La enfermedad de Chagas constituye uno de los principales problemas en salud pública en América Latina. Las drogas disponibles en la actualidad para el tratamiento, Nifurtimox y Benznidazol no presentan una respuesta clínica satisfactoria. El mecanismo de acción de estas drogas es mediante la generación de radicales libres y/o metabolitos electrofílicos. Al respecto, el Glutatión (GSH) y su conjugado con espermidina, Tripanotión (T(SH)2), constituyen los principales mecanismos de defensa antioxidante del parásito. L-Butionina-(S,R)-Sulfoximina (BSO) inhibe la síntesis de GSH y (T(SH)2), y potencia el efecto tripanocida del Nifurtimox y Benznidazol en modelos in vitro de la enfermedad de Chagas. A dosis de 500 µM de BSO se observa una disminución de más de un 80% de tioles en todas las formas del parásito. En epimastigotes, BSO 500 µM disminuyó los ICKc50 (dosis inhibitoria 50 para la constante de crecimiento) de Nifurtimox o Benznidazol en un 60%, resultado similar se observó al evaluar la viabilidad de los epimastigotes midiendo la reducción de MTT ([3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromuro). Al tratar tripomastigotes de Trypanosoma cruzi con BSO 500 µM y Nifurtimox se observó una disminución del IC50 medido por la reducción de MTT de 7,68 µM a 3,01 µM y al asociar Benznidazol con BSO 500 µM el IC50 disminuyó de 33,07 a 3,84 µM. En células Vero infectadas con amastigotes, BSO 25 µM fue capaz de potenciar el efecto de Nifurtimox y Benznidazol. Nifurtimox a concentración de 0,5 µM, el índice endocítico (porcentaje de células infectadas multiplicado por el promedio de amastigotes intracelulares) disminuyó de 2.500 a 980 cuando se agregó BSO 25 µM. Un resultado similar se observó cuando se asoció Benznidazol con BSO 25 µM. En ratones infectados con Trypanosoma cruzi, el tratamiento sólo con BSO, no aumentó la sobrevida de los animales; no obstante a ello, se observa una disminución significativa de la parasitemia a la dosis de BSO 1000 µmoles/Kg/día. Al asociar esta dosis de BSO con Nifurtimox o Benznidazol, no se observa un aumento en la sobrevida o una disminución significativa en las parasitemias. Los resultados in vitro, indican que la potenciación de Nifurtimox o Benznidazol por BSO podría disminuir las dosis clínicas de ambas drogas y disminuir los efectos secundarios o la duración de la terapia, no obstante los resultados in vivo no se orientan en el mismo sentido.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Bioquímica / Los astrocitos colaboran con las neuronas en el normal desarrollo de sus actividades metabólicas, y más aún son capaces de participar activamente en su protección frente a estímulos potencialmente dañinos. Se ha demostrado, que la enzima glutatión-S-transferasa M2-2 (GSTM2-2) de astrocitos es capaz de conjugar glutatión con aminocromo, un producto de oxidación de la dopamina, y por ello es que se propone como hipótesis que la enzima Glutation-S-transferasa M2-2 producida por astrocitos les confiere protección, y protege neuronas tipo dopaminérgicas de los efectos tóxicos de aminocromo. Para validar esta hipótesis es que en primera instancia se determinó la capacidad de los astrocitos humanos U373MG (glioblastoma) de captar aminocromo mediante utilización de aminocromo tritiado, observándose una incorporación máxima a los 40 minutos, la que es parcialmente inhibida por tratamientos con exceso de dopamina, imipramina y nomifensina. Mediante western blot se determinó que la presencia del aminocromo en los cultivos celulares provoca un aumento en la cantidad proteína, además de detectarse aumento en la actividad enzimática, ambos cambios de manera dependiente de la concentración, en donde 100 μM de aminocromo aumenta 2,1 veces la cantidad de la enzima en 3 horas. Se detectó mediante western blot la presencia de la proteína GSTM2-2 en los medios condicionados de células U373MG, aumentando 2,7 veces al exponer las células a aminocromo 50 μM por 3 horas en relación al control sin aminocromo. La línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y es susceptible a toxicidad inducida por aminocromo, determinada por citometría de flujo, por lo que se probaron los medios condicionados de las células U373MG que contenían la enzima GSTM2-2 sobre cultivos de SH-SY5Y, evidenciándose la capacidad de proteger a células SH-SY5Y de la muerte inducida por exposición a 10 μM de aminocromo, y dicha protección frente a la muerte celular es dependiente de la internalización de la proteína GSTM2-2 por parte de las células SH-SY5Y, tal como se demostró (i) por captación de 14C-GSTM2-2 liberado por células U373MG, proceso inhibido por un antisuero contra GSTM2-2, (ii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de U373MG tratados con antisuero contra GSTM2-2, (iii) muerte celular de SH-SY5Y tratadas con aminocromo, en presencia de medios condicionados de células U373MGsiGST6, que expresan un siRNA contra GSTM2-2. En conclusión, nuestros resultados demuestran que las células U373MG protegen las células SH-SY5Y contra la toxicidad inducida por aminocromo, por un mecanismo que involucraría la liberación de GSTM2-2 al medio condicionado y la subsecuente internalización de esta enzima por parte de las células SH-SY5Y. