A ativação excessiva dos receptores NMDA tem sido descrita no disparo da morte neuronal que ocorre em doenças, como o glaucoma. É possível que a combinação de subunidades (NR2A-D) possa ativar vias de sinalização intracelulares que resultam na morte ou sobrevivência. Nosso objetivo foi investigar o envolvimento de subunidades NR2 e Rac1, membro da família Rho GTPase, na morte de neurônios da retina. A morte induzida por glutamato in vitro foi reduzida após a inibição de Rac1 e bloqueio de NR2B, mas não das subunidades NR2C/D. Resultados semelhantes foram obtidos in vivo após injeção intravítrea NMDA, e a detecção de Rac1 ativo, principalmente, nos processos de glia de Müller foi inibida pelo bloqueio NR2B. Além disso, a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; após a injeção de NMDA foi reduzida pelo bloqueio de NR2B e Rac1. Assim, nossos resultados sugerem que a excitotoxicidade via receptores NR2B/NMDA ativa Rac1 em células da glia de Müller, que por sua vez controla a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 possível responsável pela morte de células ganglionares da retina. / Overactivation of NMDA receptors has been described to trigger neuronal death that occurs in diseases such as glaucoma. It is possible that the combination of subunits (NR2A-D) activate intracellular signaling pathways that result in death or survival. Our aim was to investigate the involvement of NR2 subunits and Rac1, a member of Rho GTPase family, in retinal neuronal death. Glutamate-induced neuronal death in vitro was reduced after Rac1 inhibition and by NR2B blocking, but not NR2C/D subunits. Similar results were obtained in vivo after NMDA intravitreous injection, although active Rac1 was mainly detected in Müller glia processes, and it was inhibited by NR2B blockade. In addition, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 level after NMDA injection were reduced by NR2B blocking and Rac1. Thus, our results suggest that excitotoxicity via NR2B/NMDA receptors activate Rac1 in Müller glia cells, which in turn controls the TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 production that triggers retinal ganglion cell death.

Orientador: Fabio Papes / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T08:04:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nakahara_ThiagoSeike_M.pdf: 27685441 bytes, checksum: c755af1be54c3ba9b204bed05559dd88 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Sistema Olfativo é um Sistema Sensorial complexo, composto por diversos subsistemas cuja integração no cérebro resulta na interação entre os animais e seus respectivos ambientes de maneira adequada. Essa adequação pode significar respostas comportamentais e fisiológicas distintas para situações diversas a que esses animais tenham sido expostos. Esse Sistema exibe compartimentos especializados na detecção de estímulos de uma mesma natureza e nesse contexto, o Sistema Olfativo Principal é responsável pela detecção de odorantes voláteis em geral e o Sistema Olfativo Acessório é responsável pela detecção de feromônios. Apesar dessa divisão formal, estudos recentes questionam essa divisão e propõem sobreposição entre a função desses subsistemas. Nesse estudo investigamos a expressão de receptores OR sendo expressos no Órgão Vomerosasal em níveis comparáveis aos receptores V2R ("endógenos"). Desses receptores, isolamos o receptor Olfr692 que possui o nível de expressão mais alto entre os OR estudados ou relatados anteriormente na literatura. As células que expressam o receptor Olfr692 foram caracterizadas molecularmente e foram feitos estudos preliminares a fim de investigar a função do receptor Olfr692 frente a possíveis funções biológicas que fossem capazes de explicar a expressão robusta de um receptor de classe OR no Órgão Vomeronasal / Abstract: The Olfactory System is a complex Sensorial System, comprised of some subsystems whose integration in the brain results in the appropriated interaction between animals and their environment, that is, proper behavioral or physiological answers to diverse situations to which these animals are exposed. This System exhibits specialized features for detection of a given kind of stimuli. The Main Olfactory System detects volatile odorants in general while the Accessory Olfactory System detects pheromones. Apart from this formal distinction, recent studies have questioned this division and propose some overlap between them. In the present study, we have investigated the expression of OR receptors in the Vomeronasal Organ whose expression level is compared to V2R Receptors (endogenous). We have isolated from these genes the Olfr692, which has the higher levels among the VNO-OR here studied and those discussed in the literature. These cells have been molecularly characterized and preliminary functional studies were also performed, searching for the possible biological functions of this Receptor, which could explain its expression in the Vomeronasal Organ / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Fabio Papes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T21:10:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardozo_LeonardoMinete_M.pdf: 30220846 bytes, checksum: 6793ed2dd7e959cbc81a5c912cd1c987 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma propriedade fundamental do sistema nervoso em todas as espécies animais e a transformação dos estímulos sensoriais em atividade neural, levando a mudanças comportamentais e endócrinas. Dentre os sistemas sensoriais, o Sistema Olfatório destaca-se por sua complexidade molecular, capacidade de detecção de odores e modulação de comportamentos inatos. Entretanto, ainda muito pouco e conhecido sobre como este Sistema detecta, processa e interpreta as informações químicas que recebe do meio externo... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: A fundamental property of the nervous system in all animal species is the transformation of sensory stimulation into neural activity, leading to endocrine and behavioral changes. Among the sensory systems, the olfactory system stands out due to its molecular complexity, detection capacity and the modulation of innate behaviors. However, little is known about how this system detects, processes and interprets chemosignals from the environment... Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A ativação excessiva dos receptores NMDA tem sido descrita no disparo da morte neuronal que ocorre em doenças, como o glaucoma. É possível que a combinação de subunidades (NR2A-D) possa ativar vias de sinalização intracelulares que resultam na morte ou sobrevivência. Nosso objetivo foi investigar o envolvimento de subunidades NR2 e Rac1, membro da família Rho GTPase, na morte de neurônios da retina. A morte induzida por glutamato in vitro foi reduzida após a inibição de Rac1 e bloqueio de NR2B, mas não das subunidades NR2C/D. Resultados semelhantes foram obtidos in vivo após injeção intravítrea NMDA, e a detecção de Rac1 ativo, principalmente, nos processos de glia de Müller foi inibida pelo bloqueio NR2B. Além disso, a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; após a injeção de NMDA foi reduzida pelo bloqueio de NR2B e Rac1. Assim, nossos resultados sugerem que a excitotoxicidade via receptores NR2B/NMDA ativa Rac1 em células da glia de Müller, que por sua vez controla a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 possível responsável pela morte de células ganglionares da retina. / Overactivation of NMDA receptors has been described to trigger neuronal death that occurs in diseases such as glaucoma. It is possible that the combination of subunits (NR2A-D) activate intracellular signaling pathways that result in death or survival. Our aim was to investigate the involvement of NR2 subunits and Rac1, a member of Rho GTPase family, in retinal neuronal death. Glutamate-induced neuronal death in vitro was reduced after Rac1 inhibition and by NR2B blocking, but not NR2C/D subunits. Similar results were obtained in vivo after NMDA intravitreous injection, although active Rac1 was mainly detected in Müller glia processes, and it was inhibited by NR2B blockade. In addition, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 level after NMDA injection were reduced by NR2B blocking and Rac1. Thus, our results suggest that excitotoxicity via NR2B/NMDA receptors activate Rac1 in Müller glia cells, which in turn controls the TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 production that triggers retinal ganglion cell death.

O sistema olfatório de mamíferos é capaz de detectar milhares de substâncias químicas diferentes, mesmo em baixas concentrações. Um odorante disperso no ar pode se ligar a um receptor olfatório (OR) iniciando o processo de detecção. Os ORs são membros da super família de receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Apesar de a via de transdução de sinal de odorantes estar bem descrita, pouco se sabe sobre os seus moduladores. Em 2005, nosso laboratório identificou RIC-8B como um possível fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) que poderia amplificar a atividade da proteína G olfatória (Golf). No presente trabalho mostramos que RIC-8B é capaz de interagir com G&#947;13. Procurando os outros componentes desse complexo identificamos G&#946;1 como sendo a subunidade G&#946; mais expressa no epitélio olfatório. Além disso, RIC-8B, G&#945;olf, G&#946;1 e G&#947;13 encontram-se concentrados nos cílios dos neurônios olfatórios e se co-localizam nesse compartimento celular. Nossos experimentos de co-imunoprecipitação mostram que RIC-8B interage mais fortemente com G&#945;olf, na presença de GDP do que na presença de GTP, como esperado para uma GEF. Curiosamente quando G&#946;1 e G&#946;13 estão presentes, RIC-8B e G&#945;olf co-imunoprecipitam igual, independente do nucleotídeo de guanina utilizado. Apesar de, na presença de G&#946;1 e G&#947;13, não observarmos dissociação física de RIC-8B e G&#945;olf com a mudança do