La enfermedad de Parkinson es un desorden neurodegenerativo para el cual ninguna terapia ha probado tener una acción neuroprotectora.El estrés oxidativo y la neuroinflamación juegan un papel importante en la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson.Zea mays L., llamado comúnmente “maíz morado” es una gramínea que contiene una gran cantidad de compuestos fenólicos como flavonoides y antocianinas. La actividad antiinflamatoria del extracto etanólico de Zea mays L. fue demostrada por su acción protectora frente a la hemólisis. La actividad antioxidante, fue demostrada por la capacidad de disminución de los marcadores del estrés oxidativo, óxido nítrico y malondialdehido. Los resultados sugieren que Zea mays L., debido a su actividad antiinflamatoria y antioxidante, está muy relacionado con la actividad neuroprotectora. Palabras clave: Enfermedad de Parkinson, neuroprotección, estrés oxidativo, neuroinflamación, actividad antiinflamatoria, actividad antioxidante, Zea mays L. / --- Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder for which no therapy has been prove to be neuroprotective. Oxidative stress and neuroinflamation play an important role in the pathophysiology of Parkinson’s disease. Zea mays L., commonly called as “maíz morado” is a graminacea that contains a high amount of phenolic compounds such as flavonoids and anthocyanins. The antioxidant activity of Zea mays L. was demonstrated by its ability to reduce the oxidative stress marquers, nitric oxid and malondialdehyde. These results suggest that Zea mays L., it’s much related to a neuroprotective activity due to its anti-inflammatory and antioxidant activities. Key words: Parkinson’s disease, neuroprotection, oxidative stress, neuroinflamation, anti-inflammatory activity, antioxidant activity, Zea mays L. / Tesis

En la presente tesis doctoral se ha establecido y caracterizado un modelo in vitro de lesión excitotóxica por glutamato basado en cultivos organotípicos de médula espinal de rata postnatal de 7-8 días. La optimización del medio de cultivo sin suero permite mantener los explantes más de 15 días in vitro con unas características en cuanto a la citoarquitectura y al número de motoneuronas similares a las obtenidas con medio con suero. Sobre los explantes se han establecido dos modelos de lesión; una mecánica y otra excitotóxica. Para establecer la lesión excitotóxica se han utilizado diferentes concentraciones de glutamato que provocan una respuesta dependiente de dosis. Esta respuesta se ha evaluado cuantificando la cantidad de homodímero-1 de etidio, un marcador fluorescente que es captado por las células dañadas, mediante el análisis de imágenes y cuantificando el número de motoneuronas supervivientes. Asimismo, se ha caracterizado que esta lesión está mediada principalmente por el receptor de glutamato NMDA. Las motoneuronas en desarrollo postnatal sufren un cambio en las subunidades NR2A y NR3B el cual se mimetiza en los explantes organotípicos en nuestras condiciones de cultivo. Una vez estandarizado el modelo de lesión excitotóxica se ha utilizado para evaluar el efecto neuroprotector de diversos fármacos como son la eritropoyetina, el riluzol, el rolipram, el valproato, la región c terminal de la toxina tetánica y la metilprednisolona (ver Trabajo I). Este modelo ha sido de utilidad asimismo para analizar los mecanismos moleculares de algunos de estos fármacos como el FK506 y el ligando PRE084 del receptor sigma 1. El análisis ha permitido establecer que el FK506 preserva el parénquima tisular frente a la lesión, efecto que es favorecido por la modulación de los niveles de la chaperona Hsp70 que el FK506 produce sobre la microglia (ver Trabajo II). Por último, se ha podido observar que el PRE084 ejerce un efecto neuroprotector e inductor de la elongación neurítica en las motoneuronas del explante, y que dichos efectos son mediados por la PKC aunque no por la activación de CREB (ver Trabajo III). / We have established and characterized an in vitro model of excitotoxic injury by glutamate based on organotypic cultures of spinal cord from postnatal rats of 7-8 days. The optimized culture medium without serum allows the culture of the explants over 15 days in vitro. The cultures maintain a cytoarchitecture and a motoneuron number similar to those observed with the serum-containing medium. On the explants we have established a mechanical injury model and an excytotoxic model. On the excytotoxic injury we have used different glutamate concentrations with a doses-dependent response that was evaluated by the image analysis of the EthD (Ethidium homodimer-1) uptake, and the quantification of the number of surviving motoneurons. We observed that this lesion is mainly mediated by the NMDA receptor. The spinal cord explants underwent a NR2A and NR3B subunit change similar to that observed on the rat postnatal development. The established in vitro injury model of excitotoxic lesion has been used to assess the neuroprotector effect of different drugs like erithropoyetin, riluzole, rolipram, valproate, the tetanus toxin c-terminus, and methilprednisolone (see section I). This model has been useful to analyze the molecular mechanisms of FK506 and the ligand of the sigma receptor 1, PRE084. We observed that FK506 protects the tissular parenchyma against the glutamate excitotoxic injury thanks to the modulation of Hsp70 levels induced by FK506 on the microglia (see section II). We observed that PRE084 has a neuroprotector effect and that it is an inductor of the neurite elongation on the explant motoneurons. The aforementioned effects are mediated by the PKC, although not by the activation of CREB (see section III).

Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), especialmente el Omega 3 y 6 se encuentran en grandes cantidades en el aceite de Plukenetia volubilis L. “Sacha Inchi”, estos PUFAS se trasforman en el organismo en DPA, DHA y ARA respectivamente, estos son componentes estructurales importantes en SNC y participan en su desarrollo. Numerosos trabajos concluyen que la dieta suplementada con PUFAs reducen la neurotoxicidad del metilmercurio. El presente trabajo busca evaluar el efecto neuroprotector del aceite de Plukenetia volubilis L. “Sacha Inchi” sobre la neurotoxicidad inducida por metilmercurio (MeHg) en ratas crías expuestas durante el periodo de gestación y lactancia. Para ello se utilizaron ratas nulíparas separadas aleatoriamente en cinco grupos: N°1(DMSO), N°2 (DMSO + aceite de Plukenetia volubilis L. a una dosis de 2 mL/Kg/día), N°3 (DMSO + MeHg a una dosis de 0,75 mg/Kg/día + aceite de Plukenetia volubilis L. a una dosis de 2 mL/Kg/día), N°4 (DMSO + MeHg a una dosis de 0,75 mg/Kg/día + aceite de Plukenetia volubilis L. a una dosis de 4 mL/Kg/día) y el N°5 DMSO + MeHg a una dosis de 0,75 mg/Kg/día). El MeHg y DMSO se administraron en el agua de bebida y el aceite de Plukenetia volubilis L. “sacha inchi” por vía Orogástrica. Con los objetivo de evaluar la capacidad de aprendizaje las ratas crías con tres meses de edad se sometieron al test de discriminación condicional en un laberinto en Y, para evaluar el daño tisular se utilizó la técnica de fijación del cerebelo en parafina con Eosina – Hematoxilina y el estrés oxidativo se evaluó midiendo el MDA utilizando la técnica del TBARs. Todos los resultados tienen significancia estadística y demuestran que la dieta suplementada con aceite de Plukenetia volubilis L. “sacha inchi” disminuye los efectos tóxicos del Metilmercurio en la capacidad de aprendizaje, daño tisular y estrés oxidativo. / Polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially Omega 3 and 6 are found in large quantities in the oil Plukenetia volubilis L. "Sacha Inchi" these PUFAs are transformed in the body in DPA, DHA and ARA, respectively, are structural components important in CNS and participate in its development. Numerous studies conclude that the diet supplemented with PUFAs reduce the neurotoxicity of methylmercury. This paper evaluates the neuroprotective effect of Plukenetia volubilis L. "Sacha Inchi" oil on methylmercury-induced neurotoxicity in offspring exposed during periods of pregnancy and lactation rats. Neurotoxicity was induced by methylmercury chloride (MeHgCl). For this, nulliparous rats were randomly separated into five groups: No. 1 (DMSO), No. 2 (DMSO + L. Plukenetia volubilis oil 2 ml / kg / day), No. 3 (DMSO + 0.75 mg MeHgCl / Kg / day + L. Plukenetia volubilis oil 2 ml / kg / day), No. 4 (DMSO + MeHgCl 0.75 mg / Kg / day + L. Plukenetia volubilis oil 4 mL / kg / day) and No. 5 MeHgCl DMSO + 0.75 mg / kg / day). The MeHgCl and DMSO were administered in the drinking water and Plukenetia volubilis L. "sacha inchi" oil by orogastric via. With the aim of evaluating the learning ability of rats offspring with three months , In this study they were underwent with the conditional discrimination test in a Y maze, in order to assess tissue damage clamping technology cerebellum was used in paraffin eosin - hematoxylin and oxidative stress was evaluated by measuring MDA using TBARs technique. All results are statistically significant and show that diet supplemented with Plukenetia volubilis L. "sacha inchi" oil reduces the toxic effects of methylmercury in learning ability, tissue damage and oxidative stress. Keywords: oil Plukenetia volubilis L., sacha inchi, Methylmercury, neurotoxicity, neuroprotection, learning, pregnancy and lactation.

