Memoria para optar al Título de Bioquímico / La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología neurodegenerativa progresiva caracterizada principalmente por agregados proteicos intracelulares (ovillos neurofibrilares) y extracelulares (placas seniles o amiloides). Estos últimos están formados por un péptido de 39 a 43 aminoácidos, conocido como péptido ß amiloide (Aß), el que se genera por proteólisis de la Proteína Precursora del Amiloide (APP). Existen dos formas principales del péptido Aß, una de 40 aminoácidos presente en personas sanas, y otra de 42 aminoácidos, constituyente principal de las placas observadas en pacientes de EA. Estas placas se forman a partir de la agregación de monómeros (M) que forman oligómeros solubles (O), los que formarían posteriormente protofibrillas y finalmente las fibras insolubles. La falta de correlación entre el grado de demencia y la cantidad de placas ha sugerido que los oligómeros solubles podrían ser los responsables de los síntomas iniciales. Si bien no están claros los blancos específicos del péptido Aß, uno de los principales candidatos son las sinapsis excitatorias que responden a glutamato. Estas sinapsis poseen una especialización de membrana conocida como densidad postsináptica (DPS), estructura que contiene a los receptores para neurotransmisores y proteínas asociadas a la regulación de la función sináptica, agrupadas por proteínas de andamio. Dentro de los receptores para glutamato, el R-NMDA es de gran importancia en procesos de memoria y aprendizaje, y su actividad puede ser modulada por el receptor para neurotrofinas p75NTR. Este receptor también está contenido en la DPS, y participa tanto en sobrevida como en apoptosis neuronal. Además, posee la capacidad de unirse a ligandos estructuralmente no relacionados, entre los que se encuentra el péptido Aß, postulándose como potencial blanco molecular del péptido. Nuestra hipótesis es que El péptido Aß en concentraciones nanomolares es capaz de inhibir la actividad del R-NMDA en la DPS por interacción con el receptor p75NTR. Para este trabajo, se obtuvieron DPS de corteza de rata adulta, las cuales fueron microinyectadas en ovocitos de Xenopus laevis. Estos ovocitos son sometidos a estudios de fijación de potencial con 2 electrodos (voltage clamp), y se midieron las respuestas obtenidas con el agonista NMDA en presencia de distintas concentraciones del péptido Aß1-40(M) y Aß1-42(M) y (O). En el caso del péptido Aß1-42(M), se observa una inhibición a todas las concentraciones utilizadas, sin ser dependiente de la dosis. Por otro lado, los péptidos Aß1-40(M) y Aß1-42(O) poseen efectos duales sobre las corrientes de NMDA: a bajas concentraciones producen un efecto inhibitorio y a altas concentraciones un efecto potenciador. En el caso del péptido Aß1-40(M), la inhibición se logra usando una concentración de 50 nM, mientras que en el caso del Aß1-42(O) se logra con una concentración de 5 nM. En ambos casos la potenciación ocurre al usar una concentración de 1 uM. Adicionalmente, el efecto Aß1-42(O) está mediado por el receptor p75NTR, ya que el uso de un anticuerpo que produce pérdida de función del receptor es capaz de revertir tanto el efecto inhibidor como potenciador del péptido. Estos datos permiten confirmar que existe participación del receptor p75NTR en los efectos sinápticos causados por el péptido, especialmente sobre la actividad del RNMDA, apuntando al rol fisiológico del péptido y su relación con la patología de la EA. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative progressive pathology characterized mainly by protein intracellular (neurofibrillary tangles) and extracellular (Amyloid plaques) aggregates. The latter are formed by 39-43 aminoacids peptide, known as amyloid ß(Aß), generated by proteolysis of Amyloid Precursor Protein (APP). There are two principal forms, one of 40 aminoacids, present in healthy people, and other of 42 aminoacids, main constituent of plaques seen in AD patients. These plaques are formed by aggregation of monomers (M), which form oligomers (O), then protofibrils and finally insoluble fiber. The lack of correlation between grade of dementia and number of plaques has suggested that soluble oligomers could be the responsible of initial symptoms. Although there is no clarity about specific targets of Aß peptide, one of the most named are excitatory synapses activated by glutamate. These synapses have a membrane specialization known as postsynaptic density (PSD), structure that contains the neurotransmitter receptors and proteins associated with regulation of synaptic function, grouped by scaffolding proteins. Between glutamate receptors, NMDA-R has great importance in memory and learning process, and his activity can be modulated by the neurotrophin receptor p75NTR. This receptor is also present in PSD and participates in both survival and neuronal apoptosis. In addition, it has the ability to bind ligands structurally unrelated, including Aß peptide, postulating the p75NTR as a potential molecular target of the peptide. Our hypothesis is that Aß peptide in nanomolar concentration