estado de ativação, o efeito de RIC-8B na produção de AMPc não é afetada. Também mostramos que a quantidade de G&#945;olf, G&#946;1 e G&#947;13 presentes na membrana celular aumenta quando estas são co-transfectadas com RIC-8B em células de mamíferos. Nossos resultados apontam para um papel duplo da RIC-8B. Primeiro, RIC-8B poderia funcionar como uma chaperona auxiliando na formação e transporte do complexo heterotrimérico, Golf, em neurônios olfatórios. Em segundo lugar, RIC-8B também atuaria como uma GEF sobre G&#945;olf, aumentando a produção de AMPc e portanto amplificando a via de transdução de sinal de odorantes. Por fim, acreditamos que um possível papel para G&#946;1 e G&#947;13 nesse complexo seria funcionar como um andaime molecular, aproximando RIC-8B de seu alvo, G&#945;olf, potencializando ainda mais a atividade de GEF. / The mammalian olfactory system detects small amounts of thousands of different chemical compounds. Odorant perception starts when an odorant in the air binds to an olfactory receptor (OR). ORs belong to the super family of G-protein coupled receptors (GPCRs). Even though the odorant signaling pathway is well known, little is known about its modulators. In 2005, our lab identified RIC-8B as a putative guanine nucleotide exchange factor (GEF) that is able to interact with the olfactory G-protein (Golf) and amplify its activity. Here we show that RIC-8B also interacts with G&#947;13. We also found that G&#946;1 is the G&#946; subunit that is predominantly expressed in the olfactory epithelium. Furthermore, RIC-8B, G&#945;olf, G&#946;1 and G&#947;13 are highly concentrated in the cilia of olfactory neurons and co-localize in this cellular compartment. We also show that RIC-8B interaction with G&#945olf is stronger in the presence of GDP than GTP, as expected for a GEF. Curiously, in the presence of G&#946;1 and G&#947;13, RIC-8B and G&#945;olf remain associated, in the presence of both GDP or GTP, probably through an indirect interaction via G&#946;1/G&#947;13. We also showed that the amounts of G&#945;olf, G&#946;1 and G&#947;13 in the cell membrane increase if RIC-8B is cotransfected in the same cell. Our results suggest that RIC-8B plays two roles. First, it may act as a chaperone which assists in the assembly and trafficking of the G protein complex. Second, RIC-8B would also act as a GEF to increase G&#945;olf dependent cAMP production and thereby amplify odorant signal transduction. Lastly, we believe that G&#946;1 and G&#947;13 may act as a scaffold to position RIC-8B close to its target, G&#945;olf, further enhancing the GEF activity.

Introdução: A apneia do sono é condição prevalente e apresenta forte correlação com as principais causas de morbidade e mortalidade na sociedade ocidental. A perda do controle neuromotor proveniente de estágios mais profundos do sono está associada ao colapso faríngeo e a patogênese da apneia obstrutiva do sono (SAOS). A língua é implicada como principal protagonista na patogênese da obstrução das vias aéreas superiores (VAS) durante o sono. Não há farmacoterapia para SAOS. Novas tecnologias moleculares para controle neuronal através da inserção de um receptor de membrana geneticamente modificado, denominado Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs], o qual pode ser ativado por uma droga inicialmente inerte, de alta especificdade, clozapina-n-oxide (CNO). Objetivos: 1) Modificar geneticamente os neurônios motores do núcleo do hipoglosso utilizando-se de DREADDs, o qual permite regular sua atividade; 2) Analisar a atividade do músculo genioglosso sob administração de CNO; 3) Desenvolver abordagens para rastreamento dos músculos protrusores e retratores da língua por marcadores retrógrados, injecção de subunidade B de toxina colérica (CTB-AF) e do vírus de pseudoraiva (PRV) 267 transportando um gene repórter, nos músculos efetores. Métodos: Receptores muscarínicos mutados em um vetor adenoviral associado (AAV) foram infundidos no núcleo do hipoglosso de camundongos via injeção esterotáxica bilateral. Após quatro semanas, período para expressão fenotípica, foram comparadas a atividade eletromiográfica do músculo genioglosso (EMGGG) em resposta a administração de ligante (CNO) versus solução salina. Em um segundo grupo foram realizadas infusões com vírus controle e comparação da EMGGG pré e pós infusão de CNO. Para rastreamento neural a CTB-AF foi injetado nos músculos protusores e retratores da língua e para expressão de Cre o vírus PRV-267 foi injetado no músculo genioglosso. A expressão dessas substâncias no núcleo do hipoglosso foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Resultados: Dos dezoito camundongos injetados com DREADDs, dezesseis foram transfectados pelo vetor de AAV. Em camundongos onde o núcleo motor do hipoglosso foi corretamente atingido a EMGGG apresentou importante aumento após a administração de CNO. Em contraste, a atividade do genioglosso não apresentou alteração após a administração de soro fisiológico. Em