En el capítulo 1, se presenta una introducción general sobre el uso de nanomateriales en sistemas de biosensores electroquímicos, centrada principalmente en nanopartículas de oro y de Azul de Prusia así como en nanocanales. En este capítulo se detallan también en profundidad las aplicaciones de los sistemas basados en nanocanales de estado sólido (membranas nanoporosas). En el capítulo 2 se detallan los objetivos generales y específicos de esta tesis. En el capítulo 3 se muestran los resultados obtenidos sobre la síntesis y caracterización de nanopartículas de oro (20 nm) modificadas con péptidos derivados de k-caseina para su uso en el reconocimiento y cuantificación de bacterias patógenas, aprovechando sus propiedades como inhibidores de la adhesión bacteriana. En este trabajo se aprovecha la capacidad que tienen las AuNPs para actuar tanto como portadores del péptido como de marcadores electroactivos, permitiendo la evaluación de la interacción bacteria patógena-péptido de un modo simple y rápido gracias a la medición cronoamperométrica de la reacción de evolución de hidrógeno sobre electrodos serigrafiados de carbono. En el capítulo 4 se describe el estudio de una nueva plataforma nanoporosa basada en el ensamblaje de nanoesferas, para el desarrollo de inmunosensores electroquímicos que no requieren el uso de marcadores. El sistema sensor se prepara mediante la deposición recubrimiento por inmersión, sobre la superficie de electrodos serigrafiados ITO/PET, formando una monocapa homogénea de nanoesferas de poliestireno carboxiladas. Los espacios entre las nanopartículas generan nanocanales bien ordenados, que se bloquean a través de la formación de inmunocomplejos. Las proteínas se detectan midiendo el descenso en la señal electroquímica de un indicador red-ox convencional (Fe2/3), debido al bloqueo de los nanocanales. El sistema desarrollado es simple, rápido y altamente integrado, permitiendo superar las limitaciones de sistemas basados en nanocanales propuestos anteriormente. En el capítulo 5 se presenta un biosensor novedoso basado en el uso de nanocanales en combinación con nanopartículas de azul de Prusia como indicadores redox para la detección de proteínas biomarcadoras de cáncer, sin necesidad del uso de marcadores. La suspensión estable y homogénea de nanopartículas de azul de Prusia (4 nm) obtenidas, protegidas por polivinilpirrolidona, muestran un par de picos re-dox bien definidos y reproducibles, por lo que estas nanopartículas se aplican con éxito para la evaluación voltamperométrica del bloqueo de los nanocanales (20 nm de diámetro de poro) debido a la formación del immunocomplejo. Esta novedosa tecnología permite la captura de proteínas de bajo peso molecular dentro de los canales y su posterior detección a niveles de ng/mL, como es el caso del biomarcador de cáncer PTHrP, por sus siglas en ingles, (proteína vinculada a la hormona paratiroidea). En el capítulo 6 se discuten las conclusiones generales de la tesis y las perspectivas futuras. Finalmente, en el contexto del desarrollo de sistemas biosensores integrados basados en nanocanales de estado sólido, en el anexo 1 se muestran los resultados preliminares relacionados con la detección in-situ de proteínas biomarcadoras secretadas por células cultivadas sobre la superficie de membranas nanoporosas. Por otro lado, en el anexo 2 se muestran los resultados preliminares relacionados con el uso de litografía de nanoimpresión para la creación de nanocanales en electrodos de ITO/PET. / A general overview about the use of nanomaterials in electrochemical biosensing, focusing on gold nanoparticles (AuNPs), Prussian blue nanoparticles (PBNPs) and nanochannels is given in Chapter 1. A special emphasis is given to the approaches based on solid-state nanochannel array devices (nanoporous membranes) including the state-of-the-art of their applications in biosensing. The general and detailed objectives of this thesis are described in Chapter 2. Chapter 3 presents the results obtained for the synthesis and characterization of gold nanoparticles (AuNPs 20 nm sized) modified with k-casein derived peptides for the fimbriae bacteria recognition and quantification, taking advantage of the peptide effect as bacterial adhesion inhibitor. This peptide-based nanoparticle assay takes advantage of the dual character of the AuNPs: as carrier of the biorecognition molecule and as electrocatalytic label, allowing the evaluation of the pathogen bacteria-peptide interaction in a simple and rapid way through the chronoamperometric monitoring of the hydrogen evolution reaction (HER) on screen-printed carbon electrodes. Chapter 4 describes the study of a novel, cheap, disposable and single-use assembled nanoparticles-based nanochannel platform for label-free immunosensing. This sensing device is based on the deposition of a homogeneous monolayer of carboxylated polystyrene nanospheres onto the working area of homemade screen-printed ITO/PET electrodes by dip-coating. The spaces between the self-assembled nanospheres generate well-ordered nanochannels, which are blocked upon the immunocomplex formation. Proteins are detected through the monitoring of the blockage in the channels, which is evaluated by the decrease in the voltammetric signal of a typical red-ox indicator. The developed device represents an integrated and simple biodetection system which overcomes many of the limitations of previously reported nanochannels-based approaches representing a really disposable biosensing device for a one-step sensing application. The work described in this chapter is done in collaboration with EMPA (Swiss Federal Laboratories for Materials Science and Technology). The development and study of a novel nanochannel array device, that operates through Prussian blue nanoparticles (PBNPs) as red-ox indicator for sensitive label free immunodetection of a cancer biomarker is presented in Chapter 5. Stable and narrow-sized (around 4 nm) PBNPs, protected by polyvinylpyrrolidone, exhibit a well-defined and reproducible red-ox behavior and are successfully applied for the voltammetric evaluation of the nanochannels (20 nm pore sized) blockage due to the immunocomplex formation. This novel and effective technology for the detection of small proteins captured inside the nanochannels is successfully applied for the quantification of a cancer biomarker (parathyroid hormone-related protein, PTHrP). In Chapter 6 the general conclusions and the future perspectives are discussed Finally, in the context of the development of nanochannel array-based integrated systems, Annex 1 describes the preliminary results related to the use of nanoimprint lithography (NIL) for the nanochannels creation onto ITO/PET electrodes. In addition, Annex 2 describes preliminary studies related to the in-situ detection of protein biomarkers secreted by cells cultured onto nanoporous membranes.

