animals, the concentrations of total cholesterol, free cholesterol, cholesterol ester and PS, besides macrophage and lipids infiltration were determined. The mRNA expression of genes involved in cholesterol efflux and influx (ABCA1, ABCG1, LOX1 and CD36) were evaluated, in peritoneum macrophage, which resemble those present in the artery. It was also determined the intestine and spleen PS concentrations from the animals of both groups. Results: As expected, PS supplementation induced increasing plasma concentration of the main PS, campesterol and beta -sitosterol and reducing cholesterol plasma concentration. It was observed an increase so intestine and spleen PS concentrations. There was an increase in hepatic triglyceride concentrations and PS, however, no differences were observed between the groups of hepatic mRNA expression of lipolytic (CPT, PPARalfa) and lipogenic genes (SREBP1c, MTP, CPT, LXR, and PPAR gamma). There was no difference on SREBP2, gene related to cholesterol synthesis. The content of total cholesterol in the artery was lower in PS group animals however did not differ between the free and ester forms. Artery PS concentrations did not differ between groups. The lesion area in the PS group was lower than in the control group. PS supplementation induced reduction in mRNA expression of ABCG1, not affecting the expression of other genes studied in artery. Conclusion: The findings of this study demonstrate that the elevation of plasma PS concentration did not induce its accumulation in the arterial wall and prevented the development of atherosclerosis

A molécula adaptadora myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) está envolvida na ativação de receptores Toll-like (TLRs), os quais são responsáveis pelo reconhecimento precoce pelas células do hospedeiro de patógenos invasores e pelo desencadeamento da resposta imunológica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar o desenvolvimento e a progressão de lesões periapicais induzidas experimentalmente em dentes de camundongos knockout (KO) para a molécula MyD88 (MyD88 KO), comparados a animais wild-type (WT). Lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de 30 camundongos WT e de 30 camundongos MyD88 KO. Decorridos 7, 21 e 42 dias, os animais foram submetidos à eutanásia em câmara de CO2 e as mandíbulas foram removidas e submetidas ao processamento histotécnico. A seguir, cortes representativos foram corados com hematoxilina e eosina (HE), para descrição das características do canal radicular e das regiões apical e periapical e para contagem do número de células inflamatórias (neutrófilos), em microscopia de luz, e para mensuração da área das lesões periapicais, em microscopia de fluorescência. Espécimes sequenciais foram analisados por meio de: histoenzimologia para a atividade da TRAP, para contagem de osteoclastos; coloração de Brown & Brenn, para localização de bactérias; e imunohistoquímica, para identificação de marcadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG). Os dados foram submetidos à análise estatística por meio dos testes não-paramétricos de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn, utilizando o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 17.O, com nível de significância de 5%. As demais análises foram expressas de maneira qualitativa. Com relação à extensão das lesões periapicais, o grupo MyD88 KO apresentou valores significantemente maiores do que o grupo WT nos períodos de 7 (p=0,001) e 21 dias (p=0,05), sendo que após 42 dias foi observada tendência de maiores valores, porém sem diferença significante (p=0,09). Foi observada maior quantidade de neutrófilos no grupo MyD88 KO, em comparação aos animais WT (p=0,01 em 7 dias; p=0,004 em 21 dias; e p<0,001 em 42 dias). Por outro lado, com relação à quantidade de osteoclastos, não foi observada diferença significante entre ambos os grupos, em todos os períodos experimentais (p=0,884 em 7 dias; p=0,506 em 21 dias; e p=0,211 em 42 dias). A análise microscópica descritiva do grupo MyD88 KO revelou um infiltrado inflamatório mais intenso, com presença abundante de células porlimorfonucleadas e mononucleadas e com grande destruição tecidual, após 7, 21 e 42 dias. A coloração de Brown e Brenn evidenciou uma maior disseminação bacteriana, inclusive nos tecidos periapicais, no grupo MyD88 KO, quando comparado aos animais WT. Com relação à imunohistoquímica, foram observadas marcações para RANK, RANKL e OPG de forma semelhante entre os dois grupos de animais. Com base nas metodologias e nos resultados obtidos no presente estudo pode-se concluir que na ausência da MyD88 os animais apresentaram lesões periapicais mais extensas, com um infiltrado inflamatório severo e com número significantemente maior de neutrófilos, quando comparados aos animais WT, sugerindo o importante papel desta molécula na resposta imune e inflamatória no combate à infecção de origem endodôntica. / The adaptor molecule myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) is involved in the activation of toll-like receptors (TLRs), which are responsible for the