três camundongos onde a transfecção ultrapassou os limites do núcleo foi observado arritmia respiratória após infusão do ligante. Todos animais infundidos com vírus controle foram adequadamente transfectados mas não apresentaram alteração eletromiográfica após a infusão de CNO. Foram diferenciados no núcleo do hipoglosso os neurônios motores da musculatura retratora e protusora da língua. A expressão intranuclear da enzima Cre-recombinase foi identificada no núcleo hipoglosso. Conclusão: A utilização de métodos quimiogenéticos para ativar grupos selecionados de neurônios motores em áreas cerebrais específicas representa técnica promissora para o estudo do controle neuromotor das VAS. Estes resultados sugerem que a terapia transgênica pode ser eficaz no tratamento da SAOS além de uma vasta gama de patologias que resultam de perturbações no controle neural das VAS. Através da manipulação das fibras musculares efetoras na língua foi possível a identificação do seu respectivo neurônio motor no núcleo do hipoglosso e induzi-lo a sintetizar uma enzima específica (Cre-recombinase) / Introduction: Sleep Apnea is a prevalent condition and strongly correlates with the major causes of morbidity and mortality in Western Society. The loss of motor input from deeper sleep stages is associated with pharyngeal collapsibility and the pathogenesis of obstructive sleep apnea (OSA). The tongue plays a major role in the pathogenesis of upper airway (UA) obstruction during sleep. There is no pharmacotherapy for OSA. New molecular techniques allow to control neuronal function by inserting a genetically modified membrane receptor termed the Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs] which can be activated by a highly specific and otherwise pharmacologically inert drug clozapine-N-oxide (CNO) Objectives: 1) To genetically modify the hypoglossal nucleus motor neurons using DREADDs, which allows to regulate their activity; 2) To analyze the genioglossal activity upon administration of CNO; 3) to develop novel approaches to targeting tongue protruders and retractors by retrograde tracers, cholera toxin subunit B (CTB-AF) and pseudorabies virus (PRV) 267 injection carrying a reporter gene into the effector muscles. Methods: Mutated muscarinic receptors in an adenoviral associated vector (AAV) were delivered to the hypoglossal nucleus via stereotactically bilateral injection. Four weeks after adenoviral delivery (expression period), responses in genioglossal electromyography (EMGGG) activity to intraperitoneal administration of CNO ligand vs. Saline (control) were compared in mice. In a second group, control-virus was infused and genioglossus muscle EMGGG was compared before and after CNO infusion. For neuronal tracing CTB-AF was injected into the protrusor and retractor muscles of the tongue and for Cre induction PRV-267 virus was injected in the genioglossus muscle. Expression of these substances in the hypoglossal nucleus were evaluated by fluorescence histology. Results: Of eighteen DREADDs injected mice, sixteen were transfected with AAV vector. After CNO administration EMGGG activity increased in mice where the hypoglossal motor nucleus was correctly targeted. In contrast, genioglossal activity was not augmented following saline administration. In three mice where transfection surpassed the nucleus limits, breathing arrhythmia was observed following ligand infusion. All animals infused with control virus were adequately transfected but did not present electromyographic change following CNO infusion. The motor neurons of the rectractor and protrusor musculature of the tongue were well differentiated in the hypoglossal nucleus. Intranuclear expression of Cre recombinase enzyme was identified in the hypoglossal nucleus. Conclusion: Utilizing chemogenetic methods to activate motor neuron groups in selected brain areas show promise to UA neuromotor control, and suggest that transgenic therapy may be effective in treating OSA and a wide range of pathologies that result in disturbances of UA neural control. By manipulating the effector muscle fibers of the tongue, it was possible to identify its respective motor neuron in the hypoglossal nucleus and to induce synthesis of a specific enzyme (Cre recombinase)