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo de protección de neuronas dopaminérgicas mediado por astrocitos / Astrocytes collaborate with neurons in the normal development of their metabolic activities, and to a greater extent, they are able to actively participate in their protection from potentially harmful stimuli. It has been shown that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 (GSTM2-2) from astrocytes is able to conjugate glutathione to aminochrome, an oxidation product of dopamine. Therefore the hypothesis proposed is that the enzyme glutathione S-transferase M2-2 produced by astrocytes protect them, and also protects dopaminergic neurons from the toxic effects of aminochrome. To validate this hypothesis, we assessed the ability of human astrocytes U373MG (glioblastoma) to capture aminochrome by using tritiated aminochrome, reaching an incorporation peak at 40 minutes, which is partially inhibited by treatment with excess dopamine, imipramine and nomifensine. Using western blot, we determined that the presence of aminochrome in cell cultures causes an increase in the protein amount, besides the increasing enzymatic activity, both changes depending on the aminochrome concentration, with 100 μM aminochrome increasing 2.1 times the amount of the enzyme in 3 hours. The presence of protein GSTM2-2 was detected by western blot in conditioned media from U373MG cells, increasing 2.7 times after the exposure to 50 uM aminochrome for 3 hours compared to the control without aminochrome. The neuroblastoma cell line SH-SY5Y is susceptible to aminochrome-induced toxicity, determined by flow cytometry, then U373MG cells conditioned media containing the enzyme GSTM2-2 cultures were tested on SH-SY5Y, demonstrating the ability to protect SH-SY5Y against aminochrome-induced cells death, and that protection against cell death is dependent on internalization of the GSTM2-2 protein by SH-SY5Y cells. This internalization was demonstrated by (i) uptake of 14C-GSTM2-2 released by U373MG cells, process inhibited by an antiserum against GSTM2-2, (ii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media from U373MG treated with antiserum against GSTM2-2, (iii) cell death of SH-SY5Y treated with aminochrome, in the presence of conditioned media of U373MGsiGST6 cells expressing siRNA against GSTM2-2. In conclusion, our results demonstrate that U373MG cells protect SH-SY5Y cells against aminochrome-induced toxicity, by a mechanism which would involve the release of GSTM2-2 to the conditioned medium and subsequent internalization of this enzyme by SH-SY5Y cells. These results suggest a novel mechanism of protection of dopaminergic neurons mediated by astrocytes / Conicyt; Fondecyt

El objetivo de éste estudio fue optimizar un método por Electroforesis Capilar de Zona para la determinación rápida de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en la matriz de tejido vegetal de hojas y raíces de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L.). Se compararon dos tratamientos de muestra diferentes para el aislamiento de los analitos de la matriz vegetal, se determinó los niveles de GSH y GSSG en plantas sometidas a estrés por cobre en dos periodos de tiempo (48 horas y 28 días) y se evaluó el efecto de cobre sobre la biomasa y los niveles de macronutrientes presentes en la planta. De los resultados obtenidos se concluye que: La optimización de los parámetros instrumentales, tales como largo de capilar, voltaje aplicado y polaridad de la fuente de poder, así como la optimización de los parámetros relacionados con el electrolito de corrida, tales como composición, concentración, pH y fuerza iónica permiten la separación de ambos analitos en un tiempo inferior a los tres minutos. Las condiciones óptimas fueron: polaridad de la fuente positiva, capilar de 40 cm de largo, voltaje de 20 kV, electrolito borato 300 mM, pH 7,6 y 30 segundos de inyección hidrostática de la muestra. El método optimizado para la matriz vegetal presenta una muy buena correlación entre área bajo la curva y concentración de GSH y GSSG, con coeficientes de correlación de 0,9995 y 0,9994, respectivamente. Los límites de detección fueron 2,75 y 1,68 µmol/L para GSH y GSSG y la recuperación del analito en el proceso fue de 105 y 87 %, respectivamente. En la etapa de tratamiento de la muestra, el uso de un método químico (ácido metafosfórico) es más efectivo que el uso de un método físico (copas de ultrafiltración) para el aislamiento de los analitos desde la matriz proteica. Esta efectividad se reflejo en un menor consumo de tiempo, mayor volumen de muestra obtenido y obtención de una matriz mas limpia. El tratamiento prolongado de las plantas con cobre se manifiesta en síntomas de toxicidad con una drástica disminución de la biomasa de la parte aérea y raíz, en asociación con un descenso de la concentración de potasio en ambos órganos. Este efecto no se observa en plantas tratadas por un periodo corto de tiempo con el metal. Los niveles de cobre alcanzados en la parte aérea y raíz correlacionan positivamente con la concentración de cobre aplicada en ambos tratamientos, siendo las concentraciones más altas observadas en la raíz El cobre aplicado a la planta modifica los niveles de glutatión reducido y oxidado tanto en el tratamiento crónico como en el agudo. El efecto más notorio se manifestó sobre el glutatión reducido contenido en la raíz. Este péptido decrece su concentración a medida que incrementa la concentración de cobre, siendo este efecto independiente de los cambios morfológicos que presenta la raíz y del lapso de tiempo en que el cobre fue aplicado. Los cambios producidos en los niveles de glutatión reducido y oxidado constituyen un buen indicador de la respuesta temprana al estrés por metal en plantas desarrolladas, expuestas a cobre por un periodo de tiempo corto (horas)