early recognition by the host cells of invading pathogens and for triggering the immune response. The aim of the present study was to characterize the formation and progression of experimentally induced periapical lesions in teeth of MyD88 knockout (MyD88 KO) mice compared with wildtype (WT) mice. Periapical lesions were induced in the mandibular first molars of 30 WT and 30 MyD88 KO mice. After 7, 21 and 42 days, the animals were euthanized in a CO2 chamber and the mandibles were removed and subjected to histotechnical processing. Representative histological sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) for description of the features of the root canal and the apical and periapical regions, and for counting of inflammatory cells (neutrophils) under conventional light microscopy and for determination of the size of the periapical lesions under fluorescence microscopy. Sequential specimens were evaluated by: TRAP histoenzymology, for osteoclast counting; Brown & Brenn staining, for localization of bacteria; and immunohistochemistry for identification of osteoclastogenesis markers (RANK, RANKL, OPG). Data were subjected to statistical analysis by the nonparametric Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests and the Dunn post-test, using the SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) software, version 17.0. The significance level was set at 5%. The other analyzes were displayed qualitatively. Regarding the periapical lesion size, the MyD88 KO group presented significantly higher values than the WT group in the periods of 7 (p=0.001) and 21 days (p=0.05). Tendency for higher values was observed after 42 days, though without significant difference (p=0.09). A larger number of neutrophils in the MyD88 KO group were observed compared with the WT animals (p=0.01 at 7 days, p=0.004 at 21 days and p<0.001 at 42 days). On the other hand, regarding the number of osteoclasts, no statistically significant difference was observed between the groups at any of the experimental periods (p=0.884 at 7 days, p=0.506 at 21 days and p=0.211 at 42 days). Descriptive microscopic analysis of the MyD88 KO group revealed a more intense inflammatory infiltrate, with abundant presence of polymorphonuclear and mononuclear cells and wide tissue destruction, after 7, 21 and 42 days. Brown & Brenn staining showed an increased bacterial dissemination, including the periapical tissues in the MyD88 KO group, when compared with the WT animals. As for immunohistochemistry, RANK, RANKL and OPG immunostainings were similar between the two groups of animals. Based on the employed methodology and the obtained results, it may be concluded that in the absence of MyD88, the animals showed larger periapical lesions, with a severe inflammatory infiltrate and a significantly larger number of neutrophils, when compared with WT animals, suggesting the important role of this molecule during the immune and inflammatory response against infections of endodontic origin.

A molécula adaptadora myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) está envolvida na ativação de receptores Toll-like (TLRs), os quais são responsáveis pelo reconhecimento precoce pelas células do hospedeiro de patógenos invasores e pelo desencadeamento da resposta imunológica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar o desenvolvimento e a progressão de lesões periapicais induzidas experimentalmente em dentes de camundongos knockout (KO) para a molécula MyD88 (MyD88 KO), comparados a animais wild-type (WT). Lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de 30 camundongos WT e de 30 camundongos MyD88 KO. Decorridos 7, 21 e 42 dias, os animais foram submetidos à eutanásia em câmara de CO2 e as mandíbulas foram removidas e submetidas ao processamento histotécnico. A seguir, cortes representativos foram corados com hematoxilina e eosina (HE), para descrição das características do canal radicular e das regiões apical e periapical e para contagem do número de células inflamatórias (neutrófilos), em microscopia de luz, e para mensuração da área das lesões periapicais, em microscopia de fluorescência. Espécimes sequenciais foram analisados por meio de: histoenzimologia para a atividade da TRAP, para contagem de osteoclastos; coloração de Brown & Brenn, para localização de bactérias; e imunohistoquímica, para identificação de marcadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG). Os dados foram submetidos à análise estatística por meio dos testes não-paramétricos de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn, utilizando o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 17.O, com nível de significância de 5%. As demais análises foram expressas de maneira qualitativa. Com relação à extensão das lesões periapicais, o grupo MyD88 KO apresentou valores significantemente maiores do que o grupo WT nos períodos de 7 (p=0,001) e 21 dias (p=0,05), sendo que após 42 dias foi observada tendência de maiores valores, porém sem diferença significante (p=0,09). Foi observada maior quantidade de neutrófilos no grupo MyD88 KO, em comparação