Introdução: A apneia do sono é condição prevalente e apresenta forte correlação com as principais causas de morbidade e mortalidade na sociedade ocidental. A perda do controle neuromotor proveniente de estágios mais profundos do sono está associada ao colapso faríngeo e a patogênese da apneia obstrutiva do sono (SAOS). A língua é implicada como principal protagonista na patogênese da obstrução das vias aéreas superiores (VAS) durante o sono. Não há farmacoterapia para SAOS. Novas tecnologias moleculares para controle neuronal através da inserção de um receptor de membrana geneticamente modificado, denominado Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs], o qual pode ser ativado por uma droga inicialmente inerte, de alta especificdade, clozapina-n-oxide (CNO). Objetivos: 1) Modificar geneticamente os neurônios motores do núcleo do hipoglosso utilizando-se de DREADDs, o qual permite regular sua atividade; 2) Analisar a atividade do músculo genioglosso sob administração de CNO; 3) Desenvolver abordagens para rastreamento dos músculos protrusores e retratores da língua por marcadores retrógrados, injecção de subunidade B de toxina colérica (CTB-AF) e do vírus de pseudoraiva (PRV) 267 transportando um gene repórter, nos músculos efetores. Métodos: Receptores muscarínicos mutados em um vetor adenoviral associado (AAV) foram infundidos no núcleo do hipoglosso de camundongos via injeção esterotáxica bilateral. Após quatro semanas, período para expressão fenotípica, foram comparadas a atividade eletromiográfica do músculo genioglosso (EMGGG) em resposta a administração de ligante (CNO) versus solução salina. Em um segundo grupo foram realizadas infusões com vírus controle e comparação da EMGGG pré e pós infusão de CNO. Para rastreamento neural a CTB-AF foi injetado nos músculos protusores e retratores da língua e para expressão de Cre o vírus PRV-267 foi injetado no músculo genioglosso. A expressão dessas substâncias no núcleo do hipoglosso foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Resultados: Dos dezoito camundongos injetados com DREADDs, dezesseis foram transfectados pelo vetor de AAV. Em camundongos onde o núcleo motor do hipoglosso foi corretamente atingido a EMGGG apresentou importante aumento após a administração de CNO. Em contraste, a atividade do genioglosso não apresentou alteração após a administração de soro fisiológico. Em três camundongos onde a transfecção ultrapassou os limites do núcleo foi observado arritmia respiratória após infusão do ligante. Todos animais infundidos com vírus controle foram adequadamente transfectados mas não apresentaram alteração eletromiográfica após a infusão de CNO. Foram diferenciados no núcleo do hipoglosso os neurônios motores da musculatura retratora e protusora da língua. A expressão intranuclear da enzima Cre-recombinase foi identificada no núcleo hipoglosso. Conclusão: A utilização de métodos quimiogenéticos para ativar grupos selecionados de neurônios motores em áreas cerebrais específicas representa técnica promissora para o estudo do controle neuromotor das VAS. Estes resultados sugerem que a terapia transgênica pode ser eficaz no tratamento da SAOS além de uma vasta gama de patologias que resultam de perturbações no controle neural das VAS. Através da manipulação das fibras musculares efetoras na língua foi possível a identificação do seu respectivo neurônio motor no núcleo do hipoglosso e induzi-lo a sintetizar uma enzima específica (Cre-recombinase) / Introduction: Sleep Apnea is a prevalent condition and strongly correlates with the major causes of morbidity and mortality in Western Society. The loss of motor input from deeper sleep stages is associated with pharyngeal collapsibility and the pathogenesis of obstructive sleep apnea (OSA). The tongue plays a major role in the pathogenesis of upper airway (UA) obstruction during sleep. There is no pharmacotherapy for OSA. New molecular techniques allow to control neuronal function by inserting a genetically modified membrane receptor termed the Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs] which can be activated by a highly specific and otherwise pharmacologically inert drug clozapine-N-oxide (CNO) Objectives: 1) To genetically modify the hypoglossal nucleus motor neurons using DREADDs, which allows to regulate their activity; 2) To analyze the genioglossal activity upon administration of CNO; 3) to develop novel approaches to targeting tongue protruders and retractors by retrograde tracers, cholera toxin subunit B (CTB-AF) and pseudorabies virus (PRV) 267 injection carrying a reporter gene into the effector muscles. Methods: Mutated muscarinic receptors in an adenoviral associated vector (AAV) were delivered to the hypoglossal nucleus via stereotactically bilateral injection. Four weeks after adenoviral delivery (expression period), responses in genioglossal electromyography (EMGGG) activity to intraperitoneal administration of CNO ligand vs. Saline (control) were compared in mice. In a second group, control-virus was infused and genioglossus muscle EMGGG was compared before and after CNO infusion. For neuronal tracing CTB-AF was injected into the protrusor and retractor muscles of the tongue and for Cre induction PRV-267 virus was injected in the genioglossus muscle. Expression of these substances in the hypoglossal nucleus were evaluated by fluorescence histology. Results: Of eighteen DREADDs injected mice, sixteen were transfected with AAV vector. After CNO administration EMGGG activity increased in mice where the hypoglossal motor nucleus was correctly targeted. In contrast, genioglossal activity was not augmented following saline administration. In three mice where transfection surpassed the