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Farmacología / El trasplante de células troncales mesenquimáticas humanas (hMSC) derivadas de médula ósea ha mostrado ser terapéutico en patologías como osteogénesis imperfecta, reacción del injerto contra huésped e infarto agudo al miocardio. Además, ha permitido recuperar las funciones motoras y sensoriales en animales con infarto cerebral, la producción de insulina en animales diabéticos y evitar la muerte neuronal en animales con enfermedad de Parkinson. En todas estas patologías el daño tisular se vincula a estrés oxidativo (EO). A la fecha, los mecanismos propuestos para explicar los efectos terapéuticos de las MSC son: i) diferenciación a células del parénquima, ii) producción de factores tróficos que promueven proliferación y diferenciación de progenitores locales, iii) neovascularización, iv) inmunomodulación. Nosotros proponemos que las hMSC además actuarían como “atrapadores” de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o de nitrógeno (RNS), protegiendo así a las células del parénquima del daño oxidativo. Para evaluar esta hipótesis hemos caracterizado a las hMSC con respecto a su capacidad de manejar el EO. Primero, se determinó si las hMSC resisten a la muerte inducida por la exposición a ROS (H2O2), a RNS (SNAP) o a ambas (SIN-1) y se determinaron los niveles intracelulares de ROS/RNS cuando las células son expuestas a SIN-1. Luego, se determinaron las herramientas que las hMSC poseen para depurar las especies reactivas. Para ello, se cuantificó la expresión (RT-PCR tiempo real) y actividad (espectrofotometría) de enzimas asociadas a la eliminación de ROS y/o RNS: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPX1). Además, se evaluaron los niveles basales de glutatión total (GSx). Finalmente, se determinó cual es la contribución del GSx dentro de los mecanismos asociados al manejo del EO que poseen las hMSC. Para ello se evaluó la resistencia a la muerte inducida por la exposición a ROS y/o RNS de hMSC a las cuales se les depletó de GSx. Los resultados de esta tesis muestran que las hMSC son significativamente más resistentes a la muerte inducida por ROS y/o RNS que las células INS-1 (modelo de células susceptibles al EO) y tan resistentes como los fibroblastos de piel (modelo de células resistentes al EO). Las hMSC constitutivamente expresan todas las enzimas estudiadas y tienen altos niveles de GSx. Esto se correlaciona con una baja acumulación intracelular de ROS/RNS y una baja susceptibilidad a la muerte inducida por EO. Dentro de las herramientas para eliminar ROS y/o RNS encontrados en las hMSC, el GSx es central de vital importancia, ya que cuando la producción de éste es inhibida, las hMSC pierden su capacidad para resistir a la muerte inducida por EO. En conjunto estos resultados permiten concluir que, al menos in vitro, las hMSC manejan eficientemente el EO. De mantenerse esta propiedad in vivo, las hMSC contribuirían a la regeneración tisular disminuyendo el daño producido por el EO / Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hMSC) transplantation is therapeutic for osteogenesis imperfecta, graft versus host disease, and acute myocardial infarction. Pre-clinical studies have shown that exogenous hMSC induces recovery of motor and sensory functions after stroke, preventing neuronal death in models of Parkinson's and promoting hyperglycemia reversion in diabetic rodents. With these pathologies tissue damage is associated to oxidative stress (OS). The mechanisms behind therapeutic effects of MSC are: i) differentiation into parenchymal cells, ii) production of trophic factors that promote proliferation and differentiation of local stem cells, iii) neovascularization, and iv) immuno modulation. Here we propose that hMSC also might act as reactive oxygen species (ROS) and/or reactive nitrogen species (RNS) scavenges. Hence, parenchymal cells could be protected from oxidative damage and death. To test this hypothesis we characterized the potential of hMSC to manage OS. First, it was determined hMSC susceptibility to ROS (H2O2), RNS (SNAP) or both (SIN-1) induced death. Also, intracellular levels of ROS/RNS were determined in cells exposed to SIN-1. Then we identified hMSC tools to eliminate the reactive species. To do this, gene expression coding enzymes associated to ROS and/or RNS elimination (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX1)) were quantified by real time RT-PCR and enzymatic activity was measured by spectrophotometry. In addition, baseline levels of total glutathione (GSx) were evaluated. Finally we determined the importance of the GSx for hMSC tools associated with the management of the OS. To do this, we evaluated hMSC without GSx resistance to ROS and/or RNS induced death. Our results of this thesis show that hMSC are significantly more resistant to death induced by ROS and/or RNS than INS-1 cell model (susceptible to OS) and stronger as skin fibroblasts (cell model resistant to OS). hMSC constitutively express all the enzymes studied and have high levels of GSx. This correlates with a low accumulation of intracellular ROS/RNS and low susceptibility to death induced by OS. Among the tools to eliminate ROS and/or RNS found in hMSC, GSx is critical, because when this production is inhibited hMSC lose their resistance to the death induced by OS. Taken together these results allow to conclude that, at least in vitro, hMSC efficiently managed the OS. If this property exists in vivo, hMSC could contributed to tissue regeneration and decrease of the damage caused by OS