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La retina es un tejido sensible a la luz que recubre la superficie interna del ojo. La complejidad estructural y funcional de la retina hacen de este tejido uno de los más vulnerables a alteraciones provocadas por todo tipo de lesión o enfermedad. Las enfermedades del sistema visual conllevan para los sujetos afectados una mengua en la calidad de vida. Entre las enfermedades degenerativas de tipo genético del sistema visual, la retinosis pigmentaria (RP) es una de las más importantes por incidencia y porque al día de hoy no existe terapia curativa efectiva. La RP comprende un conjunto de enfermedades neurodegenerativas de la retina que afectan principalmente a los fotorreceptores, produciendo una pérdida gradual de la visión y desembocando paulatinamente en ceguera. Sin embargo, son varias las alternativas terapéuticas que se están investigando en la actualidad con el fin curar la enfermedad. La terapia génica, las células encapsuladas, la optogenética, el trasplante de células madre y, por último, los chips electrónicos, son estrategias con un futuro esperanzador en la curación de la enfermedad. Mientras tanto, con el objetivo de retardar la evolución de la enfermedad y la degeneración del sistema visual, se ha planteado estudiar otros posibles tratamientos que puedan retrasar la evolución de la RP y mejorar la calidad de vida de los sujetos afectados. La investigación en los últimos 20 años, gracias a las nuevas tecnologías disponibles, ha demostrado que las sustancias antiapoptóticas, antioxidantes, factores tróficos y neuroprotectores influencian la degeneración retiniana. El presente trabajo persigue estudiar 2 sustancias, una de origen natural y otra sintética, con el objetivo de encontrar agentes capaces de enlentecer el decurso degenerativo de la retina en el modelo murino de retinosis pigmentaria P23H, siempre teniendo en cuenta la inquietud de encontrar un tratamiento terapéutico aplicable a seres humanos en el futuro. El objetivo de este trabajo es determinar el posible potencial terapéutico, en tratamiento crónico, de las sustancias elegidas. El Cannabinoide sintético HU210 podría retrasar o prevenir la degeneración y la muerte de los fotorreceptores y del entramado sináptico de la retina. En anteriores estudios publicados, HU210 protege las células neuronales en varias enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y el estrés isquémico. Además, se han descrito efectos sobre la reducción de la presión intraocular en relación con el glaucoma. La nicotina podría retrasar o prevenir la degeneración y la muerte de los fotorreceptores y otras neuronas de la retina, actuando sobre los receptores nicotínicos. En este caso la bibliografía es un poco más escasa y ambigua, pero quisimos comprobar si la suministración crónica de nicotina podría tener algún efecto positivo sobre el transcurso de la enfermedad retiniana. La eficacia de los tratamientos fue evaluada mediante registros electrorretinográficos, con objeto de medir la actividad funcional de la retina. También se utilizaron métodos de inmunohistoquímica con el objetivo de caracterizar los efectos de HU210 sobre la morfología y conectividad sináptica de la retina. A la vez, evaluamos eventuales efectos de HU210 sobre el peso, apetito y consumo de agua de los animales objeto de investigación. Se espera con estos estudios esclarecer el posible potencial terapéutico de estas sustancias. Este trabajo se ha realizado sobre ratas de la línea P23H-3, pero todos los resultados esperamos sean, con el tiempo necesario, aplicables a seres humanos afectados por la RP.

Les récepteurs AMPAR sont les principaux responsables de la transmission excitatrice rapide dans le système nerveux central, y compris dans les neurones d’hippocampe étudiés ici. Ils sont très dynamiques dans la membrane. Au sein des épines dendritiques, ils peuvent se déplacer par traffic membranaire entre les compartiments intracellulaires et la membrane plasmique. Une fois à la surface, ils se déplacent par diffusion latérale et peuvent s'ancrer réversiblement avec des protéines de la densité postsynaptique ou retourner dans des compartiments endocytaires. Les oligomères Aß augmentent l'endocytose des récepteurs AMPAR, diminuent la densité des épines dendritique et provoquent des défaillances globales dans la transmission synaptique excitatrice. Ces effets, sont englobés dans le terme "synaptotoxicité des oligomères Aß" et sont un domaine principal d'étude de l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. Wnt5a un ligand Wnt endogène connu pour activer la voie non-canonique dans les neurones d'hippocampe, génère une augmentation des courants excitateurs et des aggrégats de PSD95 et protége les neurones contre la synaptotoxicité des oligomères Aβ. Compte tenu du fait que Wnt5a semble contrecarrer les effets nocifs causés par les oligomères Aß, nous avons procédé à l'étude du mécanisme par lequel Wnt5a protège de la synaptotoxicité des oligomères Aβ. Cela nous a conduit à évaluer l'effet de Wnt5a sur