nucleus limits, breathing arrhythmia was observed following ligand infusion. All animals infused with control virus were adequately transfected but did not present electromyographic change following CNO infusion. The motor neurons of the rectractor and protrusor musculature of the tongue were well differentiated in the hypoglossal nucleus. Intranuclear expression of Cre recombinase enzyme was identified in the hypoglossal nucleus. Conclusion: Utilizing chemogenetic methods to activate motor neuron groups in selected brain areas show promise to UA neuromotor control, and suggest that transgenic therapy may be effective in treating OSA and a wide range of pathologies that result in disturbances of UA neural control. By manipulating the effector muscle fibers of the tongue, it was possible to identify its respective motor neuron in the hypoglossal nucleus and to induce synthesis of a specific enzyme (Cre recombinase)

O sistema olfatório de mamíferos é capaz de detectar milhares de substâncias químicas diferentes, mesmo em baixas concentrações. Um odorante disperso no ar pode se ligar a um receptor olfatório (OR) iniciando o processo de detecção. Os ORs são membros da super família de receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Apesar de a via de transdução de sinal de odorantes estar bem descrita, pouco se sabe sobre os seus moduladores. Em 2005, nosso laboratório identificou RIC-8B como um possível fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) que poderia amplificar a atividade da proteína G olfatória (Golf). No presente trabalho mostramos que RIC-8B é capaz de interagir com G&#947;13. Procurando os outros componentes desse complexo identificamos G&#946;1 como sendo a subunidade G&#946; mais expressa no epitélio olfatório. Além disso, RIC-8B, G&#945;olf, G&#946;1 e G&#947;13 encontram-se concentrados nos cílios dos neurônios olfatórios e se co-localizam nesse compartimento celular. Nossos experimentos de co-imunoprecipitação mostram que RIC-8B interage mais fortemente com G&#945;olf, na presença de GDP do que na presença de GTP, como esperado para uma GEF. Curiosamente quando G&#946;1 e G&#946;13 estão presentes, RIC-8B e G&#945;olf co-imunoprecipitam igual, independente do nucleotídeo de guanina utilizado. Apesar de, na presença de G&#946;1 e G&#947;13, não observarmos dissociação física de RIC-8B e G&#945;olf com a mudança do estado de ativação, o efeito de RIC-8B na produção de AMPc não é afetada. Também mostramos que a quantidade de G&#945;olf, G&#946;1 e G&#947;13 presentes na membrana celular aumenta quando estas são co-transfectadas com RIC-8B em células de mamíferos. Nossos resultados apontam para um papel duplo da RIC-8B. Primeiro, RIC-8B poderia funcionar como uma chaperona auxiliando na formação e transporte do complexo heterotrimérico, Golf, em neurônios olfatórios. Em segundo lugar, RIC-8B também atuaria como uma GEF sobre G&#945;olf, aumentando a produção de AMPc e portanto amplificando a via de transdução de sinal de odorantes. Por fim, acreditamos que um possível papel para G&#946;1 e G&#947;13 nesse complexo seria funcionar como um andaime molecular, aproximando RIC-8B de seu alvo, G&#945;olf, potencializando ainda mais a atividade de GEF. / The mammalian olfactory system detects small amounts of thousands of different chemical compounds. Odorant perception starts when an odorant in the air binds to an olfactory receptor (OR). ORs belong to the super family of G-protein coupled receptors (GPCRs). Even though the odorant signaling pathway is well known, little is known about its modulators. In 2005, our lab identified RIC-8B as a putative guanine nucleotide exchange factor (GEF) that is able to interact with the olfactory G-protein (Golf) and amplify its activity. Here we show that RIC-8B also interacts with G&#947;13. We also found that G&#946;1 is the G&#946; subunit that is predominantly expressed in the olfactory epithelium. Furthermore, RIC-8B, G&#945;olf, G&#946;1 and G&#947;13 are highly concentrated in the cilia of olfactory neurons and co-localize in this cellular compartment. We also show that RIC-8B interaction with G&#945olf is stronger in the presence of GDP than GTP, as expected for a GEF. Curiously, in the presence of G&#946;1 and G&#947;13, RIC-8B and G&#945;olf remain associated, in the presence of both GDP or GTP, probably through an indirect interaction via G&#946;1/G&#947;13. We also showed that the amounts of G&#945;olf, G&#946;1 and G&#947;13 in the cell membrane increase if RIC-8B is cotransfected in the same cell. Our results suggest that RIC-8B plays two roles. First, it may act as a chaperone which assists in the assembly and trafficking of the G protein complex. Second, RIC-8B would also act as a GEF to increase G&#945;olf dependent cAMP production and thereby amplify odorant signal transduction. Lastly, we believe that G&#946;1 and G&#947;13 may act as a scaffold to position RIC-8B close to its target, G&#945;olf, further enhancing the GEF activity.