El presente trabajo gira alrededor de los registros de gemelos, y del “Registro de Gemelos de Murcia” (RGM) en particular, como recurso fundamental de investigación, a la hora de profundizar en el conocimiento de la contribución relativa de factores genéticos y ambientales al comportamiento. Los diseños genéticamente informativos y, en particular los estudios de gemelos, constituyen un importante recurso para llegar al conocimiento de las causas de variación fenotípica en humanos. Estos diseños constituyen la metodología más utilizada para separar las causas genéticas de las ambientales en el parecido familiar. Este tipo de estudios tiene, actualmente, una importante implantación y conlleva un alto grado de especialización, acorde con su enorme potencial investigador. Para su desarrollo se basan en la existencia de registros de nacimientos múltiples. Los registros de gemelos que existen actualmente, y que se distribuyen por todo el mundo, surgen como una respuesta metodológica a los diferentes estudios específicos con gemelos que inicia la comunidad científica. La determinación de la cigosidad, la evaluación del supuesto de ambientes idénticos, y la comprobación de la representatividad de la muestra, son cuestiones básicas sobre las que se apoya el método de los estudios de gemelos. Estos tres elementos son claves para asegurar la utilidad de la comparación efectuada y la validez de los resultados obtenidos. Por tanto, parece evidente que la comprobación de estas tres cuestiones es un principio primordial en el establecimiento de la utilidad científica de un registro de gemelos. Esta tesis tiene tres objetivos principales: validar el cuestionario de cigosidad utilizado hasta el momento en el RGM, comparando la clasificación efectuada por el instrumento con los resultados de cigosidad obtenidos a partir de marcadores génicos; analizar la veracidad del supuesto de ambientes idénticos entre los participantes del RGM, comparando los datos disponibles sobre residencia compartida entre gemelos MZ y DZ; y estimar hasta qué punto la muestra de sujetos participantes en el RGM es representativa de la población de referencia, de acuerdo a marco geográfico, sexo y grupo de edad. El diseño para el desarrollo general del RGM consiste en una cohorte de base poblacional, formada por individuos nacidos de partos múltiples residentes en la comunidad autónoma de Murcia, que se incluye en un registro de parejas con participación voluntaria. Este trabajo en particular utiliza tanto la muestra completa de participantes como sub-muestras seleccionadas, en función de los objetivos específicos de cada una de las investigaciones que lo componen. De la misma forma, los procedimientos utilizados, varían y se adaptan a los objetivos concretos de análisis. Finalizado este trabajo se puede concluir que se han cumplido razonablemente los principales objetivos marcados para el mismo. Así, se puede aceptar la validez de la adaptación española del cuestionario de cigosidad utilizado. Se ha comprobado que existe una discordancia importante entre la impresión subjetiva de los gemelos y la clasificación mediante cuestionario y análisis de marcadores genéticos, existiendo una llamativa sobreestimación de la dicigosidad. La proporción de gemelas que viven en el mismo o diferente municipio, a lo largo de su vida, no está influido por el tipo de cigosidad, cumpliéndose en general, y a priori, el supuesto de ambientes idénticos. De la misma forma, el tipo de cigosidad tampoco se relaciona con la proporción de pares que han vivido en el mismo municipio durante los primeros 16 años de vida. Para terminar, tras la estimación de la representatividad de la muestra del RGM respecto a las poblaciones de referencia de Murcia y España, se encuentran resultados que avalan la extrapolación de los datos a la población general. / This doctoral dissertation deals with twin registries and the "Murcia Twin Registry" (MTR) in particular, as a fundamental research resource for in depth understanding of the relative contribution of genetic and environmental factors to behavior. Genetically informative designs, specifically twin studies, are an important resource for the analysis of the causes of human phenotypic variation. These designs are the methodology of choice in order to separate genetic from environmental causes in family resemblance. Currently, such studies are widely implemented and entail a high degree of specialization, in accordance with its enormous research potential. Their development is based on the existence of multiple births records. Nowadays, twin registries are distributed worldwide, and their implantation represent a methodological response to specific twin studies initiated by the scientific community. Zygosity determination, assessment of the equal environment assumption (EEA), and verification of the representativeness of the sample, are core issues of the twin studies methodology. These three elements are the key to ensure the usefulness of the comparisons, and the validity of the results obtained. It therefore seems clear that testing these three questions is an essential principle in establishing the scientific utility of any twin registry. This dissertation has three main objectives: to validate the zygosity questionnaire used so far in the MTR, by means of comparing the classification by this instrument and the zygosity results obtained by genetic markers; to analyze the accuracy of the equal environments assumption among participants of the MTR, comparing the data about periods of shared residence between MZ and DZ twins; and to investigate to what extent the sample of subjects participating in the MTR is representative of the reference population, according to geographical context, sex and age group. The design for the overall development of the MTR is a population-based cohort, consisting of individuals born from multiple births and living in the Region of Murcia. These subjects are included in a twin registry with voluntary participation. This particular work uses the full sample of MTR participants, as well as some selected sub-samples, depending on the specific objectives of each of the investigations that compose it. In the same way, the procedures used vary and adapt to the specific objectives of analysis. The main conclusion of this dissertation is that the general objective of validating the MTR as a research resource has been reasonably achieved. Some of the main findings that contribute to that objective can be highlighted. The validity of the Spanish adaptation of the zygosity questionnaire has been proved. There is a major discrepancy between the subjective zygosity classification of the twins, and the classification by questionnaire and analysis of genetic markers, showing a striking overestimation of dizygosity. The proportion of twins living in the same or different municipality throughout their lives is not influenced by the type of zygosity, fulfilling in general, and a priori, the equal environment assumption. What is more, zygosity is not related to the proportion of pairs who have lived in the same town during the first 16 years of life. Finally, the representativeness of the sample of the MTR in relation to the reference populations of Murcia and Spain has been estimated and the results support the generalizability of the data to the general population.

