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Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi

Figueiredo, Graziella Santana Feitosa 17 February 2017 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências e Tecnologias e Saúde, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-05-09T16:36:49Z No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / A doença de Chagas é endêmica da América Latina, tem como agente etiológico o parasito Trypanosoma cruzi. O tratamento da doença durante a fase crônica gera diversos efeitos colaterais. Nesse sentido, as proteases de tripanossomatídeos têm sido investigadas na busca de novos alvos terapêuticos. A dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) é uma enzima que faz parte das prolyloligopeptidases, essa família possui membros com conhecida relevância médica, dentre elas está a enzima ortóloga DPPIV humana, cuja inibição é utilizada como uma das formas de tratamento da diabetes tipo II. A DPP8Tc, foi investigada neste trabalho por meio da caracterização bioquímica e por nocaute físico dos alelos do gene dpp8tc do parasito T. cruzi da cepa CL Brener. Os resultados obtidos indicam que a DPP8Tc é uma enzima dimérica, solúvel, ativa em tampão tris 50mM em pH situado entre 7,5 e 8,0 e melhora sua atividade com aditivos. A temperatura ótima para atividade enzimática situa-se em torno dos 28ºC e substrato específico, Gly-Pro-AMC. Com o uso deste substrato, foram obtidos os parâmetros KM de 10,78 μM, Kcat de 1,67x10-3 s-1, Vmax 4,6x10-5 μmol de AMC liberado/min e Kcat/KM:1,55x10μM-1s-1. Os inibidores clássicos de proteases exercem baixa inibição enzimática da DPP8Tc. Em contrapartida, os inibidores de DPPIV exercem maior taxa de inibição entre eles o IB-7, o mais potente, inibe em 96,59% da DPP8Tc, com constante de inibição (Ki) de 8,2 nM. Outros inibidores da DPPIV apresentaram os seguintes ICs-50: KS (IV) com 95,47 nM, IB-4 com 484,9 nM e por último, KAII-23 com 2,7μM. A inibição enzimática ocorre principalmente por inibidores que possuem o grupo adamantil na sua composição química, semelhante à composição do inibidor vidaglipitina da DPPIV humana. A atividade ótima ocorre em torno dos 28ºC, temperatura requerida à sobrevivência da forma epimastigota, indicando potencial função no barbeiro. O nocaute simples do gene dpp8tc, diminuiu em 50% a atividade enzimática, em 20% a fluorescência e aumentou 2,9% a taxa de infecção do parasito DPP8Tc+. As diferenças existentes nas regiões UTRs 5’ e 3’ dos alelos do gene DPP8Tc, impediu o sucesso do nocaute duplo, sendo necessária a construção específica de um cassete direcionado para o nocaute do segundo alelo, visando conhecer por completo a função da DPP8Tc de Trypanosoma cruzi. / Chagas disease is endemic in Latin America, and has the parasite Trypanosoma cruzi as its etiological agent. Treatment of the disease during the chronic phase generates several side effects. In this sense, trypanosomatid proteases have been investigated in the search for new therapeutic targets. The dipeptidyl peptidase 8 of Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) is an enzyme that is part of the prolyloligopeptidases, this family has members with known medical relevance, among them is the human orthological enzyme DPPIV, whose inhibition is used as one of the forms of treatment of type diabetes II. DPP8Tc was investigated in this work through the biochemical characterization and physical knockout of the dpp8tc gene alleles of the T. cruzi parasite of the CL Brener strain. The results indicate that DPP8Tc is a soluble dimeric enzyme active in 50mM tris buffer at pH between 7.5 and 8.0 and improves its activity with additives. The optimal temperature for enzymatic activity is around 28ºC and specific substrate, Gly-Pro-AMC. With the use of this substrate, KM parameters of 10.78 μM, Kcat of 1.67x10-3 s-1, Vmax 4.6x10-5 μmol of released AMC / min and Kcat / KM were obtained: 1.55x10μM-1s -1. Classical protease inhibitors exert low enzymatic inhibition of DPP8Tc. In contrast, DPPIV inhibitors exert a greater inhibition rate among them, the more potent IB-7 inhibits in 96.59% of DPP8Tc, with inhibition constant (Ki) of 8.2 nM. Other DPPIV inhibitors showed the following ICs-50: KS (IV) with 95.47 nM, IB-4 with 484.9 nM and, finally, KAII-23 with 2.7 μM. Enzymatic inhibition occurs primarily by inhibitors that possess the adamantyl group in their chemical composition, similar to the composition of the human DPPIV vidagliptin inhibitor. The optimal activity occurs around 28ºC, temperature required to the survival of the epimastigote form, indicating potential function in the barber. The simple knockout of the dpp8tc gene, decreased enzyme activity by 50%, fluorescence by 20% and the infection rate of the parasite DPP8Tc+- increased by 2.9%. Differences in the 5 'and 3' UTRs regions of the DPP8Tc gene alleles prevented the success of double knockout, necessitating the specific construction of a cassette directed to the knockout of the second allele, in order to fully understand the function of DPP8Tc from Trypanosoma cruzi.