l'un des facteurs dans la transmission glutamatergique, la dynamique des récepteurs AMPAR. En utilisant la microscopie à super-résolution dans les neurones d'hippocampe vivants et fixés, nous avons trouvé que Wnt5a module la dynamique et la localisation des récepteurs AMPAR. Plus précisément, Wnt5a stabilise les récepteurs AMPAR dans les sites synaptiques et extrasynaptiques. Ceci est corrélé avec une augmentation de la co-localisation et de l'interaction entre GluA2 et PSD95. Ces effets ne sont exercés que par l'activation non-canonique de la signalisation Wnt, à travers le ligand Wnt5a et non par les effets canoniques de Wnt7a. De manière intéressante, la pré-incubation de Wnt5a prévient la toxicité des oligomères Aß et maintient la dynamique basale des récepteurs AMPAR. Nos données suggèrent que Wnt5a empêche les effets des oligomères Aβ en favorisant leur stabilisation dans les sites synaptiques. / AMPARs (AMPARs) are responsible for most fast excitatory synaptic transmission in the central nervous system, including hippocampal neurons studied here. AMPARs are highly dynamic in the plasma membrane. Within dendritic spines, they move by membrane trafficking between intracellular compartments and the plasma membrane. Once at the surface, they move through lateral brownian diffusion and can reversibly anchor to postsynaptic density proteins or return to endocytic compartments. Aβ oligomers increase endocytosis of AMPARs, diminish dendritic spine density and cause overall failures in excitatory transmission. These effects, among others, are englobed in the term “Aβ oligomers synaptotoxicity” and are a main focus on the study of Alzheimers disease ethiology. On the contrary, Wnt5a - an endogenous Wnt ligand known to activate the non-canonical pathway in hippocampal neurons - generates an increase in excitatory currents and in clusters of PSD95 and protects neurons against Aβ oligomers synaptotoxicity. Given the fact that Wnt5a seems to counteract the distresses caused by Aβ oligomers, we proceeded to study the mechanism through which Wnt5a protects from Aβ oligomers synaptotoxicity. This led us to evaluate the effect of Wnt5a on one of the important factors in glutamatergic transmission, i.e. AMPAR receptor dynamics. By using super-resolution microscopy in live and fixed hippocampal neurons, we found that Wnt5a modulates the dynamic and localization of AMPARs. Specifically, Wnt5a stabilizes AMPARs in synaptic and extrasynaptic sites. This correlates with an increase in co-localization and interaction between GluA2 and PSD95. These effects are exerted only by non-canonical activation of Wnt signaling, through Wnt5a ligand and not by the canonical effects of Wnt7a. Interestingly, pre-incubation of Wnt5a prevents toxicity of Aβ oligomers and maintains basal AMPARs dynamics. Our data suggest that Wnt5a prevents Aβ oligomers effects by promoting their stabilization in synaptic sites. / Los receptores AMPA (AMPARs) son los principales responsables de la respuesta excitatoria rápida en el sistema nervioso central, incluyendo neuronas hipocampales, estudiadas en esta tesis. A diferencia de otros receptores glutamatérgicos, los AMPARs son altamente dinámicos. Dentro de las espinas dendríticas, se pueden mover hacia y desde compartimentos endocíticos y hacia la membrana plasmática. Una vez en la superficie, a través de difusión lateral, se pueden anclar a proteínas de la densidad postsináptica o regresar a compartimentos endocíticos. Por otro lado, los oligómeros Aβ (oAβ) aumentan la endocitosis de AMPARs, disminuyen la densidad de espinas dendríticas y causan una falla generalizada de la transmisión sináptica excitatoria. Estos efectos, entre otros, se engloban en el término “sinaptotoxicidad por oAβ” y es uno de los principales puntos de estudio en la etiología de la enfermedad de Alzheimer. Al contrario, Wnt5a un ligando endógeno conocido por activar la vía no canónica en neuronas hipocampales, genera un aumento en corrientes excitatorias y en los clusters de PSD95 y protege a las neuronas contra la sinaptotoxicidad causada por oAβ. Debido a esto, procedimos a estudiar el mecanismo por el cual Wnt5a protege de la sinaptotoxicidad causada por Aβ. Esto nos llevó a evaluar los efectos de Wnt5a en uno de los principales factores en la transmisión glutamatérgica, la dinámica de los AMPARs. Con el uso de microscopía de super-resolución en neuronas hipocampales vivas, encontramos que Wnt5a modula la dinámica y localización de los AMPARs. Específicamente, Wnt5a estabiliza los AMPARs en espinas y dendritas. Lo cual se correlaciona con un aumento en la co-localización e interacción entre GluA2 y PSD95. Estos efectos son causados únicamente por la activación no-canónica de la vía Wnt, a través del ligando Wnt5a y no por los efectos canónicos de Wnt7a. De manera interesante, la pre-incubación de Wnt5a previene la toxicicidad de los oligómeros Aβ y mantiene la dinámica basal de los AMPARs. Esta data sugiere que Wnt5a promueve la estabilización de AMPARs, previniendo los efectos synaptotóxicos de los oAβ .