Las inmunodeficiencias primarias constituyen un grupo de enfermedades de etiología diversa que tienen en común un defecto cualitativo o cuantitativo del sistema inmunitario a consecuencia del cual se alteran sus funciones, comprometiendo la defensa contra las agresiones externas. En el presente trabajo se describen las características clínicas e inmunológicas de pacientes con sospecha de inmunodeficiencia primaria o síndromes linfoproliferativos en los que se llevó a cabo el diagnóstico molecular. Se evaluó la capacidad oxidativa de granulocitos en una paciente que había sufrido infecciones de repetición por bacterias catalasa positiva, observándose la falta de producción de superóxido. El estudio genético de la subunidad p47-phox de la NADPH-oxidasa mostró una deleción del dinucleótido GT al inicio del exón 2 del gen NCF1, siendo diagnosticada de Enfermedad Granulomatosa Crónica. Se estudió el caso de un paciente con infecciones de repetición durante el periodo neonatal y una severa linfopenia T y B. Se realizó el diagnóstico de Déficit de ADA a través de un ensayo de actividad enzimática. Posteriormente, se realizó un trasplante alogénico de donante emparentado haploidéntico, con exitosa recuperación del sistema inmunológico. Analizamos un paciente varón con sospecha clínica de inmunodeficiencia humoral, con un número disminuido de células B e hipogammaglobulinemia. Por métodos bioquímicos se puso de manifiesto la falta de expresión de la proteína Btk. El análisis genético del gen BTK, mostró una nueva mutación (Q103X) que afectaba al dominio PH de la Btk, siendo diagnosticado de XLA con una correlación completa entre el genotipo, expresión proteica y fenotipo clínico. En los casos estudiados con Síndrome de Hiper IgM se descartó que fuesen formas debidas a alteraciones en las moléculas principales del eje CD40-CD40L. Encontramos ausente la población de células B memoria, analizando la expresión de IgM y CD27 en células B CD20+. Se realizó el estudio genético del gen AID, así como de las regiones constantes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, sin encontrar alteraciones. Estas características nos indican que el defecto en el cambio de isotipo podría encontrarse en este proceso tras la rotura del DNA y nos permite caracterizarlos dentro del grupo HIGM4.Se analizan los rasgos clínicos, inmunológicos y genéticos de once pacientes con sospecha de ALPS. Hemos descrito dos familias con mutaciones que afectan al residuo 234 de la proteína FAS, las cuales se correlacionan con una apoptosis vía Fas disminuida, con la presencia de células DNT y con una penetrancia clínica variable, lo que nos permite definirlas como ALPS tipo Ia. El resto de los pacientes, sin mutaciones en Fas, con alteraciones funcionales en la apoptosis vía Fas se clasifican en el grupo de ALPS III.Por último, se ha estudiado una población doble positiva (DP) en un paciente con patología respiratoria. Las características de la población indican que fenotípicamente se trata de una población T CD3+CD4+CD8+αβ, que funcionalmente pertenece a la estirpe de células T colaboradoras CD4. La expresión de CD103 y de CCR6 en la población DP, y su presencia en el órgano diana de la enfermedad, justifican su tropismo a mucosa pulmonar y relacionan dicha población con la patología respiratoria. Aunque el paciente no presentó rasgos de malignidad, el análisis del repertorio Vβ mostró reordenamientos clonales, que junto a las alteraciones cromosómicas sugerirían un estado preleucémico, que requeriría alteraciones adicionales para desarrollar un proceso neoplásico franco. Los resultados de esta Tesis muestran que la complejidad de las patologías que afectan al sistema inmunológico, requiere técnicas cada vez más específicas para determinar los defectos responsables de un fenotipo concreto. El estudio genético, molecular y funcional sistemático de estas enfermedades permite diagnosticar y clasificar entidades ya descritas, así como abordar el diagnóstico de nuevas patologías. / Although primary immunodeficiency disorders are relatively rare, intensive investigation of these disorders has yielded great understanding of basic immunologic mechanisms in host defense, inflammation, and autoimmunity. In this thesis we described the clinical and immunological features of patients with suspected of primary immunodeficiency disorders or lymphoproliferative syndromes. We assessed the NADPH oxidase activity in a patient with catalase-positive microbial infections, the results showed a deficiency in superoxide production. The mutation analysis of the structural component p47-phox revealed a GT deletion in a GTGT repeat sequence at the beginning of exon 2 of NCF1, with the subsequent diagnosis of Chronic granulomatous disease.We studied a patient with overwhelming infections within the first year of life and severely reduced counts of peripheral T and B cells. The patient had no detectable ADA activity associated with severe metabolic disturbances. He was treated with histocompatible bone marrow transplantation from haploidentical related donor, with successful recovery of the immunological system.We analyzed a patient with recurrent pneumonia characterized by low to undetectable levels of B cells and serum immunoglobulins. The expression of BTK protein was completely abolished in this patient evaluated by Western-blot. We described a novel mutation (Q103X) resulting in a premature stop codon, which encodes a deleterious truncated protein. We found a complete phenotype/genotype correlation in our XLA patient.We studied two patients characterized by very low IgG and IgA levels and normal or increased IgM diagnostic of Hyper-IgM syndrome. The CD154/CD40 pathway was analyzed discarding alterations. Mature class-switched CD27+IgM- memory B cells were profoundly diminished. The molecular analysis of AID and immunoglobulin heavy chains revealed no mutations. Although the molecular basis of these cases is still unknown, their clinical and immunologic findings have been well characterized.Several patients with clinical and immunological features of ALPS were analyzed. The molecular analysis of Fas gene showed two families with heterozygous mutations affecting different positions of 234 codon associated with increased αβ-DNT cells and defective in vitro receptor-mediated lymphocyte apoptosis. Other patients in this study with a clinical syndrome of ALPS have been found to have a normal FAS gene with impaired in vitro apoptosis and were diagnosed of ALPS IIII.We report an adult male who had recurrent episodes of pulmonary infiltrates with severe acute respiratory failure over a period of ten years. Clinical and pathological characteristics revealed BOOP that responded dramatically to Prednisone and other immunosuppressor treatments. A high proportion of circulating double positive T (DP-T) cells was detected in peripheral blood and in bronchoalveolar lavage, the entire DP-T cell subset were to TCRαβ CD3+CD4+CD8αβ+ lymphocytes. The CD103 and CCR6 expression in DP-T cells could explain their tropism to lung tissue. The TCRV-β chain analysis indicated clonal rearrangement and cytogenetic studies displayed chromosomic alterations that were similar to clonal proliferation observed in ataxia-telangiectasia and T-prolymphocytic leukemia. These findings suggest a smouldering form, in which the first sign is an organizing pneumonia that needs a constant corticoid treatment. Our results show that the complexity of pathologies that affect the immune system demand more specific techniques to determine the defects of a specific phenotype. The genetic, molecular and functional systematic analysis of these diseases allows a proper diagnosis and classification of known entities, and screen for undescribed pathologies.

El bovino criollo es el descendiente directo de los bovinos traídos por los españoles a partir de 1493. Por más de 400 años estuvo sometido a un proceso de selección natural. Se estudian 250 animales, por medio de seis sistemas de grupos sanguíneos, las frecuencias de 59 determinantes antigénicos y el locus de transferrina (TF). Los animales pertenecen al INTA-Leales y están agrupados en tres rodeos: Introducido; Seleccionado y Testigo. Se evidencia que los grupos Seleccionado y Testigo son muy semejantes (sólo difieren en un factor sanguíneo de los 59 analizados). El orígen común de ambas poblaciones, escaso número de fundadores y los pocos años de selección artificial parecieran ser los factores determinantes de esas similitudes. Por el contrario, la población Introducido, compuesta por animales de diversos orígenes difiere significativamente con ambos. En esta tesis se demuestra que el locus TF no presenta ninguna asociación con los caracteres de producción medidos (Indice de producción, Coeficiente de Fertilidad y Media Peso al destete), ratificándose lo hallado por Goenaga (1972). Sin embargo, los factores sanguíneos W+ y H del sistema B se encuentran en alta frecuencia en las vacas más productivas al igual que el factor X1 en las más fértiles, lo que estaría demostrando una asociación.