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Produção de proteases por actinobactéria isolada da rizosfera de Licania rigida Benth

COSTA, Elizianne Pereira 23 February 2017 (has links)
Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-31T22:40:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Elizianne Pereira Costa.pdf: 1981689 bytes, checksum: 0b2afb4e38bafdf78edf5fbca37ec218 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-02T17:26:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Elizianne Pereira Costa.pdf: 1981689 bytes, checksum: 0b2afb4e38bafdf78edf5fbca37ec218 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Elizianne Pereira Costa.pdf: 1981689 bytes, checksum: 0b2afb4e38bafdf78edf5fbca37ec218 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / FACEPE / Proteases microbianas são muito utilizadas na indústria, tendo papel chave no desenvolvimento de diversos processos biotecnológicos. As colagenases são um grupo de proteases que degradam a tripla hélice do colágeno e são utilizadas na indústria farmacêutica, do couro e no amaciamento de carnes. O objetivo do presente trabalho foi identificar a linhagem Streptomyces sp. através de características morfológicas, bioquímicas e técnicas moleculares, avaliar a produção de proteases em diversos substratos (gelatina, resíduo de café, farinha de soja, farelo de trigo e penas de galinha), produzir e purificar colagenase obtida a partir de fermentação submersa, caracterizar a colagenase quanto à influência da temperatura, pH, íons metálicos, surfactantes e inibidores enzimáticos, produzir peptídeos a partir da degradação de colágeno tipo I e tipo V, verificar o potencial anticoagulante dos peptídeos obtidos, e avaliar a cinética e termodinâmica da hidrólise de azocoll pela colagenase purificada. A actinobactéria foi identificada como Streptomyces antibioticus UFPEDA3421, e apresentou produção de enzimas proteolíticas quando cultivada em fermentação submersa em todos os substratos testados. As maiores atividades enzimáticas obtidas foram: protease (46,62 U/mL) em meio contendo farinha de soja, queratinase (32,96 U/mL) em meio contendo penas de galinha e protease fibrinolítica (9,3 U/mL) em meio com farinha de soja. Essas proteases não apresentaram afinidade pela resina de troca iônica e foram coletadas na fração não adsorvida. A colagenase foi produzida nos cinco substratos, apresentando maior atividade em meio contendo resíduo de café (377,50 U/mL), a partir do qual foi purificada por cromatografias de troca iônica e exclusão molecular, com atividade colagenolítica de 150,50 U/mL, atividade específica de 16.723,00 U/mg, fator de purificação de 136,7 e massa molar de 41,28 kDa. A caracterização da colagenase demonstrou que a enzima é uma metaloprotease neutra, com máxima atividade a 60 °C, pH 7.0, e possui afinidade por íons metálicos mono- e di- valentes, além de ser potencializada na presença dos surfactantes Tween 20, Tween 80 e Triton X-100. A degradação de colágeno tipo V produziu peptídeos com atividade anticoagulante que retardaram o tempo de coagulação sanguínea em 88s em comparação ao controle. Na hidrólise do azocoll, os parâmetros cinéticos obtidos da colagenase foram: Km = 27,14 mg/mol; Vmax = 714,29 mg/mol/min; Kcat = 79,9 s⁻¹, e; Kcat / Km = 2,95 ml/mg.s. Os parâmetros termodinâmicos apresentaram os seguintes valores (a 25 °C): Energia de Ativação (Ea) = 65,224 KJ/mol; Entalpia (ΔH) = 62,75 KJ/mol; Entropia (ΔS) = 1,96 J/mol; Energia Livre de Gibbs (ΔG) = 62,16 KJ/mol; Energia Livre na Ligação ao Substrato (ΔGᴇ₋s) = 8,18 