is able to inhibit R-NMDA activity in PSD by interacting with p75NTR. For this work, we obtained PSD from adult rat cortex, which were microinjected into Xenopus laevis oocytes. These oocytes were subjected to 2-electrodes voltage clamp, and responses to agonist NMDA were acquired in presence of different concentrations of Aß1-40(M) and Aß1-42(M) and (O). In the case of Aß1-42(M), inhibition was non dose-dependent. On the other hand, Aß1-40(M) and Aß1-42(O) have dual effect on NMDA-R currents: at low concentrations the peptides have an inhibitory effect and at high concentrations a potentiation effect. In the case of Aß1-40(M), inhibition is obtained using a concentration of 50 nM, whereas for the Aß1-42(O) is obtained with a concentration of 5 nM. In both cases, potentiation occurs when a concentration of 1 uM is used. Additionally, the effect of Aß1-42(O) is p75NTR-mediated, because the use of loss-of-function antibody reversed both inhibition and potentiation effect. These data allow us to confirm that there is participation of p75NTR in synaptic effects caused by Aß peptide, specially on NMDA-R activity, pointing to the physiological function of the peptide and its relationship with AD pathology.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas em áreas endêmicas do México, America central e do Sul. A quimioterapia disponível atualmente limita-se a dois compostos: Nifurtimox e o Benzonidazol. Ambos os fármacos reduzem os sintomas da doença e a mortalidade das pessoas infectadas, quando utilizadas na fase aguda, mas sua eficácia na fase crônica é controversa. Além do mais apresentam vários efeitos colaterais. O T. cruzi é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fonte de energia e carbono. O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistência do parasita ao estresse térmico, oxidativo e metabólico como também a importância do aminoácido GABA no metabolismo do T. cruzi, visto que este também é transportado pelo parasita. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a interferência de fármacos, que atuam via receptores ou transportadores de GABA e glutamato, no ciclo de vida do T. cruzi. Os fármacos selecionados foram: Vigabatrina, Pregabalina, MK-801, MTEP e Memantina. Os resultados demonstram que apenas Memantina apresentou um melhor efeito tripanocida. Inibiu a proliferação de formas epimastigotas, interferiu na metaciclogênese, como também afetou o metabolismo energético do parasita com a diminuição dos níveis de ATP, além de desencadear mecanismos que levam a apoptose das formas epimastigotas. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, mais especificamente no estágio amastigota. Interessantemente as fases do ciclo do parasita que são mais afetadas, são as fases que requerem mais energia: estágios replicativos (amastigota e epimastigota), como também os processos de diferenciação e invasão celular. Apesar de apresentar valores de IC50 que podem ser considerados altos em relação aos valores descritos para formas epimastigotas tratadas com Benzonidazol, esses resultados mostram perspectivas promissoras, visto que o Memantina poderá ser utilizado como composto líder para o desenho de derivados com atividade tripanocida otimizada. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi and affects approximately 10 million people in endemic areas of Mexico, Central America and South America, with about 25 million people living in areas at risk of infection. The currently available chemotherapy is limited to two compounds, which are: Nifurtimox and Benznidazole. Both drugs reduce symptoms of the disease and mortality of infected people when used in the acute phase, but its efficacy in chronic phase (phase in which the majority of cases are diagnosed) is still controversial. Moreover these drugs have several side effects. T. cruzi is able to utilize carbohydrate and amino acids as carbon and energy source. Our group has studied the involvement of glutamate in parasite resistance to thermal, oxidative and metabolic stress, as well as the importance of the amino acid GABA metabolism in T. cruzi. The aim of this study was to evaluate the interference of drugs, that act in GABA and glutamate transporters or receptors, in the life cycle of T. cruzi. The drugs selected were: vigabatrin, pregabalin, MK-801, memantine and MTEP. The results showed that only memantine has a better trypanocidal effect. Memantine inhibited the proliferation of epimastigotes, interfered in metacyclogenesis, and affected the energy metabolism of the parasite with decreased levels of ATP, and trigger mechanisms that lead to apoptosis of epimastigotes. Moreover interferes with intracellular cycle of the parasite, specifically in amastigote stage. Interesting that stages of the parasite that require more energy are more affected: replicative stages (epimastigote and amastigote) as well as the processes of differentiation and cell invasion. IC50 value is more than that described to epimastigotes treateds with Benznidazole, but Memantine could be used as leader compound for the design of drugs with optimized trypanocidal activity.