Objetivos Los cicindélidos o escarabajos tigre son una familia de coleópteros depredadores frecuentemente estudiados. Esta tesis se centra en dos géneros de cicindélidos: el género australiano Pseudotetracha, perteneciente a la tribu Megacephalini, y el género surasiático Cosmodela, de la tribu Cicindelini. En el primer capítulo se pone a prueba, mediante métodos moleculares, la clasificación presentada en trabajos previos, basados en la morfología, sobre el complejo de especies blackburni/murchisona en el género Pseudotetracha. En el segundo capítulo se analizan las meiosis de las mismas muestras con el fin de estudiar el papel de las reorganizaciones cromosómicas en la especiación y especialización de la tribu Megacephalini, así como confirmar la separación de dos clados hallados en el capítulo anterior. En el tercer capítulo se añaden más muestras de un área mayor de distribución, con el objetivo de revelar la diversidad críptica presente en Pseudotetracha inferida en los dos primeros capítulos y estudiar los procesos que han generado su diversidad. El cuarto capítulo trata del género asiático Cosmodela, en particular la especie C. aurulenta, en la cual se pone a prueba la identidad de las dos 21subespecies descritas como especies independientes, así como el papel que las glaciaciones han tenido en su historia evolutiva. Metodología Para cumplir estos objetivos se utilizaron diversos métodos. Tomando como base la secuenciación de diversos fragmentos de ADN mitocondrial y nuclear (cox1, cox3, 16S, 18S y wingless), se realizaron análisis filogenéticos usando los métodos de Máxima Parsimonia e Inferencia Bayesiana. En los capítulos 2 a 4 se empleó además un reloj molecular para situar en una escala temporal las divergencias observadas. Adicionalmente se realizaron análisis filogeográficos para clarificar las relaciones entre las diferentes poblaciones a un nivel infraespecífico. Los métodos de delimitación de especies GMYC y bPTP, basados en datos moleculares, se usaron en el capítulo 3. En el caso de Cosmodela también se analizaron las distancias genéticas entre los principales clados. En los capítulos 1 y 2 se observaron células en meiosis de los diferentes taxones de Pseudotetracha. Resultados Los resultados obtenidos en el capítulo 1 confirmaron, mediante métodos moleculares, la validez del complejo de especies blackburni/murchisona tal como había sido propuesta previamente en base a la morfología. Estos resultados se mostraron en desacuerdo con un trabajo previo que separaba a la especie P. blackburni de este grupo. La especie P. australis quedaría incluida dentro de este clado. La observación de células en metafase II proporcionó indicios de que los dos clados observados en P. blackburni tendrían un cariotipo diferente y podrían constituir dos especies crípticas. En el capítulo 2 se confirmó este último resultado, revelando que blackburni-2 tiene una fórmula cariotípica n=11+XY y blackburni-1 ha sufrido una reorganización cromosómica resultando en un sistema de cromosomas sexuales múltiples (n=10+X1X2Y) de tipo quiasmático y con un origen reciente como consecuencia de la fusión del cromosoma Y ancestral con un autosoma. Este sistema difiere del conocido en la tribu Cicindelini, antiguo y aquiasmático. Se observó una tendencia a la reducción del número cromosómico en la tribu Megacephalini, posiblemente por repetidos ciclos de incorporación de autosomas al par de heterosomas, proceso que favorecería la especiación y explicaría la alta especialización en este grupo. La filogenia realizada en el tercer capítulo detectó nueve especies previamente conocidas y otras nueve no descritas, en algunos casos crípticas. Además se infirió el papel que tuvo la aridificación de Australia en la separación de los diferentes linajes, así como la historia de cada uno de ellos. Los resultados mostraron que es necesaria una revisión taxonómica del género Pseudotetracha para aclarar las discordancias encontradas con trabajos previos y la identidad de varios taxones crípticos o de identificación confusa. Los resultados del capítulo 4 apoyaron la separación de las dos subespecies C. aurulenta aurulenta y C. a. juxtata como especies distintas, estrechamente emparentadas con C. batesi, que divergieron durante el Pleistoceno. Se reveló que C. aurulenta se habría originado en la península Malaya, desde donde colonizó Indonesia durante los máximos glaciares, mientras que C. juxtata habría colonizado secundariamente la península Malaya, donde coexiste con C. aurulenta. Aims Tiger beetles are a commonly studied family of predatory coleopterans. / This thesis focuses on two cicindelid genera: Australian genus Pseudotetracha, in the tribe Megacephalini, and southern Asian genus Cosmodela, in the tribe Cicindelini. In the first chapter, the classification made in previous works, based on morphology, about the blackburni/murchisona species complex in the genus Pseudotetracha is tested. In the second chapter, meiosis from the same samples are analyzed in order to study the role of chromosomic rearrangements in speciation and the specialization of the tribe Megacephalini, and to confirm the separation of two clades found in the previous chapter. In the third chapter, more samples from a wider area are included in order to unveil the cryptic diversity in Pseudotetracha inferred in the two first chapters, and to study the processes that generated their diversity. The fourth chapter deals with the Asian genus Cosmodela, concretely the species C. aurulenta, in which the identity of its two described subspecies as independent species, and the role of the glaciations in their evolutionary history, are tested. Methods Several methods were used in order to achieve these goals. Phylogenetic analyses using the methods of Maximum Parsimony and Bayesian Inference were carried out, based on the sequencing of mitochondrial and nuclear DNA fragments (cox1, cox3, 16S, 18S and wingless). In chapters 2 to 4 a molecular clock was used in order to trace in a chronological scale the observed divergences. Additionally, phylogeographic analyses were carried out in order to clarify the intraspecific relationships among populations. The species delimitation methods GMYC and bPTP, based on molecular data, were used in chapter 3. The genetic distances between the Cosmodela main clades were analyzed. In chapters 1 and 2, meiotic cells from the Pseudotetracha taxa were observed. Results The results obtained in chapter 1 confirmed, by means of molecular methods, the validity of the blackburni/murchisona species complex as it was previously proposed according to morphology. These results were in disagreement with a preceding work that separated P. blackburni from this group. P. australis would be included in this clade. The observation of metaphase II cells provide evidence that the two observed clades in P. blackburni could actually represent two cryptic species. Chapter 2 confirmed this result, showing that blackburni-2 has a n=11+XY karyotypic formula while blackburni-1 underwent a chromosomal rearrangement that produced a recent and chiasmatic multiple sex chromosome system (n=10+X1X2Y) as a consequence of a fusion between the ancestral Y chromosome with an autosome. This chromosome system differs from the ancient and achiasmatic multiple sex chromosome system known in tribe Cicindelini. A tendency towards the reduction in the chromosome number was observed in the tribe Megacephalini, probably by repeated cycles of incorporation of autosomes to the heterosomal pair. This process would favor speciation and would explain the high specialization found in this group. The phylogeny that was carried out in the third chapter detected nine previously known species and nine undescribed taxa. Moreover, the role of the aridification of Australia in the divergence of the lineages and the history of each clade were inferred. The results showed that a taxonomic revision of the genus Pseudotetracha is needed in order to clarify the discrepancies found in relation to previous works and the identity of several cryptic of difficult to identify taxa. The results of chapter 4 support the separation of the subspecies C. aurulenta aurulenta and C. a. juxtata as different species, closely related with C. batesi, that diverged during the Pleistocene. C. aurulenta was revealed to originate in the Malay peninsula, from which it colonized Indonesia during the glacial maxima, whereas C. juxtata would have secondarily colonized the Malay peninsula where it coexists with C. aurulenta.