aos animais WT (p=0,01 em 7 dias; p=0,004 em 21 dias; e p<0,001 em 42 dias). Por outro lado, com relação à quantidade de osteoclastos, não foi observada diferença significante entre ambos os grupos, em todos os períodos experimentais (p=0,884 em 7 dias; p=0,506 em 21 dias; e p=0,211 em 42 dias). A análise microscópica descritiva do grupo MyD88 KO revelou um infiltrado inflamatório mais intenso, com presença abundante de células porlimorfonucleadas e mononucleadas e com grande destruição tecidual, após 7, 21 e 42 dias. A coloração de Brown e Brenn evidenciou uma maior disseminação bacteriana, inclusive nos tecidos periapicais, no grupo MyD88 KO, quando comparado aos animais WT. Com relação à imunohistoquímica, foram observadas marcações para RANK, RANKL e OPG de forma semelhante entre os dois grupos de animais. Com base nas metodologias e nos resultados obtidos no presente estudo pode-se concluir que na ausência da MyD88 os animais apresentaram lesões periapicais mais extensas, com um infiltrado inflamatório severo e com número significantemente maior de neutrófilos, quando comparados aos animais WT, sugerindo o importante papel desta molécula na resposta imune e inflamatória no combate à infecção de origem endodôntica. / The adaptor molecule myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) is involved in the activation of toll-like receptors (TLRs), which are responsible for the early recognition by the host cells of invading pathogens and for triggering the immune response. The aim of the present study was to characterize the formation and progression of experimentally induced periapical lesions in teeth of MyD88 knockout (MyD88 KO) mice compared with wildtype (WT) mice. Periapical lesions were induced in the mandibular first molars of 30 WT and 30 MyD88 KO mice. After 7, 21 and 42 days, the animals were euthanized in a CO2 chamber and the mandibles were removed and subjected to histotechnical processing. Representative histological sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) for description of the features of the root canal and the apical and periapical regions, and for counting of inflammatory cells (neutrophils) under conventional light microscopy and for determination of the size of the periapical lesions under fluorescence microscopy. Sequential specimens were evaluated by: TRAP histoenzymology, for osteoclast counting; Brown & Brenn staining, for localization of bacteria; and immunohistochemistry for identification of osteoclastogenesis markers (RANK, RANKL, OPG). Data were subjected to statistical analysis by the nonparametric Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests and the Dunn post-test, using the SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) software, version 17.0. The significance level was set at 5%. The other analyzes were displayed qualitatively. Regarding the periapical lesion size, the MyD88 KO group presented significantly higher values than the WT group in the periods of 7 (p=0.001) and 21 days (p=0.05). Tendency for higher values was observed after 42 days, though without significant difference (p=0.09). A larger number of neutrophils in the MyD88 KO group were observed compared with the WT animals (p=0.01 at 7 days, p=0.004 at 21 days and p<0.001 at 42 days). On the other hand, regarding the number of osteoclasts, no statistically significant difference was observed between the groups at any of the experimental periods (p=0.884 at 7 days, p=0.506 at 21 days and p=0.211 at 42 days). Descriptive microscopic analysis of the MyD88 KO group revealed a more intense inflammatory infiltrate, with abundant presence of polymorphonuclear and mononuclear cells and wide tissue destruction, after 7, 21 and 42 days. Brown & Brenn staining showed an increased bacterial dissemination, including the periapical tissues in the MyD88 KO group, when compared with the WT animals. As for immunohistochemistry, RANK, RANKL and OPG immunostainings were similar between the two groups of animals. Based on the employed methodology and the obtained results, it may be concluded that in the absence of MyD88, the animals showed larger periapical lesions, with a severe inflammatory infiltrate and a significantly larger number of neutrophils, when compared with WT animals, suggesting the important role of this molecule during the immune and inflammatory response against infections of endodontic origin.