O glioblastoma (GBM) é o mais comum dos tumores primários malignos que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), sendo um dos cânceres mais letais. A ressecção cirúrgica desse tumor é o tratamento de intervenção inicial mais utilizado nos pacientes. Embora a radioterapia e a quimioterapia aumente a sobrevida, a maioria dos pacientes chega ao óbito em até um ano após o diagnóstico. Além disso, os GBM estão entre os tumores mais resistentes à radiação e à quimioterapia. Dessa forma, torna-se imprescindível a busca de novas estratégias terapêuticas que visem à melhora da qualidade de vida dos pacientes e ao aumento do tempo de sobrevida. O glutamato (L-Glu) é o aminoácido encontrado em maior concentração no SNC e ele exerce seus papéis fisiológicos e patológicos através da ativação de receptores de membrana metabotrópicos e ionotrópicos. Diversos estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que células de GBM liberam altos níveis de L-Glu para o meio extracelular, o que promove a sua proliferação e migração, contribuindo para a malignidade deste tipo de tumor. De fato, é provável que a ligação desse aminoácido aos receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR) relacione-se com a agressividade dos GBM, visto que eles são amplamente expressos nestas células. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o papel dos mGluR sobre a agressividade de GBM, buscando uma assinatura gênica que tenha valor como potencial biomarcador prognóstico e preditivo de tratamento complementar adjuvante. Através da uma meta-análise de duas coortes de amostras de GBM humanos foi possível identificar uma assinatura gênica de mGluR com valor prognóstico, na qual biópsias com alta expressão gênica de mGluR3 e baixa de mGluR4 e mGluR6 predizem um desfecho antecipado para os pacientes. O potencial desses receptores sobre a malignidade desses tumores foi avaliado por experimentos in vitro utilizando o tratamento de linhagens de GBM com ligantes de mGluR. O bloqueio farmacológico de mGluR do grupo II pelo antagonista LY341495 e a ativação farmacológica de mGluR III por L-AP4 diminuíram a porcentagem de células de linhagem de GBM em 25-28 %. A combinação desses tratamentos não apresentou efeito sinérgico. O potencial da assinatura gênica também foi avaliado in vivo utilizando ratos implantados ortotopicamente com células da linhagem C6 e tratados intracisternalmente com os ligantes de mGluR e intraperitonealmente com quimioterápico padrão, a temozolamida. Os resultados obtidos nos experimentos in vivo, apesar de preliminares, em relação ao tratamento com os ligantes de mGluR, são muito promissores, permitindo várias perspectivas em relação a adaptações de protocolo e a realização de experimentos complementares. Este estudo demonstrou que a avaliação da expressão gênica de mGluR3, 4 e 6 em biópsias de GBM humanos possui um grande potencial prognóstico. A diminuição do número de células da linhagem C6 após o tratamento in vitro com ligantes de mGluR (LY341495 e L-AP4) está de acordo com o comportamento de agressividade previsto nos estudos in silico. Embora mais experimentos in vitro e in vivo sejam necessários para melhor avaliação do potencial dessa assinatura gênica de mGluR, os resultados obtidos indicam que a avaliação da expressão dos oito subtipos de mGluR em biópsias de GBM pode ser considerada em âmbito clínico para guiar futuras intervenções quimioterápicas. / Glioblastoma (GBM) is the most common malignant primary tumor of Central Nervous System (CNS) and one of the most lethal cancers. Surgical resection of this tumor is the most commonly initial intervention treatment used in patients. Although radiotherapy and chemotherapy increase survival, it is expected that the majority of patients will die within a year after diagnosis. In addition, GBM are among the most radiation- and chemotherapy-resistant tumors. Thus, it is imperative to search for new therapeutic strategies that aim to improve patients' quality of life and to increase survival time. Glutamate (L-Glu) is the amino acid found in higher concentration in CNS and it exerts its physiological and pathological roles through the activation of metabotropic and ionotropic membrane receptors. Several studies have demonstrated in vitro and in vivo that GBM cells release high levels of L-Glu into extracellular medium. This event was shown to promote GBM proliferation and migration, contributing to the malignancy of this type of tumor. Indeed, it is likely that the binding of that amino acid to metabotropic glutamate receptors (mGluR) relates to GBM aggressiveness, since they are widely expressed in these cells. Thus, the objective of this work was to investigate the role of mGluR on GBM aggressiveness, searching for a gene signature that has potential value as biomarker to predict the prognosis and adjuvant complementary treatment. Through the meta-analysis of two GBM human samples cohorts, it was possible to identify an mGluR gene signature with prognostic value, in which biopsies with high mGluR3 and low mGluR4 and mGluR6 gene expression predict an early outcome for patients. The potential of these receptors on the malignancy of these tumors was assessed by in vitro experiments through the treatment of GBM lineages with mGluR ligands. Pharmacological blockade of group II mGluR by LY341495 and pharmacological activation of group III mGluR by L-AP4 decreased the amount of C6 cells in 25-28 %. The combination of these treatments had no synergistic effect. The potential of the gene signature was also assessed in vitro using GBM-implanted rats treated intracisternally with mGluR ligands and intraperitoneally with standard chemotherapy, temozolomide. The results obtained in in vivo experiments, although very preliminary in relation to treatment with the mGluR ligands, are very promising, allowing several perspectives regarding protocol adaptations and the accomplishment of complementary experiments. This study demonstrated that evaluation of mRNA levels of mGluR3, 4, and 6 in human GBM biopsies has a great prognostic potential. The decrease in number of C6 cells after in vitro treatment with mGluR ligands (LY341495 and L-AP4) is in accordance with the predicted aggressiveness behavior proposed in silico. Although further in vitro and in vivo experiments are required for better evaluation of mGluR gene signature potential, these results indicate that evaluation of the eight mGluR subtypes in GBM biopsies may be considered in clinical scope to guide future chemotherapeutic interventions.