Introducción: La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la alteración hepática de mayor prevalencia en los países occidentales y se caracteriza principalmente por la acumulación de lípidos en el hígado en ausencia de un consumo excesivo de alcohol. La obesidad, diabetes tipo 2, dislipemia e hipertensión suponen importantes factores de riesgo, hasta tal punto que la NAFLD es considerada la manifestación hepática del síndrome metabólico. La fisiopatología de la NAFDL comprende alteraciones tales como la acumulación de triglicéridos en el hígado -consecuencia de la resistencia a la insulina-, que junto con procesos de estrés oxidativo, peroxidación lipídica y aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias pueden conducir a complicaciones como esteatohepatitis (NASH), fibrosis o incluso cirrosis. Los factores dietéticos pueden modular la esteatosis hepática. De hecho, la modificación del estilo de vida, incluyendo dieta y ejercicio, es crucial para conseguir importantes mejoras. En este sentido, la dieta mediterránea se ha propuesto como estrategia dietética para esta enfermedad por su abundancia en frutas y verduras y menor ingesta de grasas saturadas y azúcares refinados. Entre los alimentos que forman parte de esta dieta, los tomates son una importante fuente natural de antioxidantes, especialmente de licopeno. Estudios previos han mostrado que el consumo de tomates y productos derivados fortalecen el sistema antioxidante e inhiben la peroxidación lipídica en humanos. Además, se ha observado un efecto preventivo del desarrollo de NASH inducida por la ingesta de una dieta alta en grasa en modelos animales, así como un efecto inhibitorio de la peroxidación lipídica en el hígado de los mismos, tras la ingesta de licopeno. Objetivo: El principal objetivo de la presente Tesis Doctoral fue evaluar el efecto del consumo de zumo de tomate sobre el metabolismo lipídico en el hígado para explicar los posibles mecanismos de acción del licopeno procedente del tomate in vivo. Para ello, se llevaron a cabo 2 experimentos empleando ratas Sprague Dawley. El primero se llevó a cabo con ratas normocolesterolémicas, y el segundo en ratas con esteatosis inducida mediante el consumo de una dieta de alto contenido en grasa y colesterol. Diseño experimental: En el estudio 1, 24 ratas macho de 12 semanas fueron divididas aleatoriamente en tres grupos (n=8) y alimentadas durante 3 semanas con dieta estándar de roedor y diferentes bebidas: agua (grupo control), zumo de tomate comercial con bajo contenido en licopeno (grupo 1) y zumo de tomate comercial con alto contenido en licopeno (grupo 2). Tras el sacrificio se extrajeron muestras de sangre e hígado. Además, se recogieron muestras de heces al inicio y final del periodo experimental. En el segundo estudio, 24 ratas macho de 8 semanas de edad fueron divididas aleatoriamente en cuatro grupos (n=6) y alimentadas durante 5 semanas del siguiente modo: dieta estándar y agua (NA) o zumo de tomate (NL), dieta alta en grasa y colesterol y agua (HA) o zumo de tomate (HL). Tras este periodo, los animales fueron sacrificados y se extrajeron muestras de sangre, tejido adiposo, aorta e hígado. Además, se recogieron muestras de orina y heces semanalmente. Resultados: En el estudio 1, se observó un aumento de las concentraciones de colesterol HDL tras el consumo de tomate. A pesar de que las concentraciones de colesterol en el hígado fueron muy similares en los tres grupos, se observó una menor actividad de la enzima HMG-CoA –enzima limitante de la síntesis de colesterol- en hígado en el grupo 2. Respecto a los ácidos grasos de cadena corta analizados en heces, únicamente se halló una concentración de butirato significativamente mayor en el grupo 2. En el estudio 2, se observó esteatosis en grado 2 en las muestras de hígado de los grupos alimentados con dieta grasa (HA, HL), que se confirmó por las elevadas concentraciones de las enzimas alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa, el examen histológico y la presencia de dislipemia. Tras el consumo de tomate se observó una mejoría en la concentración de colesterol HDL en el grupo HL en comparación con HA y una disminución del estrés oxidativo, revelada por la reducción de isoprostanos en orina. En el grupo HL se observó una sobreexpresión de varios genes relacionados con el transporte de ácidos grasos, la hidrólisis lipídica y la β-oxidación mitocondrial y peroxisomal, lo que sugiere una mejoría en el metabolismo lipídico hepático asociada a la ingesta de tomate. Por otra parte, se observó una interesante modificación del perfil peptidómico urinario en el grupo HL, quedando este en una situación intermedia entre los grupos N y el grupo HA, lo cual evidencia que el consumo de zumo de tomate mejora el patrón metabólico en el grupo alimentado con dieta alta en grasa, dirigiéndolo hacia un estado más fisiológico Conclusiones: Estos resultados sugieren que el licopeno procedente del zumo de tomate ejerce un efecto protector frente a la NAFLD y por tanto, el tomate y derivados deberían ser considerados dentro de las estrategias dietéticas recomendadas para su tratamiento. Sin embargo, se necesitan más estudios para elucidar los mecanismos de acción del licopeno en el metabolismo lipídico del hígado, así como para desarrollar un panel de biomarcadores específicos que permitan el diagnóstico y prevención de NAFLD. / ABSTRACT Background: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common liver disorder in Western countries with a high prevalence. It covers a spectrum ranging from hepatic steatosis to steatohepatitis (NASH), fibrosis and cirrhosis. Obesity, type 2 diabetes, dyslipidaemia and hypertension are most important risk factors; in fact, NAFLD is considered the hepatic manifestation of metabolic syndrome. The hallmark of NAFLD is hepatic lipid accumulation in the absence of significant ethanol consumption. Two steps or hits have been proposed for the pathophysiology of NAFLD and NASH: the first hit is owed to the triglycerides accumulation as consequence of insulin resistance. The second hit includes oxidative stress, lipid peroxidation, increased cytokine production and inflammation, resulting in NASH. Dietary factors may modulate liver steatosis. Indeed, lifestyle modification including diet and exercise are crucial to achieve significant improvements. In this regard, the Mediterranean diet has been suggested as the dietary strategy for this disease due to the high consumption of plant-based foods and low intake of saturated fats and refined sugars. Tomato products are a dietary source of natural antioxidants, especially, lycopene. Previous studies have shown the consumption of tomatoes and tomato products strengthened the antioxidant system and inhibited lipid peroxidation in humans. Moreover, lycopene has displayed to have a preventive effect on the development of NASH induced by a high fat diet in animal models, as well as, an inhibitory effect of lipid peroxidation in the liver tissues. Objective: On this basis, the main objective of the present Doctoral Thesis was to evaluate the effect of tomato juice on liver lipid metabolism in order to elucidate the possible mechanisms of action of tomato lycopene in vivo, using a Sprague Dawley rat model. For that, we carried out 2 experiments involving the intake of tomato juice; firstly with rats fed a standard rodent diet and secondly with rats with diet-induced hepatic steatosis (high-fat and high cholesterol diet). Experimental design: In study 1, 24 male Sprague Dawley rats (12 weeks old) were randomly divided in three groups (n=8) fed to standard diet for rodents and different drink as follows: control group (tap water as drink), group 1 (commercial tomato juice with a low content of lycopene) and group 2 (commercial tomato juice with a high content of lycopene). After three weeks, rats were sacrificed and blood and liver samples were collected. Furthermore, faeces samples were collected and the beginning and at the end of the experimental period. In study 2, 24 male Sprague Dawley rats (8 weeks old) were randomly divided in four groups (n=6) fed to standard diet (N) or hypercholesteraemic and high fat diet (H) for 5 weeks and were provided water (A) or tomato juice (L) as drink. After this period, rats were sacrificed and blood, adipose tissue, aorta and liver samples were collected. Moreover, urine and faeces samples were collected weekly. Results: In study 1, significant differences were found in HDL-cholesterol between control and experimental groups, being higher in latter groups. Despite of cholesterol levels in liver were very similar in three groups, an inhibitory effect of the activity of HMG-CoA-R in liver was shown in group 2. Finally, regarding short chain fatty acids (SCFA) analysed in the faeces, only a significantly higher concentration of butyrate was observed in group 2. In study 2, steatosis grade 2 was observed in groups H which was confirmed by the levels of plasma alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), histological examination and presence of dyslipidaemia. A significant improvement of HDL-c was observed in HL compared with HA, as well as an alleviation of oxidative stress through reduction of urine isoprostanes. In relation to fatty acid gene expression analysed in liver, an overexpression of several genes related to fatty acid transport, lipid hydrolysis and mitochondrial and peroxisomal β-oxidation was observed in HL. Interestingly, tomato juice intake partially reverted the metabolic pattern from a high-fat diet to a standard diet even in metabolites not related to the redox state. Furthermore, tomato juice consumption originated an interesting modification in patterns of urinary peptidomic biomarkers in group HL, staying in an intermediate position between group N and HA. Conclusions: In summary, these results suggest that lycopene from tomato juice has a protective effect on NAFLD and therefore, tomato and tomato products should be taken into consideration in the dietary strategies of treatment of NAFLD. However, further researches should be carried out to elucidate the mechanisms of lycopene in liver lipid metabolism in NAFLD and to develop a panel of specific peptidomic biomarkers to lead an early diagnosis and prevention of NAFLD.