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniera Agrónoma / El selenio es un mineral traza esencial en la nutrición animal, y posee funciones importantes relacionadas con el sistema antioxidante del organismo. Actualmente los mercados se encuentran dirigidos a una producción más limpia y que implique menores costos para su obtención. Es por esto que surge la idea de suplementar las dietas de peces con selenio orgánico, ya que aumenta su absorción y retención, conllevando con ello un aumento en la biodisponibilidad del mineral. Para evaluar esto, se realizó un meta-análisis, el cual permitió contrastar los resultados obtenidos por siete autores en relación a la suplementación de selenio orgánico en la alimentación de peces y su efecto en la retención de este mismo a nivel muscular y la actividad de la enzima glutatión peroxidasa a nivel plasmático y hepático. Los resultados obtenidos de los estudios fueron llevados a una métrica común mediante el cálculo del índice del tamaño del efecto. A partir de él, se obtuvo la estimación del efecto global (d·), con valores de 2,279, 1,085 y 1,884 para las variables, retención de selenio a nivel muscular, actividad de la enzima glutatión peroxidasa a nivel plasmático y actividad de la enzima glutatión peroxidasa a nivel hepático respectivamente, siendo este efecto alto en cada una de las variables. La homogeneidad calculada entre los estudios presentó valores de p-value iguales a 9,96·10-9, 8,9·10-1 y 7,88·10-3 para cada una de las variables respectivamente, presentando para cada variable heterogeneidad entre los resultados analizados. En tanto, la comparación realizada entre las fuentes de selenio (selenito de sodio y selenometionina), indicó que con un p-value 9,955·10-9 y 7,88·10-3 para retención a nivel muscular y actividad a nivel hepático respectivamente, existe diferencia significativa entre las fuentes, por lo que la selenometionina aumentaría la retención a nivel muscular y la actividad de la enzima a nivel hepático, mientras que con un p-value de 8,6·10-1 no se presenta diferencia entre las fuentes para actividad enzimática a nivel plasmático. Los estudios con mayor influencia en el cálculo del efecto global para cada una de las variables fueron los de Lorentzen et al. (1994) y Wang et al. (2004) para la variable retención a nivel muscular, Lorentzen et al. (1994) y Liu et al. (2010) para actividad enzimática a nivel plasmático y los estudios de Zhou et al. (2009) y Raider et al. (2010) para actividad enzimática a nivel hepático. Estos estudios son además, los que presentaron el mayor cambio en magnitud en la estimación del efecto global al removerlos del meta-análisis y graficar el efecto provocado por su ausencia en el análisis de sensibilidad. / Selenium is a trace mineral which is essential in animal nutrition and has important functions related to the antioxidant system of the organism. At present fish farming markets are oriented towards a cleaner production involving lower costs. Based on this, supplementing fish diets with organic selenium arose as a feasible idea since this mineral increases its absorption and retention, which leads to an increase in the bioavailability of the mineral. To evaluate this possibility, a meta-analysis was carried out to contrast the results obtained by seven authors in relation to supplementing fish feed with organic selenium and its effect on the retention of this mineral at the muscle level and on the activity of the glutathione peroxidase enzyme at plasma and hepatic levels. The results obtained from the above studies were transformed to a common metric by means of the effect size estimation. Based on it, an estimate of the global effect (d·) was obtained with values of 2.279, 1.085, and 1.884 for the variables selenium retention at muscle level, activity of the glutathione peroxidase enzyme at plasma level and activity of the glutathione peroxidase enzyme at hepatic level, respectively, this effect being high in each of the variables. Homogeneity calculated among the studies showed p-values of 9.96·10-9, 8.9·10-1 and 7.88·10-3 for each of the variables, respectively, thus presenting heterogeneity among the results analyzed for each variable. Meanwhile, the comparison among the sources of selenium, sodium selenite and selenomethionine indicated that with p-values of 9.955·10-9 and 7.88·10-3 for retention at muscle level and activity at hepatic level, respectively, there is a significant difference among the sources. Consequently, selenomethionine would increase retention at muscle level and the enzymatic activity at hepatic level, while with a p-value of 8.6·10-1 no difference exists among the sources for the enzymatic activity at plasma level. The studies with greater influence on the estimation of the global effect for each of the variables were those by Lorentzen et al. (1994) and Wang et al. (2004) for the variable retention at muscle level, those by Lorentzen et al. (1994) and Liu et al. (2010) for the enzymatic activity at plasma level, and those by Zhou et al. (2009) and Raider et al. (2010) for the enzymatic activity at hepatic level.