KJ/mol, e; Energia Livre no Estado de Transição (ΔGᴇ₋ᴛ) = -2,64 KJ/mol. Os dados mostram potencial na produção de proteases, especificamente de colagenase, em diversos substratos pela linhagem Streptomyces antibioticus UFPEDA3421, em especial no cultivo em meio de cultura contendo resíduo de café, um resíduo abundante no Brasil. A colagenase purificada apresenta características que a qualificam para uso na produção de peptídeos bioativos. / Microbial proteases are widely used in industry, playing a key role in the development of various biotechnological processes. Collagenases are a group of proteases that degrade the triple helix structure of collagen and are used in pharmaceutical, leather and meat industry. The aim of the present work was to identify the strain Streptomyces sp. using morphological, biochemical and molecular techniques, to evaluate the production of proteases in various substrates (gelatin, coffee powder residue, soybean meal, wheat bran, and chicken feathers), to produce and purify collagenase obtained from submerged fermentation, to characterize the influence of temperature, pH, metallic ions, surfactants and enzymatic inhibitors on collagenase activity, produce peptides from degradation of type I and type V collagen, to verify the anticoagulant potential of the peptides obtained, and to evaluate the kinetics and thermodynamics of the azocoll hydrolysis by the purified collagenase. The actinobacteria was identified as Streptomyces antibioticus UFPEDA3421, and showed proteolytic enzyme production when grown in submerged fermentation in all substrates tested. The highest enzymatic activities were: protease (46.62 U/mL) in medium containing soybean meal, keratinase (32.96 U/mL) in medium containing chicken feathers and fibrinolytic protease (9.3 U/mL) in medium with soybean meal. These proteases had no affinity for the ion exchange resin and were collected in the non-adsorbed fraction. The collagenase was produced in the five substrates analyzed, showing higher activity in medium containing coffee powder residue (377.50 U/mL), from which it was purified by ion exchange and molecular exclusion chromatography, with a collagenolytic activity 150.50 U/mL, specific activity 16,723.00 U/mg, purification factor 136.7 and molar mass 41.28 kDa. The characterization of collagenase demonstrated that the enzyme is a neutral metalloprotease, with maximum activity at 60 °C, pH 7.0, has affinity for mono- and di-valent metal ions, and is potentiated in the presence of Tween 20, Tween 80 and Triton X-100 surfactants. Degradation of type V collagen produced peptides with anticoagulant activity that delayed blood coagulation time in 88s when compared to control. In the azocoll hydrolysis, the kinetic parameters obtained from collagenase were: Km = 27,14 mg/mol; Vmax = 714,29 mg/mol/min; Kcat = 79,9 s⁻¹, e; Kcat/ Km = 2,95 ml/mg.s. The thermodynamic parameters showed the following values (at 25 °C): Activation energy (Ea) = 65,224 KJ/mol; Enthalpy (ΔH) = 62,75 KJ/mol; Entropy (ΔS) = 1,96 J/mol; Gibbs free energy of activation (ΔG) = 62,16 KJ/mol; Free energy of substrate binding (ΔGᴇ₋s) = 8,18 KJ/mol, and; Free energy for transition state formation (ΔGᴇ₋ᴛ) = -2,64 KJ/mol. The data show potential in the production of proteases, specifically collagenase, in several substrates by the strain Streptomyces antibioticus UFPEDA3421, especially in culture medium containing coffee residue, a residue abundant in Brazil. Purified collagenase has characteristics that qualify it for use in the production of bioactive peptides.
