Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / "La Astaxantina protege a las neuronas de cultivo primario de hipocampo de los efectos dañinos de los oligómeros del peptido β-amiloide " Introducción: El incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno y la aparición de estrés oxidativo contribuyen en forma importante para el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs) son considerados como entidades moleculares centrales en la patogénesis de la EA. A concentraciones sub-letales, los AβOs producen señales aberrantes de Ca2+ y disminuyen la expresión de la isoforma 2 del receptor de ryanodina (RyR2), una proteína importante para los procesos de plasticidad y memoria asociados al hipocampo. En este trabajo, investigamos si el pre-tratamiento con el antioxidante astaxantina (ATX) protege a las neuronas de los efectos deletéreos inducidos por los AβOs, como el incremento en la producción de H2O2 mitocondrial, la activación de la isoforma c4 del factor nuclear de células T activadas (NFATc4), y la disminución del RNAm de RyR2 en un modelo de cultivo primario de células de hipocampo de rata. Metodología: Para estudiar los efectos de ATX sobre la viabilidad celular, se realizó una curva dosis respuesta con ATX y se determinó la viabilidad utilizando el kit Live/Dead®. Para determinar los niveles de producción de H2O2 mitocondrial y la activación de NFATc4, las neuronas se transfectadas con plasmidios codificantes para la proteína sensora de H2O2, para HyperMito o para la proteína de fusión entre NFATc4 y la proteína fluorescente verde (GFP), (NFATc4-eGFP), respectivamente. Los niveles de RNAm de RyR2 se determinaron por qPCR. Los cultivos primarios de células hipocampales se pre-trataron con 0,1 μM de ATX, 90 minutos antes de ser tratados con 0,5 μM AβOs. Resultados y Conclusiones: El tratamiento con ATX (≤10 μM) por ≤ 24 horas no evidenció cambios en la viabilidad del cultivo. La pre-incubación con ATX 0,1 μM previno el incremento en la producción de H2O2 mitocondrial inducido por los AβOs. El tratamiento con AβOs por 6 horas indujo la translocación nuclear de NFATc4-eGFP y la disminución de los niveles de expresión del RNAm de RyR2. La pre-incubación con ATX 0,1 μM previno ambos efectos. Estos resultados indican que la ATX protege a las neuronas del incremento en la producción de H2O2 mitocondrial, la activación de NFATc4, y la disminución del RNAm de RyR2, inducidos por los AβOs / "Astaxanthin protects primary hippocampal neurons against noxious effects of Aβ-Oligomers" Introduction: Increased reactive oxygen species (ROS) generation and the ensuing oxidative stress contribute to Alzheimer´s disease pathology. We reported previously that amyloid-β peptide oligomers (AβOs) produce aberrant Ca2+ signals at sub-lethal concentrations and decrease the expression of type-2 ryanodine receptors (RyR2), which are crucial for hippocampal synaptic plasticity and memory. Here, we investigated whether the antioxidant agent astaxanthin (ATX) protects neurons from AβOs-induced excessive mitochondrial ROS generation, NFATc4 activation and RyR2 RNAm down-regulation. Methodology: To study the effects of ATX on cell viability, we performed a dose response curve and quantified cells survival using the Live/Dead® kit. To determine mitochondrial H2O2 production or NFATc4 nuclear translocation, neurons were transfected with plasmids coding for HyperMito or NFATc4-eGFP, respectively, qPCR was employed to determine RyR2 RNAm expression levels. Primary hippocampal cultures were incubated with 0.1 μM ATX for 1.5 h prior to 0.5 μM AβOs addition. Results and Conclusion: We found that incubation with ATX (≤10 μM) for ≤ 24 h was non-toxic to neurons. Pre-incubation with 0.1 μM ATX also prevented the neuronal mitochondrial H2O2 generation induced within minutes of AβOs addition. Longer exposures to AβOs (6 h) promoted NFATc4-eGFP nuclear translocation and decreased RyR2 RNAm levels, evaluated by detection of the eGFP tagged fluorescent plasmid and qPCR, respectively. Pre-incubation with 0.1 μM ATX prevented both effects. These results indicate that ATX protects neurons from the noxious effects of AβOs on mitochondrial ROS production, NFATc4 activation and RyR2 gene expression down-regulation

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Les récepteurs AMPAR sont les principaux responsables de la transmission excitatrice rapide dans le système nerveux central, y compris dans les neurones d’hippocampe étudiés ici. Ils sont très dynamiques dans la membrane. Au sein des épines dendritiques, ils peuvent se déplacer par traffic membranaire entre les compartiments intracellulaires et la membrane plasmique. Une fois à la surface, ils se déplacent par diffusion latérale et peuvent s'ancrer réversiblement avec des protéines de la densité postsynaptique ou retourner dans des compartiments endocytaires. Les oligomères Aß augmentent l'endocytose des récepteurs AMPAR, diminuent la densité des épines dendritique et provoquent des défaillances globales dans la transmission synaptique excitatrice. Ces effets, sont englobés dans le terme "synaptotoxicité des oligomères Aß" et sont un domaine principal d'étude de l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. Wnt5a un ligand Wnt endogène connu pour activer la voie non-canonique dans les neurones d'hippocampe, génère une augmentation des courants excitateurs et des aggrégats