La utilización de plaguicidas para el cultivo del arroz en campos cercanos a humedales de gran valor ecológico como los Parques Naturales de la Albufera de Valencia y el Delta del Ebro (Tarragona) suponen un riesgo no sólo para los ecosistemas de estos Parques sino también para la pesca y acuicultura que se desarrolla en la zona. La anguila europea (Anguilla anguilla) reside en ambos hábitats y está expuesta a cantidades considerables de herbicidas tiocarbamatos como el molinato y tiobencarb. Estos plaguicidas disminuyen y oxidan los niveles del antioxidante intracelular más importante, el glutatión (GSH). Así, se ha descubierto que el principal mecanismo de toxicidad de los herbicidas tiocarbamatos es la generación de radicales libres, produciendo un estado de estrés oxidativo, que sería responsable de la anemia hemorrágica observada en las anguilas. Además, la tolerancia de las anguilas a los plaguicidas estaría mediada principalmente por la capacidad de mantener e incrementar el estado redox del glutatión. Una excesiva oxidación de éste produciría estrés oxidativo que conduciría, según la intensidad, a una muerte celular programada (apoptosis) o no (necrosis), resultando en una disfunción de los tejidos y finalmente la muerte del organismo. Un patrón similar también se encontró en una población natural de la semilla del pectínido Flexopecten flexuosus, al igual que el mejillón (Mytilus galloprovincialis) cultivado en el Delta del Ebro, que está expuesto a una variación estacional de plaguicidas, siendo el insecticida organofosforado fenitrotión el más abundante. Por otra parte, el antioxidante y precursor del glutatión, N-acetilcisteína (NAC) aumentó la supervivencia de las anguilas expuestas al plaguicida organofosforado diclorvós (que ha sido utilizado extensivamente como antiparasitario de peces) al mejorar el metabolismo del glutatión y disminuir la pérdida y oxidación de éste, además de la inhibición enzimática causada por dicho plaguicida. Mientras que la disminución de glutatión se considera un marcador bioquímico de exposición a la contaminación, el estado redox del glutatión se puede utilizar como biomarcador de efecto y susceptibilidad individual a ciertos plaguicidas u otros contaminantes que inducen estrés oxidativo en vertebrados e invertebrados acuáticos. Asimismo, el tratamiento de anguilas intoxicadas con diclorvós mediante baños de NAC aminoró la disminución y oxidación del glutatión muscular y las actividades acetilcolinesterasa y glutatión reductasa del cerebro, que son biomarcadores de neurotoxicidad y estrés oxidativo, respectivamente. Consecuentemente, la NAC mejora la recuperación de las anguilas envenenadas con plaguicidas, representando un antídoto barato y de fácil administración. / Pesticides used in rice crops near wetlands of high ecological value such as the Natural Parks of the Albufera of Valencia and the Ebro Delta (Tarragona, Spain) represent a risk not only for their ecosystems, but also for the fishing and aquaculture of the area. Thiocarbamate herbicides decreased and oxidised the levels of the most important intracellular antioxidant, glutathione, in the European eel (Anguilla anguilla). Their mechanism of toxicity was mainly through the generation of free radicals, producing an oxidative stress state that would be the responsible of the hemorrhagic anaemia observed in eels. In addition, pesticide tolerance depended principally on the individual capacity of maintaining and enhancing the glutathione redox status. An excessive oxidation produces oxidative stress, which could lead to a programmed cell death (apoptosis) or not (necrosis), depending on the intensity, resulting in tissular impairment and, eventually, the death of the organism. A similar pattern was also found in a natural population of the pectinid spat Flexopecten flexuosus and the mussel Mytilus galloprovincialis exposed to the organophosphorus insecticide fenitrothion, which is the most abundant pesticide detected in the Ebro Delta. The antioxidant and glutathione pro-drug N-acetylcysteine (NAC) improved the survival of eels exposed to the organophosphate pesticide dichlorvos (which has been extensively used against fish parasites) through enhancing the glutathione metabolism and diminishing the loss and oxidation of it, in addition to reducing the enzymatic inhibition caused by the pesticide. Although glutathione depletion is considered as a biochemical marker of exposure to pollution, the glutathione redox status can be used as a biomarker of effect and individual susceptibility to certain pesticides or other pollutants that induce oxidative stress in aquatic vertebrates and invertebrates. Moreover, treatment of dichlorvos-intoxicated eels with baths of NAC ameliorated the depletion and oxidation of muscular glutathione and the brain acetylcholinesterase and glutathione reductase activities, which are biomarkers of neurotoxicity and oxidative stress, respectively. Consequently, NAC enhances the recovery of pesticide-poisoned fish, representing an inexpensive antidote of easy administration.