O glioblastoma (GBM) é o mais comum dos tumores primários malignos que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), sendo um dos cânceres mais letais. A ressecção cirúrgica desse tumor é o tratamento de intervenção inicial mais utilizado nos pacientes. Embora a radioterapia e a quimioterapia aumente a sobrevida, a maioria dos pacientes chega ao óbito em até um ano após o diagnóstico. Além disso, os GBM estão entre os tumores mais resistentes à radiação e à quimioterapia. Dessa forma, torna-se imprescindível a busca de novas estratégias terapêuticas que visem à melhora da qualidade de vida dos pacientes e ao aumento do tempo de sobrevida. O glutamato (L-Glu) é o aminoácido encontrado em maior concentração no SNC e ele exerce seus papéis fisiológicos e patológicos através da ativação de receptores de membrana metabotrópicos e ionotrópicos. Diversos estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que células de GBM liberam altos níveis de L-Glu para o meio extracelular, o que promove a sua proliferação e migração, contribuindo para a malignidade deste tipo de tumor. De fato, é provável que a ligação desse aminoácido aos receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR) relacione-se com a agressividade dos GBM, visto que eles são amplamente expressos nestas células. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o papel dos mGluR sobre a agressividade de GBM, buscando uma assinatura gênica que tenha valor como potencial biomarcador prognóstico e preditivo de tratamento complementar adjuvante. Através da uma meta-análise de duas coortes de amostras de GBM humanos foi possível identificar uma assinatura gênica de mGluR com valor prognóstico, na qual biópsias com alta expressão gênica de mGluR3 e baixa de mGluR4 e mGluR6 predizem um desfecho antecipado para os pacientes. O potencial desses receptores sobre a malignidade desses tumores foi avaliado por experimentos in vitro utilizando o tratamento de linhagens de GBM com ligantes de mGluR. O bloqueio farmacológico de mGluR do grupo II pelo antagonista LY341495 e a ativação farmacológica de mGluR III por L-AP4 diminuíram a porcentagem de células de linhagem de GBM em 25-28 %. A combinação desses tratamentos não apresentou efeito sinérgico. O potencial da assinatura gênica também foi avaliado in vivo utilizando ratos implantados ortotopicamente com células da linhagem C6 e tratados intracisternalmente com os ligantes de mGluR e intraperitonealmente com quimioterápico padrão, a temozolamida. Os resultados obtidos nos experimentos in vivo, apesar de preliminares, em relação ao tratamento com os ligantes de mGluR, são muito promissores, permitindo várias perspectivas em relação a adaptações de protocolo e a realização de experimentos complementares. Este estudo demonstrou que a avaliação da expressão gênica de mGluR3, 4 e 6 em biópsias de GBM humanos possui um grande potencial prognóstico. A diminuição do número de células da linhagem C6 após o tratamento in vitro com ligantes de mGluR (LY341495 e L-AP4) está de acordo com o comportamento de agressividade previsto nos estudos in silico. Embora mais experimentos in vitro e in vivo sejam necessários para melhor avaliação do potencial dessa assinatura gênica de mGluR, os resultados obtidos indicam que a avaliação da expressão dos oito subtipos de mGluR em biópsias de GBM pode ser considerada em âmbito clínico para guiar futuras intervenções quimioterápicas. / Glioblastoma (GBM) is the most common malignant primary tumor of Central Nervous System (CNS) and one of the most lethal cancers. Surgical resection of this tumor is the most commonly initial intervention treatment used in patients. Although radiotherapy and chemotherapy increase survival, it is expected that the majority of patients will die within a year after diagnosis. In addition, GBM are among the most radiation- and chemotherapy-resistant tumors. Thus, it is imperative to search for new therapeutic strategies that aim to improve patients' quality of life and to increase survival time. Glutamate (L-Glu) is the amino acid found in higher concentration in CNS and it exerts its physiological and pathological roles through the activation of metabotropic and ionotropic membrane receptors. Several studies have demonstrated in vitro and in vivo that GBM cells release high levels of L-Glu into extracellular medium. This event was shown to promote GBM proliferation and migration, contributing to the malignancy of this type of tumor. Indeed, it is likely that the binding of that amino acid to metabotropic glutamate receptors (mGluR) relates to GBM aggressiveness, since they are widely expressed in these cells. Thus, the objective of this work was to investigate the role of mGluR on GBM aggressiveness, searching for a gene signature that has potential value as biomarker to predict the prognosis and adjuvant complementary treatment. Through the meta-analysis of two GBM human samples cohorts, it was possible to identify an mGluR gene signature with prognostic value, in which biopsies with high mGluR3 and low mGluR4 and mGluR6 gene expression predict an early outcome for patients. The potential of these receptors on the malignancy of these tumors was assessed by in vitro experiments through the treatment of GBM lineages with mGluR ligands. Pharmacological blockade of group II mGluR by LY341495 and pharmacological