Los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello (CECC) ocupan el octavo lugar entre las neoplasias del sexo masculino, presentando el Principado de Asturias una de las tasas de incidencia más altas de España. Aunque se han realizado importantes avances en su diagnóstico y tratamiento, la supervivencia se ha modificado poco en los últimos años debido a que se diagnostican en estadios avanzados. El desarrollo de metástasis en los ganglios linfáticos cervicales es el factor que más influye en la supervivencia. Los carcinomas epidermoides de laringe y faringe (CLF) son tumores sólidos que presentan un gran número de alteraciones cromosómicas. Se han diseñado modelos basados en LOH, que proponen pérdidas progresivas desde lesiones preinvasivas (9p21, 3p21, 17p13) hasta tumores avanzados (11q13, 13q21, 14q31), pero que no tienen en cuenta el papel de las ganancias cromosómicas, ni los cambios asociados al desarrollo de metástasis.Los objetivos de esta tesis han sido la detección de las alteraciones genético-moleculares asociadas al desarrollo de metástasis de los CLF relacionándolas con los datos clínico-patológicos y de seguimiento de los pacientes.Se han estudiado los cambios cromosómicos en 56 pacientes con carcinoma epidermoide de laringe-faringe mediante Hibridación Genómica Comparativa (CGH) y las alteraciones génicas de los 56 tumores primarios y las 25 correspondientes metástasis ganglionares utilizando la técnica de MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification)Con CGH todos tumores primarios presentaron gran número de alteraciones cromosómicas, destacando las pérdidas en las regiones 3p13-24, 11q23-25, 4p15-16, 18q21-23, 5q31-35, 8p21-22, 21q22, 17p12-13, 4q31-34 y 9p21-23, las ganancias en 3q25-27, 7q21-31, 8q11-qter, 5p12-14, 11q11-13, 2q24-32, 12p11-12, 17q11-23, 6q12-15, 4q12-13 y 18p11-pter y las amplificaciones en 3q26-qter, 11q13, 11q22, 3q12-13, 8q24.3, 2q32-33, 18p11.3, 18q11.2, 1p31, 4q11-13, 5p11-14, 8p11, 13q33-34, 22q13, las 8 últimas descritas por primera vez asociadas a CLF. La amplificación en 11q13 se asoció de forma significativa con el estadio tumoral avanzado y la presencia de metástasis ganglionares, aunque no con la supervivencia.Los 56 tumores primarios de nuestra serie presentaron como alteraciones génicas más frecuentes detectada por MLPA las pérdidas en CDKN2A y MLH1 (154pb) y las ganancias en CCND1 y EMS1, mientras que en las metástasis ganglionares lo fueron las pérdidas en CTNNB1 y CDKN2A y las ganancias en CCND1 y EMS1.Los tumores primarios metastáticos presentaron un patrón génico diferente de los no metastáticos con pérdidas en los genes TP53, N33 y STK11.Las metástasis ganglionares presentaron un patrón génico diferente del grupo completo de los tumores primarios con pérdidas en CTNNB1, RB1, MFHAS1, PTPN1, NRAS, LMNA, CDH2 y RENT2 y ganancias en STK11, IGSF4 y N33.En los pacientes con tumor primario metastático y su correspondiente metástasis ganglionar la pérdida de CDKN2A y la ganancia de EMS1 fueron alteraciones génicas comunes, siendo el patrón génico metastático el de las pérdidas en CTNNB1, LMNA, MFHAS1, IGF1R, RECQL4 y RENT2 y las ganancias en CDKN2D, N33 y TP53. Los tumores con estadios avanzados se correlacionaron con pérdidas génicas en N33 y TP53 y ganancias en EMS1 y CCND1, mientras que los ganglios metastáticos lo hicieron con pérdidas en N33, TP53 y STK11. La supervivencia sólo se correlacionó con la pérdida en N33.En el grupo de pacientes estudiados hemos encontrado múltiples alteraciones cromosómicas y génicas, algunas ya descritas, pero otras nuevas, que se han asociado a las diferentes etapas del desarrollo del tumor, principalmente en la fase hacia metástasis ganglionar. Aunque los tumores primarios y las metástasis ganglionares presentan cambios genéticos comunes, existen unos patrones de alteraciones específicas asociadas a los tumores con ganglios linfáticos positivos y a las metástasis ganglionares. La adquisición de estas alteraciones podría ser el desencadenante del desarrollo de metástasis linfáticas. Estudios adicionales son necesarios para confirmar su posible valor pronóstico y aplicación terapéutica.

El Virus de las manchas necróticas del melón (Melon necrotic spot virus, MNSV; género Carmovirus; Familia Tombusviridae) es un virus de ARN de sentido positivo endémico en cultivos de melón. Este virus ha sido empleado como modelo de estudio de aspectos relacionados con la superación de resistencias recesivas, la traducción de ARNs virales carentes de estructuras cap o el movimiento intercelular. Sin embargo, se sabe poco acerca de las respuestas que la infección por este virus induce en las plantas o los genes alterados como consecuencia del desarrollo de su ciclo viral en su huésped natural, el melón. Así mismo, se desconocen los lugares, dentro de la célula vegetal, donde este virus lleva a cabo su replicación viral. Todos estos procesos podrían aportar conocimiento sobre los genes necesarios en la interacción planta-virus que permiten el establecimiento de una infección satisfactoria por parte del virus, o los factores necesarios para la puesta en marcha de una respuesta de defensa eficaz para contrarrestar la infección y que podrían ser utilizados en estrategias antivirales. Con el objetivo de ahondar en el conocimiento de la interacción MNSV-melón, esta tesis ha sido estructurada en dos capítulos. En el primer capítulo, utilizando los microarrays como herramienta principal de análisis, se ha llevado a cabo un estudio de las alteraciones transcriptómicas inducidas por MNSV en melón, con especial énfasis en aquellos cambios asociados con: (i) una región no codificante del genoma del virus, (ii) diferentes cultivares de melón (iii) diferentes tejidos de la planta, (iv) y con el desarrollo de infecciones de tipo local o sistémico. Los resultados obtenidos han permitido identificar la desregulación específica de dos grupos de genes asociados con una región no traducible del genoma viral, así como genes que responden de forma específica de cultivar. La comparación entre tejidos ha mostrado una respuesta cuantitativa diferente entre hoja y cotiledón, pero cualitativamente muy similar, aportando validez a los resultados obtenidos en cotiledón. Así mismo, una aproximación tradicional al estudio de la posible activación de una respuesta sistémica adquirida por parte de la planta, ha descartado la activación de la misma. Finalmente, la comparación entre estos resultados con los obtenidos en trabajos previos para otros virus, ha permitido identificar un sólo gen compartido por los tres virus analizados, que podría ser importante en las infecciones virales al menos en melón. Por otro lado, estos análisis han puesto de manifiesto la importancia de utilizar diferentes tiempos de muestreo a la hora de realizar comparaciones entre los cambios transcriptómicos inducidos por diferentes virus. En el segundo capítulo, se ha llevado a cabo el análisis tisular de las lesiones inducidas por MNSV para delimitar las regiones de interés donde realizar los análisis ultraestructurales. Este análisis identificó una región idónea para tales efectos. El estudio ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión de la región identificada como Z2, ha puesto de manifiesto la existencia de grandes orgánulos originados como consecuencia de la infección por MNSV. Estos orgánulos han sido identificados como mitocondrias modificadas estructuralmente y representan los lugares donde el virus lleva a cabo su replicación ya que, a través de experimentos de hibridación in situ e inmunocitoquímica, se han localizado los ARNs virales, la proteína de la cápsida viral (CP) así como el dsRNA (intermediario de replicación) en estos orgánulos. La reconstrucción tridimensional de las mitocondrias modificadas mostró la presencia de grandes dilataciones internas, interconectadas entre ellas y con el citoplasma circundante a través de poros y/o estructuras complejas así como su conexión con cuerpos lipídicos. Así mismo, se llevó a cabo el estudio de la implicación de la proteína p29 de MNSV en la localización y generación de los sitios de replicación de MNSV. Para ello se generaron construcciones de la proteína p29 fusionada a GFP que fueron localizadas mediante microscopía laser confocal en mitocondrias. El análisis de la ultraestructura de las células que expresaron la proteína de fusión p29-GFP y su localización por inmunocitoquímica identificó la presencia de esta proteína en mitocondrias, así como la inducción de modificaciones estructurales en estos orgánulos muy semejantes a las inducidas