Memoria para optar al título de Químico / El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la materia orgánica soluble y la materia orgánica coloidal de dos biosólidos obtenidos por distintos procesos, sobre la biodisponibilidad de cobre, plomo, cadmio, níquel y niveles de glutatión oxidado (GSSG) y reducido (GSH), ácido ascórbico (AA) y ácido dehidroascórbico (ADHA) en plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L.). El estudio involucró el cultivo hidropónico de plantas bajo condiciones controladas y el análisis de elementos mediante espectroscopía de absorción atómica, emisión atómica y espectroscopía molecular. El análisis de las formas de glutatión, ácido ascórbico y ácido dehidroascórbico se llevó a cabo por electroforesis capilar de zona (ECZ), para lo cual se optimizaron las condiciones de análisis y pretratamiento de las muestras de tejido vegetal. Las conclusiones de este estudio fueron: La electroforesis capilar es una técnica apropiada para el estudio de las formas oxidada y reducida de ácido ascórbico. Fue posible establecer un método para la cuantificación de ácido ascórbico y por diferencia el ácido dehidroascórbico, bajo condiciones de electromigración en zonas, detección directa por absorción UV, modo de polaridad normal y electrolito de alta fuerza iónica. La Tris [2-carboxietil] fosfina (TCEP) fue efectivo como reductor del ácido dehidroascórbico en la matriz ácida constituida por MPA 2%. La aplicación de una concentración de 1 mM por 24 horas a temperatura ambiente reduce el ADHA produciendo cantidades cuantificables de ácido ascórbico. El efecto reductor es independiente de la presencia de AA en la muestra. La materia orgánica soluble modifica la biodisponibilidad de los metales pesados en solución, efecto que depende de cada elemento y se manifiesta en un cambio en la concentración de los elementos en la parte aérea y raíz de la planta. A nivel foliar la MOS disminuye la concentración de cobre y cadmio, incrementa la de plomo y no presenta efecto sobre níquel. A nivel de la raíz, el comportamiento es distinto, cobre, plomo y níquel disminuyen su concentración respecto de un tratamiento solo con metal y cadmio la incrementa. La asociación de materia orgánica soluble con materia orgánica coloidal presenta un efecto sinérgico sobre la translocación del metal a la parte aérea de la planta. Este efecto se manifestó para cobre y cadmio en una mayor disminución de su concentración foliar en comparación a la sola aplicación de MOS. Este efecto no fue observado en la raíz. El efecto de cobre cadmio y plomo sobre los sistemas de glutatión reducido/glutatión oxidado y ácido ascórbico/dehidroascórbico en la planta difieren para cada elemento y tipo de tejido. Para los péptidos el efecto se produce principalmente en la raíz. El cobre disminuye los niveles de ambos péptidos, en cambio plomo y cadmio tienen efecto solo sobre glutatión oxidado con disminución e incremento, respectivamente. Para el sistema ácido ascórbico/dehidroascórbico, los tres elementos disminuyen levemente el nivel de ácido ascórbico foliar, en tanto que en la raíz se observó efecto solo para cobre con disminución. Los experimentos de este estudio no evidenciaron la presencia de ácido dehidroascórbico en la planta. La asociación de materia orgánica soluble y metal en comparación al tratamiento solo con metal produce cambios en los niveles de glutatión reducido, glutatión oxidado y ácido ascórbico. Los mayores cambios se observaron para cadmio el cual incrementó los niveles de glutatión oxidado en parte aérea y raíz, en tanto que disminuyó los niveles de glutatión y ácido ascórbico en la raíz. Por su parte, la asociación plomo incrementó los niveles de ambos péptidos en la raíz / The purpose of this study was assess the effect of soluble organic matter (SOM) and colloidal organic matter (COM) from two sewage sludge obtained by different processes, on the bioavailability of copper, lead, cadmium and nickel besides of oxidized and reduced forms of glutathione, ascorbic acid (AA) and dehydroascorbic acid (DHAA) levels in tomato plants (Lycopersicon esculentum L.). This study involved the hydroponics cultivation of plants under controlled conditions and their elements analysis through atomic absorption spectrophotometry, atomic emission and molecular spectrophotometry. The analysis of glutathione forms, ascorbic acid and dehydroascorbic acid was carried out by Capillary Zone Electrophoresis (CZE), for which was optimized the analysis and pretreatment conditions of vegetal tissue samples. The conclusions of this study were: The Capillary Electrophoresis is a suitable technique for study the oxidized and reduced forms of ascorbic acid. It was possible to establish a method to quantify ascorbic acid and by subtraction the dehydroascorbic acid, under conditions of electromigration in zones, direct detection by UV absorption, normal polarity set and a high ionic strength of electrolyte. The Tris-(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) was an effective reductor of dehydroascorbic acid in the acid matrix containing MPA 2%. The applications of a concentration of 1mM for 24 hours to 20º C reduced the DHAA, generating quantifying amounts of AA. This reduction effect is independent of the AA into the sample. The soluble organic matter alters the bioavailability of heavy metals in solution, effect that depend of each element and it is expressed for changes in the concentration on the elements in leaves and root of the plants. In leaves the SOM decrease copper and cadmium concentration, raise the lead concentration and does not present an effect on nickel concentration. In the root the behavior is different, copper, lead, and nickel reduce their concentration compared to the treatment with metal only and on the other hand cadmium raises its concentration. The association between soluble