activation of group III mGluR by L-AP4 decreased the amount of C6 cells in 25-28 %. The combination of these treatments had no synergistic effect. The potential of the gene signature was also assessed in vitro using GBM-implanted rats treated intracisternally with mGluR ligands and intraperitoneally with standard chemotherapy, temozolomide. The results obtained in in vivo experiments, although very preliminary in relation to treatment with the mGluR ligands, are very promising, allowing several perspectives regarding protocol adaptations and the accomplishment of complementary experiments. This study demonstrated that evaluation of mRNA levels of mGluR3, 4, and 6 in human GBM biopsies has a great prognostic potential. The decrease in number of C6 cells after in vitro treatment with mGluR ligands (LY341495 and L-AP4) is in accordance with the predicted aggressiveness behavior proposed in silico. Although further in vitro and in vivo experiments are required for better evaluation of mGluR gene signature potential, these results indicate that evaluation of the eight mGluR subtypes in GBM biopsies may be considered in clinical scope to guide future chemotherapeutic interventions.

O glioblastoma (GBM) é o mais comum dos tumores primários malignos que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), sendo um dos cânceres mais letais. A ressecção cirúrgica desse tumor é o tratamento de intervenção inicial mais utilizado nos pacientes. Embora a radioterapia e a quimioterapia aumente a sobrevida, a maioria dos pacientes chega ao óbito em até um ano após o diagnóstico. Além disso, os GBM estão entre os tumores mais resistentes à radiação e à quimioterapia. Dessa forma, torna-se imprescindível a busca de novas estratégias terapêuticas que visem à melhora da qualidade de vida dos pacientes e ao aumento do tempo de sobrevida. O glutamato (L-Glu) é o aminoácido encontrado em maior concentração no SNC e ele exerce seus papéis fisiológicos e patológicos através da ativação de receptores de membrana metabotrópicos e ionotrópicos. Diversos estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que células de GBM liberam altos níveis de L-Glu para o meio extracelular, o que promove a sua proliferação e migração, contribuindo para a malignidade deste tipo de tumor. De fato, é provável que a ligação desse aminoácido aos receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR) relacione-se com a agressividade dos GBM, visto que eles são amplamente expressos nestas células. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o papel dos mGluR sobre a agressividade de GBM, buscando uma assinatura gênica que tenha valor como potencial biomarcador prognóstico e preditivo de tratamento complementar adjuvante. Através da uma meta-análise de duas coortes de amostras de GBM humanos foi possível identificar uma assinatura gênica de mGluR com valor prognóstico, na qual biópsias com alta expressão gênica de mGluR3 e baixa de mGluR4 e mGluR6 predizem um desfecho antecipado para os pacientes. O potencial desses receptores sobre a malignidade desses tumores foi avaliado por experimentos in vitro utilizando o tratamento de linhagens de GBM com ligantes de mGluR. O bloqueio farmacológico de mGluR do grupo II pelo antagonista LY341495 e a ativação farmacológica de mGluR III por L-AP4 diminuíram a porcentagem de células de linhagem de GBM em 25-28 %. A combinação desses tratamentos não apresentou efeito sinérgico. O potencial da assinatura gênica também foi avaliado in vivo utilizando ratos implantados ortotopicamente com células da linhagem C6 e tratados intracisternalmente com os ligantes de mGluR e intraperitonealmente com quimioterápico padrão, a temozolamida. Os resultados obtidos nos experimentos in vivo, apesar de preliminares, em relação ao tratamento com os ligantes de mGluR, são muito promissores, permitindo várias perspectivas em relação a adaptações de protocolo e a realização de experimentos complementares. Este estudo demonstrou que a avaliação da expressão gênica de mGluR3, 4 e 6 em biópsias de GBM humanos possui um grande potencial prognóstico. A diminuição do número de células da linhagem C6 após o tratamento in vitro com ligantes de mGluR (LY341495 e L-AP4) está de acordo com o comportamento de agressividade previsto nos estudos in silico. Embora mais experimentos in vitro e in vivo sejam necessários para melhor avaliação do potencial dessa assinatura gênica de mGluR, os resultados obtidos indicam que a avaliação da expressão dos oito subtipos de mGluR em biópsias de GBM pode ser considerada em âmbito clínico para guiar futuras intervenções quimioterápicas. / Glioblastoma (GBM) is the most common malignant primary tumor of Central Nervous System (CNS) and one of the most lethal cancers. Surgical resection of this tumor is the most commonly initial intervention treatment used in patients. Although radiotherapy and chemotherapy increase survival, it is expected that the majority of patients will die within a year after diagnosis. In addition, GBM are among the most radiation- and chemotherapy-resistant tumors. Thus, it is imperative to search for new therapeutic strategies that aim to improve patients' quality of life and to increase survival time. Glutamate (L-Glu) is the amino acid found in higher concentration in CNS and it exerts its physiological and pathological roles