de PSD95 et protége les neurones contre la synaptotoxicité des oligomères Aβ. Compte tenu du fait que Wnt5a semble contrecarrer les effets nocifs causés par les oligomères Aß, nous avons procédé à l'étude du mécanisme par lequel Wnt5a protège de la synaptotoxicité des oligomères Aβ. Cela nous a conduit à évaluer l'effet de Wnt5a sur l'un des facteurs dans la transmission glutamatergique, la dynamique des récepteurs AMPAR. En utilisant la microscopie à super-résolution dans les neurones d'hippocampe vivants et fixés, nous avons trouvé que Wnt5a module la dynamique et la localisation des récepteurs AMPAR. Plus précisément, Wnt5a stabilise les récepteurs AMPAR dans les sites synaptiques et extrasynaptiques. Ceci est corrélé avec une augmentation de la co-localisation et de l'interaction entre GluA2 et PSD95. Ces effets ne sont exercés que par l'activation non-canonique de la signalisation Wnt, à travers le ligand Wnt5a et non par les effets canoniques de Wnt7a. De manière intéressante, la pré-incubation de Wnt5a prévient la toxicité des oligomères Aß et maintient la dynamique basale des récepteurs AMPAR. Nos données suggèrent que Wnt5a empêche les effets des oligomères Aβ en favorisant leur stabilisation dans les sites synaptiques. / AMPARs (AMPARs) are responsible for most fast excitatory synaptic transmission in the central nervous system, including hippocampal neurons studied here. AMPARs are highly dynamic in the plasma membrane. Within dendritic spines, they move by membrane trafficking between intracellular compartments and the plasma membrane. Once at the surface, they move through lateral brownian diffusion and can reversibly anchor to postsynaptic density proteins or return to endocytic compartments. Aβ oligomers increase endocytosis of AMPARs, diminish dendritic spine density and cause overall failures in excitatory transmission. These effects, among others, are englobed in the term “Aβ oligomers synaptotoxicity” and are a main focus on the study of Alzheimers disease ethiology. On the contrary, Wnt5a - an endogenous Wnt ligand known to activate the non-canonical pathway in hippocampal neurons - generates an increase in excitatory currents and in clusters of PSD95 and protects neurons against Aβ oligomers synaptotoxicity. Given the fact that Wnt5a seems to counteract the distresses caused by Aβ oligomers, we proceeded to study the mechanism through which Wnt5a protects from Aβ oligomers synaptotoxicity. This led us to evaluate the effect of Wnt5a on one of the important factors in glutamatergic transmission, i.e. AMPAR receptor dynamics. By using super-resolution microscopy in live and fixed hippocampal neurons, we found that Wnt5a modulates the dynamic and localization of AMPARs. Specifically, Wnt5a stabilizes AMPARs in synaptic and extrasynaptic sites. This correlates with an increase in co-localization and interaction between GluA2 and PSD95. These effects are exerted only by non-canonical activation of Wnt signaling, through Wnt5a ligand and not by the canonical effects of Wnt7a. Interestingly, pre-incubation of Wnt5a prevents toxicity of Aβ oligomers and maintains basal AMPARs dynamics. Our data suggest that Wnt5a prevents Aβ oligomers effects by promoting their stabilization in synaptic sites. / Los receptores AMPA (AMPARs) son los principales responsables de la respuesta excitatoria rápida en el sistema nervioso central, incluyendo neuronas hipocampales, estudiadas en esta tesis. A diferencia de otros receptores glutamatérgicos, los AMPARs son altamente dinámicos. Dentro de las espinas dendríticas, se pueden mover hacia y desde compartimentos endocíticos y hacia la membrana plasmática. Una vez en la superficie, a través de difusión lateral, se pueden anclar a proteínas de la densidad postsináptica o regresar a compartimentos endocíticos. Por otro lado, los oligómeros Aβ (oAβ) aumentan la endocitosis de AMPARs, disminuyen la densidad de espinas dendríticas y causan una falla generalizada de la transmisión sináptica excitatoria. Estos efectos, entre otros, se engloban en el término “sinaptotoxicidad por oAβ” y es uno de los principales puntos de estudio en la etiología de la enfermedad de Alzheimer. Al contrario, Wnt5a un ligando endógeno conocido por activar la vía no canónica en neuronas hipocampales, genera un aumento en corrientes excitatorias y en los clusters de PSD95 y protege a las neuronas contra la sinaptotoxicidad causada por oAβ. Debido a esto, procedimos a estudiar el mecanismo por el cual Wnt5a protege de la sinaptotoxicidad causada por Aβ. Esto nos llevó a evaluar los efectos de Wnt5a en uno de los principales factores en la transmisión glutamatérgica, la dinámica de los AMPARs. Con el uso de microscopía de super-resolución en neuronas hipocampales vivas, encontramos que Wnt5a modula la dinámica y localización de los AMPARs. Específicamente, Wnt5a estabiliza los AMPARs en espinas y dendritas. Lo cual se correlaciona con un aumento en la co-localización e interacción entre GluA2 y PSD95. Estos efectos son causados únicamente por la activación no-canónica de la vía Wnt, a través del ligando Wnt5a y no por los efectos canónicos de Wnt7a. De manera interesante, la pre-incubación de Wnt5a previene la toxicicidad de los oligómeros Aβ y mantiene la dinámica basal de los AMPARs. Esta data sugiere que Wnt5a promueve la estabilización de AMPARs, previniendo los efectos synaptotóxicos de los oAβ .