por el virus. / Melon necrotic spot virus (MNSV) (genus Carmovirus, family Tombusviridae) is a single-stranded, positive-sense RNA virus endemic of cucurbit crops worldwide. This virus has become an experimental model for the analysis of cell-to-cell virus movement and translation of uncapped viral RNAs, whereas little is known about its replication or the transcriptome changes induced in melon plant by the virus during the viral cycle and in response to the infection. So far it is unknown the cellular compartment in which this virus carries out its viral replication. Addressing all these processes could provide information about genes involved in the plant-virus interaction that lead to a successful viral infection and the cellular factors involved in the defense response to counteract the infection. This knowledge may be used in future antiviral strategies. To clarify all these questions about MNSV-melon interaction this thesis has been structured into two chapters. The first chapter is focused on transcriptomic alterations induced by MNSV in melon plants, with special emphasis on those changes associated with: (i) a non-coding region of the genome virus, (ii) different melon cultivars, (iii) different plant tissues, and, (iv) development of local or systemic infections. Microarray analyses have led to identify a specific deregulation of two groups of genes associated with an untranslated region of the viral genome, and also several sets of genes that respond specifically in each cultivar. The comparison between tissues has shown a different quantitative response between leaf and cotyledon, but qualitatively similar, providing validity to the results obtained in cotyledon. Also, a traditional approach to the study of the putative activation of a systemic acquired response from the plant has dismissed the activation of such response. Finally, the comparison of these results with those obtained in previous work for other viruses, has identified one gene shared by all the three viruses tested. This gene could play a key role in melon viralinfection. On the other hand, these results have shown the need of using different sampling times when comparing transcriptome changes induced by different viruses. In the second chapter, an histological analysis of the MNSV infected tissues was performed in order to define the most adequate region where to focuses the ultrastructural analysis. This analysis identified an ideal region for this purpose. The ultrastructural study by transmission electron microscopy of the region identified as Z2, has revealed the existence of large organelles originated as a result of MNSV infection. Immunolocalization of the glycine decarboxylase complex (GDC) P protein in these organelles confirmed their mitochondrial origin. In situ hybridization and immunolocalization experiments showed the specific localization of positive-sense viral RNA, capsid protein (CP), and double-stranded (ds)RNA (a replication intermediate) in these organelles meaning that replication of the virus takes place in association with them. The three-dimensional reconstructions of the altered mitochondria showed the presence of large, interconnected, internal dilations which appeared to be linked to the outside cytoplasmic environment through pores and/or complex structures, and with lipid bodies. Transient expression of MNSV p29 revealed that its specific target is mitochondria. Our data document the extensive reorganization of host mitochondria induced by MNSV, which provides a protected environment to viral replication, and show that the MNSV p29 protein is the primary determinant of this effect in the host.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Vall d'Hebron - Grup de Recerca en Neurologia Pediàtrica / La malformació de Chiari de tipus I (MCI) s'ha definit tradicionalment com una alteració congènita caracteritzada pel descens de les amígdales cerebel.loses a travès del forat magne en 3 o més mm. Es creu que és conseqüència d'una fosa cranial posterior (FCP) hipoplàstica, amb un os occipital anormalment curt, que resulta d'un mesoderma paraxial insuficient. La simptomatologia descrita pels pacients és molt variada: mals de cap occipitals, cervicàlgies, marejos, vertígens, pèrdua de sensibilitat i de força a les extremitats, alteracions de la son i problemes en la deglució entre d'altres, atribuïts a la compressió de les estructures neurològiques contingudes en la FCP i a l'alteració de la circulació del líquid cefaloraquidi. S'ha estimat la seva prevalença en 1/1280 i, tot i que es desconeix la seva etiologia, diversos estudis apunten a una component genètica com la causa més probable. En la MCI molts dels casos són esporàdics, però s'han identificat famílies amb diversos individus afectats en diferents generacions. Per aquest motiu, aquest treball va tenir com a objectiu principal estudiar les bases genètiques de la patologia. Es van reclutar més de 530 pacients, pertanyents a 450 famílies, i es van desenvolupar dues estratègies: 1) estudi de les formes aparentment complexes de la patologia mitjançant un estudi d'associació genètica, en què es van avaluar variants de susceptibilitat en gens implicats en el desenvolupament del mesoderma paraxial, somites, endoteli vascular i os occipital; i 2) estudi de les formes aparentment monogèniques, mitjançant un estudi mutacional del gen SUZ12 que, en haploinsuficiència en un model murí, produeix fenotips similars als de les malformacions de Chiari tipus I i II. Es van seqüenciar també els exornes de dos pacients pertanyents a una mateixa família. Donat que el descens amigdalar cerebel.lós pot ser produït per diferents causes, es va realitzar també un estudi morfomètric de la FCP en imatges de ressonància magnètica amb la finalitat de definir un mètode de diagnòstic més específic que l'existent, i que permetés diferenciar els pacients amb MCI produïda per una FCP hipoplàstica de la produïda de forma secundària, per altres mecanismes. Es va caracteritzar també la cavitat orofaríngia dels pacients. Els resultats que es van obtenir demostren que és necessari establir un nou criteri diagnòstic que permeti diferenciar els pacients amb MCI en funció de la seva causa, la qual cosa facilitaria l'estudi de la base genètica d'aquesta malformació. S'ha trobat correlació entre certes alteracions a la cavitat orofaríngia i símptomes típics de MCI com les apnees de la son o problemes en la deglució. També s'han identificat variants de susceptibilitat en diferents gens implicats en la via de síntesi de l'àcid retinoic. Però els estudis de cribatge mutacional del gen candidat i de seqüenciació d'exornes en casos familiars no han permès identificar gens responsables de la MCI. / Chiari malformation type I (CMI) is a congenital disease that has been traditionally defined as the chronic tonsillar herniation of at least 3 mm below the foramen magnum. It is characterized by an overcrowding of a normally developed hindbrain within a hypoplastic PCF, although both age at presentation and symptoms show high variability. The etiology of the disease remains unknown, but the most accepted hypothesis is that CMI is the result of an insufficient development of the paraxial mesoderm. Several evidences suggest that, at least in a subset of CMI patients, genetic factors may play an important role. This project focused on the identification of genetic risk factors for CMI, including genes responsible for the mendelian and also the complex forms of the disease. To achieve this goal, two different strategies were followed: 1) Identification of susceptibility genetic variants in CMI patients using a casecontrol association approach. 2) Genetic analyses of monogenic forms by a mutational screen of the candidate gene SUZ12 and by exome sequencing in two CMI patients ofthe same family. We recruited 530 CMI patients from 450 unrelated families. Given that tonsilar herniation can be caused by five distinct mechanisms, we developed a probability model to establish a diagnosis with 93% confidence in those patients with a hypoplastic PCF. This diagnostic tool allowed to define a clinical homogeneous group for further genetic studies. A cephalometric oropharynx morphometric study was also performed to identify the possible underlying anatomical anomalies leading to less known symptoms. The results of the genetics association study paint to a putative role for defective retinoic acid signalling and fetal vasculogenesis in causing hypoplasia of the basichondrocranium. However, when we studied the monogenic forms, we did not find any causal variant.