O vírus sincicial respiratório humano (VSRH) é o agente viral mais freqüentemente relacionado a doenças do trato respiratório inferior em crianças abaixo de um ano de idade. Analíse da varibilidade antigênica e gênica mostraram que o VSRH pode ser divido em dois grupos: A e B. O vírus é um membro do gênero Pneumovirus pertencente a família Paramyxoviridea, e possui três principais proteínas que são: glicoproteina F (fusão), glicoproteina G (adesão), glicoproteina SH (pequena proteína hidrofóbica). A proteína F é responsável pela fusão da célula ao vírus, enquanto a proteína G tem papel fundamental na replicação do vírus, porém a função da proteína SH, ainda não está bem definida, estudos recentes mostram-na como responsável por inibir a sinalização do fator de necrose tumoral alfa (TNF-a). Neste estudo foram colhidas amostras de 965 crianças, entre os anos de 2004 e 2005, dentre as quais 424 foram positivas. 117 amostras foram seqüenciadas a proteína SH e G e comparadas com amostras que circularam mundialmente. A analíse filogenética mostrou uma baixa variabilidade entre os genótipos estudados tanto do grupo A quanto do B. / The human respiratory syncytial virus (HRSV) is the major cause of lawer respiratory tract infections in infantis, young children and elderly. Analysis of the antigenic and genetic variability has shown that there are two groups of the virus HRSV, A and B. The virus (HRSV) is a member of the genus pneumovirus in the paramyxoviridae family. The virus encodes three membrane-bound glicoproteins, namely the fusion (F) attachment (G) and small hydrophobic (SH) proteins. The F mediates fusion of the virus and cell membranes and the G proteins is involved in virus attachment. The biological properties of the F and G glicoproteins and role that they play during virus replication relatively well understood, however the functional significance of the SH protein during replication remains unclear, although recent study shown that it can inhibit TNF-alpha. In this study, HRSV strains were isolated from nasopharyngeal aspirates collected from 965 children between 2004 and 2005, yielding 424 positive samples. We sequenced the small hydrophobic protein (SH) gene and protein (G) of 117 samples and compared them with other viruses identified worldwide. The phylogenetic analysis showed a low genetic variably among the isolates but allowed us to classify the viruses into different genotypes for the A and B HRSV strains.