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada por Paracoccidioides spp., (P. brasiliensis e P. lutzii), geograficamente, limita-se a América Latina com as áreas endêmicas estendendo-se desde o México até a Argentina, constituindo uma das micoses sistêmicas de maior incidência na região, afetando principalmente trabalhadores rurais. O maior número de pacientes com PCM tem sido reportado principalmente no Brasil, Colômbia e Venezuela. A incidência real desta micose encontra-se subestimada no Brasil e pouco se conhece em relação a nova espécie descrita - P. lutzii. A maioria dos estudos em P. lutzii foram focados em genética, especiação e na geração de novos antígenos para melhorar a especificidade e sensibilidade dos testes sorológicos. Atualmente, as preparações antigênicas tradicionais, preparadas a partir de isolados de P. brasiliensis, são ineficientes. Raros são os trabalhos focados na biologia de P. lutzii e nos fatores de virulência que podem ser comparados com P. brasiliensis nos modelos experimentais. A nossa proposta de estudo foi avaliar alguns aspectos in vitro e in vivo relacionados com a patogenicidade e destacamos: a fagocitose e a morte intracelular de P. lutzii por macrófagos, peritoneais, de camundongos Knockouts (KO) e selvagens para PRRs (TLR2, TLR4 e Dectina) e ativadores intracelulares (MyD88 e NALP3). Paralelamente a este estudo, animais foram infectados com leveduras de P. lutzii e comparados com os modelos de infecção já estabelecidos com leveduras (Pb18) e conídios (ATCCPb60855) de P. brasiliensis. Nossos dados indicam que similar ao que ocorre com P. brasiliensis a fagocitose de P. lutzii depende de TLR2, TLR4 e Dectina- 1, resultados semelhantes também foram observadas na expressão de moléculas envolvidas na co-estimulação e a apresentação de antígenos (MHC II, CD80 e CD86). Contudo, a morte intracelular de leveduras de P. lutzii é claramente dependente de TLR4, e a produção de citocinas IL-6, MIP-2, IFN- e IL-12p40 são importantes para o controle das leveduras pelos macrófagos. No modelo experimental de P. lutzii, camundongos machos C57BL/6 (6-7 semanas) foram infectados intratraquealmente como 1x106 leveduras viáveis do isolado de P. lutzii Pb01. Encontramos duas fases da doença, a primeira de 0 hora até 2 a 4 semanas pós-infecção, e a segunda de 4 até 12 semanas. As leveduras parecem ser contidas na primeira semana de infecção e posteriormente não encontramos leveduras nos macerados de pulmão, diferente do modelo de BALB/c infetado com conídios de ATCC-Pb60855 no qual as UFC são recuperadas até a semana 16 pós-infeção. Como relação aos níveis de citocinas, encontramos que na lavagem broncoalveolar e macerado de pulmão um perfil misto Th1/Th2 porém, marcado por citocinas próinflamatórias no primeiro período e citocinas regulatórias tipo Th2 no segundo período (IL-12p70, IL-23, IL-10); similar ao descrito nos modelos de P. brasiliensis infectados tanto com conídios como com leveduras. No entanto, no primeiro período da doença, em camundongos C57BL/6, parece ter uma carga inflamatória maior que reflete nas citocinas que mantém seus níveis até o período crônico: TNF-alfa, MIP-2 e GM-CSF está última, regulada positivamente tanto em experimentos in vitro como in vivo. Também observamos que a partir das 48horas pós-infecção encontramos níveis aumentados de IL-12p70 até o período crônico onde junto com a IL-23 parecem ser as responsáveis pela diminuição da infecção no período tárdio. Esta é a primeira vez que se descreve um modelo experimental com P. lutzii (isolado Pb01) indicando o perfil imunopatológico com pequenas diferenças comparados ao P. brasiliensis porém, de importância na patogenicidade da doença auxiliando a compreender as diferentes formas da doença no modelo experimental / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides spp. (P. brasiliensis and P. lutzii), geographically, is limited to Latin America with endemic areas from Mexico to Argentina, as one of the systemic mycoses with the highest incidence in the region, mainly affecting rural workers. The largest number of patients with PCM has been mainly reported in Brazil, Colombia and Venezuela. The true incidence of this mycosis is underestimated in Brazil and little is known about the new species described - P. lutzii. Most studies in P. lutzii were focused on genetics, speciation and the generation of new antigens to improve the specificity and sensitivity of serological tests. Currently, traditional antigenic preparations, prepared with isolates of P. brasiliensis, are inefficient. There are few studies focused on P. lutzii biology and virulence factors that can be compared with P. brasiliensis in experimental models. Our study aimed to evaluate some in vitro and in vivo aspects related to pathogenicity: phagocytosis and intracellular killing of P. lutzii by peritoneal macrophages from knockouts (KO) for PRRs (TLR2, TLR4 and Dectin) and intracellular activators (MyD88 and NALP3). In addition, animals were infected with P. lutzii yeast and compared with the well-established models of infection with yeast cells (Pb18) and conidia (ATCC Pb60855) from P. brasiliensis. Our data indicate that similarly to what happens with the phagocytosis of P. brasiliensis, P. lutzii phagocytosis is dependent on TLR2, TLR4 and Dectin-1. Other molecules, involved in co-stimulation and presentation of antigens such as MHC II, CD80 and CD86 were also shown to participate in the P. lutzii-host interaction. However, intracellular killing of P. lutzii yeast cells was clearly dependent on TLR4, and the production of cytokines as IL-6, MIP-2, IFN- and IL-12p40 were important for the control of the yeast by macrophages. In the experimental model of P. lutzii, male C57BL/6 mice (6-7 weeks) were infected intratracheally