El siglo XXI plantea un nuevo reto para la agricultura: las predicciones de aumento de la población mundial exigen aumentar la productividad de los cultivos. La incidencia del cambio climático sobre regiones históricamente agrícolas es causa ya del descenso en el rendimiento agrícola, al estar afectados por el impacto creciente de estreses abióticos como la sequía y la salinidad. Una de las estrategias para abordar este desafío es la generación y análisis de colecciones de mutantes de especies vegetales de gran importancia agro-alimentaria como tomate para la identificación de genes y la disección de mecanismos implicados en el desarrollo y la producción así como en la tolerancia a estreses abióticos. Dentro del programa de mutagénesis insercional con T-DNA en tomate que se lleva a cabo entre los grupos de investigación del IBMCP, UAL y CEBAS, en este trabajo nos hemos centrado en la identificación de mutantes afectados en el desarrollo reproductivo, que en último extremo afecta a la producción de fruto, y en la respuesta a la salinidad y la sequía, por ser estreses abióticos tan importantes por su incidencia en el rendimiento final. En el primer caso se aborda la identificación y caracterización de un mutante de gran interés agronómico por su fenotipo afectado en el desarrollo reproductivo, denominado afs1 (abnormal fruit set-1). El mutante afs1 se caracteriza por presentar una mayor tasa de cuajado de fruto, reflejada en un marcado aumento del número de frutos que, aunque de menor tamaño, promueven una mejora significativa de la producción. Entre las características de afs1 cabe destacar que sus frutos son partenocárpicos y destacan por su mayor calidad debido a una mayor concentración de glucosa y fructosa, así como de ácido cítrico, que dan lugar a un incremento del índice de sabor. La mutación responsable de dicho fenotipo no se debe a una inserción de T-DNA si no a una mutación somaclonal generada durante la transformación y cultivo in vitro, algo ya observado en otras colecciones de mutantes insercionales, y se está procediendo a su localización genómica. En el segundo caso se aborda la caracterización de un mutante alterado en la respuesta al estrés salino e hídrico. El mutante se ha denominado wak1 (Wall-associated kinase 1), ya que la mutación responsable ha sido etiquetada por un inserto T-DNA que se sitúa en la región promotora del gen SlWAK1, que forma parte de un clúster génico de cuatro isoformas que están localizadas en el cromosoma 9, que codifican para unas proteínas quinasas asociadas a pared celular (cell wall-associated kinases). Aunque la expresión del gen SlWAK1 está anulada en el mutante, no lo están sin embargo los genes flanqueantes SlWAK2 y SlWAK3. El mutante wak1 presenta un fenotipo similar a la planta no transformada cuando se cultiva sin estrés, muestra un fenotipo sutil en condiciones de estrés hídrico y salino a medio plazo, y finalmente reduce significativamente el rendimiento en términos de producción de fruto en estrés a largo plazo. A nivel fisiológico, el mutante wak1 presenta mayor tolerancia al estrés iónico inducido por salinidad, con menor acumulación de Na+ en hoja. Sin embargo, el mutante es sensible al estrés osmótico inducido tanto por estrés salino como hídrico. Además, la anulación del gen SlWAK1 provoca una acumulación de sacarosa en raíz, relacionada con una alteración en la expresión de genes implicados en el metabolismo de sacarosa. Considerados en conjunto, los resultados de la caracterización de estos mutantes fenotípicamente tan diferentes demuestran el gran interés que tiene el análisis de mutantes para avanzar en el conocimiento de los procesos y los genes clave en el desarrollo y en la tolerancia a estreses abióticos. / The XXI century poses new challenges to agriculture: the predictions of global population growth invite us to focus all our efforts on increasing crop yields. In turn, the impact of climate change on historically farming regions promotes the decrease of the performance of these vegetable species with high agronomic interest, such as the tomato, which is one of the most important global vegetable species. Among the strategies proposed to address the problems exposed, generating mutant collections is one of the most widespread strategies and it has provided much information about processes, pathways and relevant mechanisms. To this end, a collection of insertional mutants using an enhancer trapping has been created in the commercial cultivar of the tomato "Moneymaker" and we have directed our interest in selecting mutants affected in the reproductive development and in the response to abiotic stresses (salinity and drought) to be key processes that directly affect the final crop yield. Within the collection, we have identified a mutant with high agronomic interest related to reproductive development, which we have named afs1 (abnormal furit set-1), characterized by an increased vegetative growth rate and higher rate of fruit set. Their flowers show an opening in the base of the stamen caused by the early fruit set, initiated before the anthesis. The higher fruit set rate is reflected in the increase in fruits number, despite the smaller size, leading to a significant improvement in the production and final yield in greenhouse conditions. Among the characteristics of production, it is noteworthy that this afs1 produces parthenocarpic fruits with improved organoleptic characteristics, brought about by an increase in glucose and fructose, and citric acid therefore, leads to an increased rate of flavor. It has also been selected and characterized by a mutant response to salt and water stresses, named wak1 (Wall-associated Kinase 1) which carries a T-DNA inserted in the promoter region for canceling the SlWAK1 gene expression in the mutant. This gene is part of a gene cluster consisting of four total WAK isoforms genes in chromosome 9. qPCR expression analysis has indicated that the SlWAK1 expression is root specific and reduces its expression levels in response to salt stress . The two flanking SlWAK1 isoforms genes (referred to SlWAK3 and SlWAK2 in this paper) are not affected by the T-DNA insertion and have a similar pattern to the described for SlWAK1 response. At a phenotypic level, this mutant has a WT phenotype in standard culture conditions and displays a subtle phenotype under water and salt stresses, characterized by a significant reduction in the height rate of the aerial part, and the reduction of shoot water content. Paradoxically, despite the reduction in development, salt stress experiences have shown that the wak1 mutant has an increased tolerance to the accumulation of toxic concentrations of Na+ in the shoot. Furthermore, it has been shown that this mutant is sensitive to osmotic effect, which occurred in both the water stress and in the first phase of the salt stress. The results indicate that the basis of this sensitivity is an alteration in osmotic adjustment ability and in the sugar metabolism promotes an increased sucrose transport to the root at the expense of the growth rate and the transport of water toward the apex.