organic matter and colloidal organic matter shows synergistic effect on the translocation of metals to leaves of the plant. This effect was observed for copper and cadmium due to a major diminution of its concentration in leaves compared with the application of SOM only. This effect was not observed in the root. The effect of copper, cadmium, and lead over the systems glutathione/oxidized glutathione and ascorbic acid/dehydroascorbic acid in the plant, differs for each element and kind of tissue. For the peptides, the effect is expressed mainly in the root. Copper reduces the levels of both peptides and on the other hand lead and cadmium have an effect only on oxidized glutathione, with a diminution and increment, respectively. For the ascorbic acid/dehydroascorbic acid system, the three elements reduce slightly the ascorbic acid levels in leaves, whereas in root it was observed a diminution for copper only. The experiments in this study didn’t show effects over the dehydroascorbic acid levels. The association between soluble organic matter and metal in comparison with the metal only treatment leads to changes on the glutathione, oxidized glutathione and ascorbic acid levels. The major change was observed for cadmium which raised the glutathione and ascorbic acid levels in root. Respect to the lead, its association with SOM raised the levels of both peptides in root

El objetivo de la presente tesis doctoral ha sido estudiar comparativamente los efectos de dietas liquidas control, de composición definida, conteniendo aceite de oliva o, de maíz como fuente lipídica, respectivamente de ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados, sobre el metabolismo oxidativo de ratas. La presencia de dobles enlaces en la molécula de un ácido graso constituyen puntos vulnerables a las reacciones de oxidación generando los peróxidos lipídicos, compuestos potencialmente tóxicos que pueden producir graves daños celulares (alteración de la permeabilidad celular, alteración de las prostaglandinas, etc.). Frente a este daño oxidativo, los organismos aeróbicos cuentan con mecanismos de defensa intracelulares, sistemas antioxidantes tanto enzimáticos como no enzimáticos. Entre los antioxidantes destaca el alfa-tocoferol como antioxidante lipofílico mayoritario. En nuestro estudio también hemos considerado las posibles interacciones de los productos de la peroxidación lipídica con el DNA en hígado de ratas, a través de la inducción de la 8-oxo-2' deoxiguanosina, un marcador del daño oxidativo del DNA. Se observó que la actividad de las enzimas antioxidantes superoxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPX), aumentaban en el hígado y en la grasa blanca de las ratas control alimentadas con aceite de oliva al comparar con los grupos control maíz. Sin embargo, en la grasa parda y en las células sanguíneas las actividades enzimáticas presentaban una tendencia a disminuir en los grupos control alimentados con aceite de oliva. Cuando se estudiaron los niveles del glutatión reducido (GSH) se observó que, tanto en el hígado como en las células sanguíneas de las ratas control alimentadas con aceite de maíz, los niveles de este tripéptido se habían reducido. Sin embargo, en los hepatocitos de las mismas ratas estos niveles habían aumentado. Esto pone de manifiesto el efecto protector de la vitamina E como antioxidante. Se obse / Drehmer Rieger, E. (2007). Estudio comparativo de aceite de oliva y maíz sobre el metabolismo oxidativo de rata [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4181 / Palancia

Saccharomyces cerevisiae posseeix dues glutatió transferases (GST) anomenades Gtt1i Gtt2, amb capacitat de conjugar una molècula de glutatió amb el substrat estàndarCDNB. Aquests dos enzims no són clasificables dins de les classes convencionalsdescrites en base a l'estructura de les GST d'eucariotes superiors, encara que guardencerta similitud estructural amb els membres de la classe Zeta. En aquesta memòria esdescriu la caracterització de tres GST de classe Omega en S. cerevisiae anomenadesGto1, Gto2 i Gto3, codificades respectivament per les ORFs YGR154c, YKR076w iYMR251w. Els enzims d'aquesta classe no tenen activitat sobre CDNB, però són activescom tiol oxidoreductases i posseïxen activitat dehidroascorbat reductasa i dimetilarsenatreductasa. La primera d'elles, Gto1, és peroxisomal i posseïx un senyal de localitzacióde tipus PTS1 en la regió C-terminal. Aquest senyal és reconeguda pel transportadorperoxisomal Pex5, que facilita la seva internalizació en aquest organul. D´altre banda,Gto2 i Gto3 tenen localització citoplàsmica. Els gens GTO de S. cerevisiae s'induïxenper estrès oxidativu però amb patrons distints per als tres gens. La dependènciad'aquesta expressió dels factors de trascripció Yap1, Msn2 i Msn4 es relaciona amb lapresència de seqüències YRE i STRE en els promotors dels gens GTO. El mutant Dgto1és sensible a l'agent oxidant diamida i té una concentració intracel· lular de glutatiómenor que la soca silvestre. Aquest fenotip es relaciona amb que el triple mutant Dgtt2Dgtt1 Dgto1 sigui sensible al cadmi, indicant que les tres GST Gtt1, Gtt2 i Gto1intervenen en la detoxificació d'aquest metall. Altre fenotip rellevant és la dificultat delmutant Dgto1 per a créixer en medis de cultiu amb àcid oleic com única font de carboni,indicant que les funcions peroxisomals en el mutant estan afectades. L'absència deGTO1 en S. cerevisiae causa així mateix el descens en l'expressió de gens involucratsen la via de síntesi de cisteïna i metionina. Com a conseqüència, el mutant Dgto1 creixamb dificultat en absència de treonina, serina o lisina. La manca de GTO1 en S.cerevisiae impedeix que utilitzi eficientment la cisteïna o la cistationina com úniquesfonts de sofre, manifestant defectes en la transulfuració, procés que permet la síntesi demetionina a partir de cisteïna. Això suggereix