through the activation of metabotropic and ionotropic membrane receptors. Several studies have demonstrated in vitro and in vivo that GBM cells release high levels of L-Glu into extracellular medium. This event was shown to promote GBM proliferation and migration, contributing to the malignancy of this type of tumor. Indeed, it is likely that the binding of that amino acid to metabotropic glutamate receptors (mGluR) relates to GBM aggressiveness, since they are widely expressed in these cells. Thus, the objective of this work was to investigate the role of mGluR on GBM aggressiveness, searching for a gene signature that has potential value as biomarker to predict the prognosis and adjuvant complementary treatment. Through the meta-analysis of two GBM human samples cohorts, it was possible to identify an mGluR gene signature with prognostic value, in which biopsies with high mGluR3 and low mGluR4 and mGluR6 gene expression predict an early outcome for patients. The potential of these receptors on the malignancy of these tumors was assessed by in vitro experiments through the treatment of GBM lineages with mGluR ligands. Pharmacological blockade of group II mGluR by LY341495 and pharmacological activation of group III mGluR by L-AP4 decreased the amount of C6 cells in 25-28 %. The combination of these treatments had no synergistic effect. The potential of the gene signature was also assessed in vitro using GBM-implanted rats treated intracisternally with mGluR ligands and intraperitoneally with standard chemotherapy, temozolomide. The results obtained in in vivo experiments, although very preliminary in relation to treatment with the mGluR ligands, are very promising, allowing several perspectives regarding protocol adaptations and the accomplishment of complementary experiments. This study demonstrated that evaluation of mRNA levels of mGluR3, 4, and 6 in human GBM biopsies has a great prognostic potential. The decrease in number of C6 cells after in vitro treatment with mGluR ligands (LY341495 and L-AP4) is in accordance with the predicted aggressiveness behavior proposed in silico. Although further in vitro and in vivo experiments are required for better evaluation of mGluR gene signature potential, these results indicate that evaluation of the eight mGluR subtypes in GBM biopsies may be considered in clinical scope to guide future chemotherapeutic interventions.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas em áreas endêmicas do México, America central e do Sul. A quimioterapia disponível atualmente limita-se a dois compostos: Nifurtimox e o Benzonidazol. Ambos os fármacos reduzem os sintomas da doença e a mortalidade das pessoas infectadas, quando utilizadas na fase aguda, mas sua eficácia na fase crônica é controversa. Além do mais apresentam vários efeitos colaterais. O T. cruzi é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fonte de energia e carbono. O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistência do parasita ao estresse térmico, oxidativo e metabólico como também a importância do aminoácido GABA no metabolismo do T. cruzi, visto que este também é transportado pelo parasita. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a interferência de fármacos, que atuam via receptores ou transportadores de GABA e glutamato, no ciclo de vida do T. cruzi. Os fármacos selecionados foram: Vigabatrina, Pregabalina, MK-801, MTEP e Memantina. Os resultados demonstram que apenas Memantina apresentou um melhor efeito tripanocida. Inibiu a proliferação de formas epimastigotas, interferiu na metaciclogênese, como também afetou o metabolismo energético do parasita com a diminuição dos níveis de ATP, além de desencadear mecanismos que levam a apoptose das formas epimastigotas. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, mais especificamente no estágio amastigota. Interessantemente as fases do ciclo do parasita que são mais afetadas, são as fases que requerem mais energia: estágios replicativos (amastigota e epimastigota), como também os processos de diferenciação e invasão celular. Apesar de apresentar valores de IC50 que podem ser considerados altos em relação aos valores descritos para formas epimastigotas tratadas com Benzonidazol, esses resultados mostram perspectivas promissoras, visto que o Memantina poderá ser utilizado como composto líder para o desenho de derivados com atividade tripanocida otimizada. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi and affects approximately 10 million people in endemic areas of Mexico, Central America and South America, with about 25 million people living in areas at risk of infection. The currently available chemotherapy is limited to two compounds, which are: Nifurtimox and Benznidazole. Both drugs reduce symptoms of the disease and mortality of infected people when used in the acute phase, but its efficacy in chronic phase (phase in which the majority of cases are diagnosed) is still controversial. Moreover these drugs have several side effects. T. cruzi is able to utilize carbohydrate and amino acids as carbon and energy source. Our group has studied the involvement of glutamate in parasite resistance to thermal, oxidative and metabolic stress, as well as the importance of the amino acid GABA metabolism in T. cruzi. The aim of this study was to evaluate the interference of drugs, that act in