with 1x106 viable yeasts of the isolate Pb01like. We found two phases of the disease, the first from the inoculation to 2 or 4 weeks after infection and the second from 4 to 12 weeks. Yeast appear to be contained within the first week of infection and subsequently are also absent from macerated lung, differently from the model of BALB/c mice infected with ATCC Pb60855 conidia in which CFUs were detected up to week 16 post-infection. We found a mixed Th1/Th2 pattern (IL-12p70, IL-23, IL-10) in bronchoalveolar lavage and lung, with the predominance of proinflammatory cytokines in the first phase and predominance of regulatory Th2 cytokines in the second phase, reproducing findings of P. brasiliensis infection models produced with both conidia and yeast. However, in the first period of the disease in C57BL/6 mice there was a higher inflammatory burden, reflected by the high cytokine levels (TNF-alpha, MIP-2 and GM-CSF), the latter in particular because it was positively regulated both in vitro and vivo), that persisted through the chronic period. We also observed that starting from 48 hours postinfection to the chronic period there were increased levels of IL-12p70, which together with IL-23 appeared to be responsible for the reduction of infection in the late period. This is the first time that an experimental model with P. lutzii (Pb01) is described, showing an immunological profile with only slight differences compared to the P. brasiliensis model. The present study details important aspects of the pathogenesis of the disease due to different species of Paracoccidioides and helps to understand the different forms of presentation in experimental models

O conhecimento de que o exercício é benéfico na doença aterosclerótica é baseado principalmente em estudos epidemiológicos. O objetivo deste trabalho foi investigar se o treinamento físico preventivo ou terapêutico altera a evolução da placa aterosclerótica. Camundongos LDLr-/- com 16 semanas de vida foram separados em dois programas: preventivo e terapêutico. Animais do programa preventivo receberam dieta normal ou aterogênica por 14 semanas. O treinamento físico foi iniciado concomitantemente ao início da dieta. Animais do programa terapêutico receberam dieta normal ou aterogênica por 28 semanas. O treinamento físico foi iniciado após 14 semanas do início da dieta, com placas bem estabelecidas. O treinamento físico aeróbico moderado foi realizado em esteira rolante, por 60 min, 5 dias/sem, durante 14 semanas. Massa corporal, pressão arterial caudal e freqüência cardíaca foram registradas. Lipoproteínas plasmáticas foram separadas por FPLC e colesterol total foi dosado por métodos enzimáticos. Foram quantificados tamanho, conteúdo de gordura e de colágeno da placa por coloração de oil-red O e picro-sirius. Citocinas TNF-, IL-6 foram medidas por Elisa. MMP-9 plasmática foi medida por zimografia. Marcadores inflamatórios teciduais, MMP-9, CD40/CD40L e nitrotirosina, foram medidos na placa por imunohistoquímica. O treinamento físico não modificou o tamanho da placa, mas tornou a placa mais estável por aumentar o conteúdo de colágeno. O treinamento físico diminuiu o conteúdo de gordura da placa, os fatores de risco e o CD40 somente no programa preventivo. Nenhuma alteração foi notada nos marcadores inflamatórios circulantes e na expressão de MMP-9 e formação de nitrotirosina na placa aterosclerótica. / The knowledge that exercise exerts beneficial effects on atherosclerotic disease is mainly based on epidemiological studies. Our aim was to investigate the effect of preventive and therapeutic exercise programs on atherosclerotic plaque formation and development. Sixteen-week-old LDLr-/- mice were randomly divided into preventive and therapeutic programs. Preventive programs mice received normal or atherogenic diet for 14 weeks. Exercise training started at the same time of dieting. Therapeutic programs mice received normal or atherogenic diet for 28 weeks. Exercise training started after 14 weeks of dieting when atherosclerosis plaques were already established. Moderate intensity aerobic exercise training was performed on a motor treadmill for 60 min, 5 days/wk, during 14 weeks. Body mass, caudal blood pressure and heart rate were registered. Plasma lipoproteins were separated by FPLC and total cholesterol was determined by enzymatic methods. Cross sections of aortic root were stained with oil-red O for plaque size and fat content. Aorta longitudinal sections were stained with picro-sirius for collagen content. TNF- and IL-6 cytokines were measured by Elisa. Plasmatic MMP-9 was determined by zimography. Inflammatory tissue markers, MMP-9, CD40/CD40L and nitrotirosine, were measured by immunohistochemistry. We concluded that exercise training did not modify plaque size, but turned it into a more stable one by increasing its collagen content. Exercise training reduced plaque fat content, risk factors and plaque CD40 expression only in the preventive program. No difference in systemic inflammatory markers, and in plaque MMP-9 expression and nitrotirosine formation was noted.