que Gto1 podria estar regulant l'activitatcistationina b-liasa de Str3 mitjançant la seva activitat tiol oxidoreductasa, atès que Str3també és peroxisomal. Atès que la cisteína 387 de Str3 és important per a la sevaactivitat biològica i està conservada en les cistationina b-liasas d'altres espècies defongs, aquest residu podria ser diana de Gto1 per a la regulació de l'estat redox de laproteïna Str3RESÚMENSaccharomyces cerevisiae posee dos glutatión transferasas (GST) denominadas Gtt1 yGtt2 con capacidad de conjugar una molécula de glutatión con el sustrato estándarCDNB. Estas dos enzimas no son clasificables dentro de las clases convencionalesdescritas con base en la estructura de las GST de eucariotas superiores, aunqueguardan cierta similitud estructural con las de clase Zeta. En esta memoria se describela caracterización de tres GST de clase Omega en S. cerevisiae denominadas Gto1,Gto2 y Gto3, codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. Las enzimasde esta clase no tienen actividad sobre CDNB, pero son activas como tioloxidoreductasa y poseen actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsenatoreductasa. La primera de ellas, Gto1, es peroxisomal y posee una señal de localizaciónde tipo PTS1 en la región C-terminal. Dicha señal es reconocida por el transportadorperoxisomal Pex5, que facilita su internalización en este organelo. Por otra parte, Gto2y Gto3 tienen localización citoplásmica. Los genes GTO de S. cerevisiae se inducen porestrés oxidativo pero con patrones distintos para los tres genes. La dependencia de estaexpresión de los factores de trascripción Yap1, Msn2 y Msn4 se relaciona con lapresencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. El mutanteDgto1 es sensible al agente oxidante diamida y tiene una concentración intracelular deglutatión menor que la cepa silvestre. Este fenotipo se relaciona con que el triplemutante Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 sea sensible al cadmio, indicando que las tres GST Gtt1,Gtt2 y Gto1 intervienen en la detoxificación de este metal. Otro fenotipo relevante es ladificultad del mutante Dgto1 para crecer en medios con ácido oleico como única fuentede carbono, indicando que las funciones peroxisomales en dicho mutante estánafectadas. La ausencia de GTO1 en S. cerevisiae causa así mismo el descenso en laexpresión de varios genes involucrados en la vía de síntesis de cisteína y metionina.Como consecuencia, el mutante Dgto1 crece con dificultad en ausencia de treonina,serina o lisina. La ausencia de Gto1 en S. cerevisiae impide que utilice eficientementela cisteína o la cistationina como únicas fuentes de azufre, manifestando defectos en latransulfuración, proceso que permite la síntesis de metionina a partir de cisteína. Ellosugiere que Gto1 podría estar regulando la actividad cistationina b-liasa de Str3mediante su actividad tiol oxidoreductasa, dado que Str3 también es peroxisomal.Dado que la cisteína 387 de Str3 es importante para su actividad biológica y estáconservada en las cistationina b-liasas de otras especies de hongos, este residuopodría ser diana de Gto1 para la regulación del estado redox de la proteína Str3.SUMARYSUMMARYSaccharomyces cerevisiae contains two glutathion transferases (GST) named Gtt1 andGtt2, which are enzymes with glutathione conjugating activity with the standard substrateCDNB. These two enzymes are not classified into the conventional classes that havebeen established based on the structure of mammalian GST, although they keep certainstructural similarity with Zeta class members. In this report, we describe thecharacterization of three S. cerevisiae Omega class GST named Gto1, Gto2 and Gto3,coded by ORFs YGR154c, YKR076w and YMR251w, respectively. The enzymes ofthis class do not exhibit activity with CDNB but they are active as tiol oxidoreductases,dehydroascorbate reductases and dimetilarsonate reductases. The first of them, Gto1,is located at the peroxisome and is targeted to this organelle throught a C-terminalPTS1-type sequence. This sequence is recognized by the peroxisomal transporterPex5 that facilitates peroxisomal import. On the other hand, Gto2 and Gto3 are at thecytosol. The GTO genes of S. cerevisiae are induced by oxidative stress, although theexpression patterns are different for the three genes. The expression of GTO genesdepends on Yap1, Msn2 and Msn4 transcription factors and correlates with thepresence of YRE and STRE sequences in the promoters of these genes. The absenceof GTO1 causes a hipersensitivity to the oxidant diamide in S. cerevisiae and reducesthe intracelular concentration of glutathione, compared with the wild type stain. Thisphenotype is related to cadmium sensitivity of the Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 triple mutant,indicating that Gtt1, Gtt2 and Gto1 participate in the response to cadmium toxicity.Another rellevant phenotype of S. cerevisiae cells lacking GTO1 is the growth defectwith oleic acid as the sole carbon source, indicating that the peroxisome funtions areaffected in the mutant. This mutant also grows defficiently in the absence of threonine,serine or lysine in the growth medium. Lack of GTO1 function also affects negativelythe expression of several genes involved in methionine and cisteine sinthesis. As aconsecuence, the Dgto1 mutant shows defective growth in a medium with cisteine orcistationine as the sole sulfur source as a consequence of defective trasulfuration, aprocess that allows methionine synthesis from cisteine. This suggests that Gto1 couldregulate the cystathionine b-lyase activity of Str3 through its thiol oxidoreductaseactivity, since Str3 is also peroxisomal. As the cysteine 387 residue of Str3 is importantfor the biological activity of this protein and is conserved in fungal species, this residuecould be a target of Gto1 for the regulation of the redox state of Str3.