Os fungos filamentosos passam por um crescimento polarizado, desde a germinação ao alongamento das hifas, até formar um complexo micélio. A região apical do crescimento polarizado do fungo apresenta dois tipos diferentes de vesículas, entre elas, as microvesículas. As ADP-ribosylation factors (ARFs), são proteínas monoméricas ligadoras de GTP e pertence ao grupo de proteínas da superfamília Ras. Essas proteínas são divididas em cinco famílias: ARF, RAB, RAN, RAS e RHO que formam um conjunto de sub-sistemas que são responsáveis, entre outras funções, pela regulação do transporte de vesículas no interior da célula fúngica, entre outras funções, como transduções de sinais e regulação do tráfego vesicular na região de crescimento apical, o spitzenkörper. São proteínas de ancoramento e de marcação de vesículas, envolvidas no tráfego, catálise e fusão por meio de sinalização de membrana-alvo para as vesículas de transporte transmembrana. As ARF são importantes para o crescimento das hifas, além de participar da montagem de vesículas por meio de endocitoses, do transporte destas vesículas entre as organelas e na exocitose. Adicionalmente, as ARFs sofrem o processo de N-miristoilação, uma irreversível lipidação proteica em que o miristato do miristoil CoA é covalentemente ligado a uma glicina secundária da proteína alvo, aumentando a sua hidrofobicidade. Além desta regulação, as ARFs são moduladas pela ação das ARF-GAP (GTPase Activating Protein) e ARF-GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factor). Neste trabalho foi proposta a deleção de três ARFs preditivamente miristoiladas (arfA, arfB and arlA), além de dupla-deleção com ?gcsA (ARF-GAP) e a caracterização genotípica e fenotípica das ADP ribosylation fator no fungo filamentoso patogênico Aspergillus fumigatus. Como caracterização das linhagens deletadas, notou-se que arfA demonstra ser essencial para A. fumigatus, enquanto que o fungo foi capaz de se desenvolver na ausência de arfB, arlA e duplo mutantes com ?gcsA. Porém, de forma alternada nas linhagens mutantes, houve redução do diâmetro da colônia, desestruturação de conidióforos, polarização dicotômica e redução de corpos lipídicos na região de crescimento apical. Além das alterações da parede celular que implicou em altações na carga de superfície, formação de biofilme e virulência. Testes de sensibilidades, bem como as análises de níveis de expressão gênica frente a a compostos danosos a eucariotos e antifúngicos evidenciaram que as ARFs e GcsA estão envolvidas em reparos a danos frente a diferentes alvos citoplasmáticos. Ainda, a localização das ARFs fusionadas com GFP (Green Flourescence Protein) em A. fumigatus evidenciou que ArfB está nas regiões apicais das hifas e conidióforos, enquanto ArlA está distribuído em todo citoplasma. Portanto as ARFs em A. fumigatus estão envolvidas nos processos básicos do fungo, como: o crescimento, a virulência e a reprodução / The filamentous fungi undergo polarized growth, from germination to hyphae elongation, to form a mycelial complex. The apical region of the polarized growth of the fungus presents two different types of vesicles, among them, the microvesicles. ADP-ribosylation factors (ARFs) are monomeric GTP-binding proteins and belong to a group of superfamily Ras proteins. These proteins are divided into five families: ARF, RAB, RAN, RAS and RHO that form a set of subsystems that are responsible, over others things, for the regulation of vesicle transport within the fungal cell, among other functions, such as signal transduction and regulation of the vesicular traffic in the apical growth region, the Spitzenkörper. They are anchoring and vesicle marking proteins involved in trafficking, catalysis and fusion by means of target membrane signaling to the transmembrane transport vesicles. ARFs are important for the growth of hyphae, besides participating in vesicle assembly through endocytosis, the transport of these vesicles between the organelles and exocytosis. In addition, the ARFs undergo the N-myristoylation process, an irreversible protein lipidation in which the myristoyl CoA myristate is covalently linked to a secondary glycine of the target protein, increasing its hydrophobicity. In addition to this regulation, the Arfs are modulated by the action of Arf-GAP (GTPase Activating Protein) and ARF-GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factor). In this work, the deletion of three myristoylated ARFs (arfA, arfB and arlA), as well as double-deletion with ?gcsA (ARF-GAP) and phenotypic and genotypic characterization of ADP ribosylation fator in the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus was proposed. As a characterization of the deleted strains, arfA shown to be essential for A. fumigatus, whereas the fungus was able to develop in the absence of arfB, arlA and double mutants with ?gcsA. However, in the mutant strains, there was a decrease in colony diameter, deconjugation of conidiophores, dichotomous polarization and reduction of lipid bodies in the apical growth region. In addition, cell wall changes were registered that implied in surface charge elevations, biofilm formation and virulence. In tests of sensitivities, as well as the analysis of levels of gene expression against compounds harmful to eukaryotes and antifungals showed that ARFs and GcsA (Arf-GAP) are involved in damage repair against different cytoplasmic targets. Furthermore, the location of the GFP-fused GFPs (Green Flourescence Protein) in A. fumigatus evidenced that ArfB is in the apical regions of the hyphae and conidiophores, while ArlA is diffuse in every cytoplasm. Therefore, the ARFs in A. fumigatus are involved in the basic processes of the fungus, such as growth, virulence and reproduction