GABA and glutamate transporters or receptors, in the life cycle of T. cruzi. The drugs selected were: vigabatrin, pregabalin, MK-801, memantine and MTEP. The results showed that only memantine has a better trypanocidal effect. Memantine inhibited the proliferation of epimastigotes, interfered in metacyclogenesis, and affected the energy metabolism of the parasite with decreased levels of ATP, and trigger mechanisms that lead to apoptosis of epimastigotes. Moreover interferes with intracellular cycle of the parasite, specifically in amastigote stage. Interesting that stages of the parasite that require more energy are more affected: replicative stages (epimastigote and amastigote) as well as the processes of differentiation and cell invasion. IC50 value is more than that described to epimastigotes treateds with Benznidazole, but Memantine could be used as leader compound for the design of drugs with optimized trypanocidal activity.

A ativação excessiva dos receptores NMDA tem sido descrita no disparo da morte neuronal que ocorre em doenças, como o glaucoma. É possível que a combinação de subunidades (NR2A-D) possa ativar vias de sinalização intracelulares que resultam na morte ou sobrevivência. Nosso objetivo foi investigar o envolvimento de subunidades NR2 e Rac1, membro da família Rho GTPase, na morte de neurônios da retina. A morte induzida por glutamato in vitro foi reduzida após a inibição de Rac1 e bloqueio de NR2B, mas não das subunidades NR2C/D. Resultados semelhantes foram obtidos in vivo após injeção intravítrea NMDA, e a detecção de Rac1 ativo, principalmente, nos processos de glia de Müller foi inibida pelo bloqueio NR2B. Além disso, a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; após a injeção de NMDA foi reduzida pelo bloqueio de NR2B e Rac1. Assim, nossos resultados sugerem que a excitotoxicidade via receptores NR2B/NMDA ativa Rac1 em células da glia de Müller, que por sua vez controla a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 possível responsável pela morte de células ganglionares da retina. / Overactivation of NMDA receptors has been described to trigger neuronal death that occurs in diseases such as glaucoma. It is possible that the combination of subunits (NR2A-D) activate intracellular signaling pathways that result in death or survival. Our aim was to investigate the involvement of NR2 subunits and Rac1, a member of Rho GTPase family, in retinal neuronal death. Glutamate-induced neuronal death in vitro was reduced after Rac1 inhibition and by NR2B blocking, but not NR2C/D subunits. Similar results were obtained in vivo after NMDA intravitreous injection, although active Rac1 was mainly detected in Müller glia processes, and it was inhibited by NR2B blockade. In addition, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 level after NMDA injection were reduced by NR2B blocking and Rac1. Thus, our results suggest that excitotoxicity via NR2B/NMDA receptors activate Rac1 in Müller glia cells, which in turn controls the TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 production that triggers retinal ganglion cell death.

As células T exercem papel crucial nas respostas imunes adaptativas e em doenças autoimunes, como a esclerose múltipla. O glutamato, neurotransmissor mais abundante no SNC, age por meio de duas famílias de receptores: metabotrópico e ionotrópico. As células T são alvo do glutamato durante a ativação e apresentação de antígenos, pois está presente nas sinapses imunológicas, porém, pouco se sabe a respeito de seu papel na função das células T. Nós estudamos o papel do NMDAR nas respostas mediadas por células T. In vitro, o uso do antagonista MK801 reduziu a linfoproliferação e a síntese de IFN-&#947; e IL-17A, bem com o NMDA reduziu a proliferação e produção de IFN-&#947; e IL-17A. In vivo, o MK801 reduziu a gravidade da EAE, resultado da menor infiltração de linfócitos Th1 e Th17 no SNC. Além disso, o MK801 reduziu a expressão de Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 e Ifna2 no SNC. Em suma, esses dados confirmam que o NMDAR exerce papel nas funções mediadas por células T, indicando que as células T são alvos do excesso do glutamato via NMDAR em doenças neuroinflamatórias. / T cells play a crucial role in adaptive immune responses and autoimmune diseases, such as multiple sclerosis. Glutamate is the most abundant neurotransmitter in the CNS, and it acts through two receptor families: metabotropic and ionotropic. T cells are target of glutamate during activation and antigen presentation, because glutamate is also present in the immunological synapses, however, little is known about its role on T cell functions. We investigated the role of NMDAR in immune-mediated T cell responses. In vitro, the use of the antagonist MK801 reduced T cell proliferation and cytokine production (IFN-&#947; e IL-17A), as well as NMDA reduced lymphocyte proliferation and IFN-&#947; e IL-17A production, in a dose dependent manner. In vivo, MK801 diminished severity of EAE, result of the minor Th1 and Th17 infiltration in the CNS. In addition, MK801 reduced Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 and Ifna2 expression in the CNS. In short, our data confirm that the NMDAR play a role in T cell-mediated functions, indicating that T cells are target of glutamate excess via NMDAR in neuroinflammatory diseases.

Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluRs) estão envolvidos nos processos de plasticidade, neurodegeneração e neuroproteção. Avaliamos a expressão de mGluRs no sistema visual de ratos e pintos em diferentes tempos após enucleação ocular. Os animais foram avaliados pelo método de imuno-histoquímica, immunoblotting e RT-PCR, para detecção dos receptores mGluR1,2/3,5 e 7. Foi observado aumento da imunorreatividade (IR) de mGluR1, 5 e 7 no colículo superior, porém não foi observada diferença no núcleo geniculado lateral. Houve aumento na expressão protéica para mGluR1, 5 e 7 e aumento da expressão gênica para mGluR1,5 e 7; por outro lado, ocorreu uma diminuição de mGluR3. No TeO, foi observado aumento da IR para mGluR1 e 5 e diminuição para mGluR2/3. As análises de immunoblotting confirmaram o aumento observado de mGluR1 e diminuição de mGluR2/3. Os resultados indicam uma modulação diferencial na expressão gênica e protéica dos mGluRs, sugerindo a participação desses receptores em processos plásticos decorrentes de lesões no sistema visual adulto. / The metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are involved in neuronal plasticity and neuroprotection. We analyzed the expression of mGluRs in the visual system of rats and chicks in several periods after ocular enucleation. The localization and expression of mGluR1, 5, 2/3 and 7 receptors were evaluated by standard immunoperoxidase, immunoblotting and real-time PCR protocols. The immunorreativity, protein and gene expression of mGluR1, 5 and 7 receptors in the superior colliculus showed an increase, whereas no changes were seen in the lateral geniculate nucleus. For mGluR3, gene expression was decreased. In the TeO, mGluR1 and 5 increased for all survival periods analyzed. Immunoblotting analyses confirmed the increases for mGluR1 and 5, decreases for mGluR2/3. These results indicate that the expression of mGluRs is regulated by the glutamatergic retinal input, and add data on a possible role of these receptors in neuroplasticity in adult animals.

Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluRs) estão envolvidos nos processos de plasticidade, neurodegeneração e neuroproteção. Avaliamos a expressão de mGluRs no sistema visual de ratos e pintos em diferentes tempos após enucleação ocular. Os animais foram avaliados pelo método de imuno-histoquímica, immunoblotting e RT-PCR, para detecção dos receptores mGluR1,2/3,5 e 7. Foi observado aumento da imunorreatividade (IR) de mGluR1, 5 e 7 no colículo superior, porém não foi observada diferença no núcleo geniculado lateral. Houve aumento na expressão protéica para mGluR1, 5 e 7 e aumento da expressão gênica para mGluR1,5 e 7; por outro lado, ocorreu uma diminuição de mGluR3. No TeO, foi observado aumento da IR para mGluR1 e 5 e diminuição para mGluR2/3. As análises de immunoblotting confirmaram o aumento observado de mGluR1 e diminuição de mGluR2/3. Os resultados indicam uma modulação diferencial na expressão gênica e protéica dos mGluRs, sugerindo a participação desses receptores em processos plásticos decorrentes de lesões no sistema visual adulto. / The metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are involved in neuronal plasticity and neuroprotection. We analyzed the expression of mGluRs in the visual system of rats and chicks in several periods after ocular enucleation. The localization and expression of mGluR1, 5, 2/3 and 7 receptors were evaluated by standard immunoperoxidase, immunoblotting and real-time PCR protocols. The immunorreativity, protein and gene expression of mGluR1, 5 and 7 receptors in the superior colliculus showed an increase, whereas no changes were seen in the lateral geniculate nucleus. For mGluR3, gene expression was decreased. In the TeO, mGluR1 and 5 increased for all survival periods analyzed. Immunoblotting analyses confirmed the increases for mGluR1 and 5, decreases for mGluR2/3. These results indicate that the expression of mGluRs is regulated by the glutamatergic retinal input, and add data on a possible role of these receptors in neuroplasticity in adult animals.