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Obtenção de proteases a partir do trato digestivo de peixes neotropicais para aplicação na produção de peptídeos de colágeno

OLIVEIRA, Vagne de Melo 12 February 2015 (has links)
Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-01-22T18:23:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE VAGNE OLIVEIRA.pdf: 2880111 bytes, checksum: b546a5ff08a76d89b069ecf859947ecb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-22T18:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE VAGNE OLIVEIRA.pdf: 2880111 bytes, checksum: b546a5ff08a76d89b069ecf859947ecb (MD5) Previous issue date: 2015-02-12 / CNPq / Este trabalho objetivou obter proteases com propriedades colagenolíticas a partir dos resíduos de três espécies de peixes neotropicais (arabaiana Seriola dumerili; pescada-branca Cynoscion leiarchus; e tucunaré Cichla ocellaris), através de extração por sistema de duas fases aquosas (SDFA), visando aplicá-lo para produção de peptídeos de colágeno. Inicialmente, serino proteases foram extraídas e caracterizadas físico-quimicamente quanto à temperatura e pH ótimos, bem como estabilidade à variação desses parâmetros e verificação de seus parâmetros cinéticos (Km e Vmáx). A sensibilidade aos íons metálicos e aos inibidores naturais e sintéticos também foi avaliada. Em seguida, a atividade colagenolítica dos extratos foi mensurada, obtendo-se 106,82 U/mg (C. ocellaris), 42,44 U/mg (S. dumerili) e 98,08 U/mg (C. leiarchus). Nos testes com inibidores de serino (PMSF) e metaloproteases (EDTA) obteve-se 18,53 e 23,29 U/mg, 14,09 e 14,94 U/mg e de 37,45 e 15,55 U/mg, como atividades enzimáticas de C. ocellaris, S. dumerili e C. leiarchus, respectivamente. Proteases com propriedades colagenolíticas de C. leiarchus e de C. ocellaris obtiveram pH ótimo de 8,0 e 7,5, mantendo-se estável entre 6,5 e 11,5; temperatura ótima de 55°C, termoestável entre 25 e 60°C, respectivamente. Os íons Ca2+ e Mg2+ funcionaram como ativadores, enquanto Zn2+ e Pb2+ atuaram como inibidores, assim como a ação da Benzamidina e TLCK, inibidores específicos de tripsina. No teste de especificidade ao colágeno, a enzima de C. leiarchus, após 48 horas, clivou todos os tipos de colágeno testados, sendo eficaz na seguinte ordem: colágeno da pele de P. corruscans > colágeno da pele de O. niloticus > colágeno bovino tipo I; enquanto que, para a enzima de C. ocellaris, após 36 horas, colágeno tipo I > colágeno de pele de P. corruscans > colágeno de pele de O. niloticus. As características físico-químicas da colagenases de C. ocellaris mostraram-se mais interessantes para prosseguimento das análises. Dessa forma, foram obtidos o Km e o Vmáx como 5,92 mM e 294,40 U/mg, respectivamente. Esta enzima mostrou especificidade aos colágenos testados, durante o intervalo de 1 h a 55°C, na seguinte condição: colágeno tipo I > colágeno de pele de O. niloticus > colágeno de pele de P. corruscans. A colagenase intestinal de C. ocellaris foi recuperada por meio do sistema de duas fases aquosas (SDFA) para obtenção da enzima purificada, obtendo-se coeficiente de partição de 8.24, usando 20,0% (w/w) de PEG 8000 e 12,5% (w/w) de sal de fosfato a pH 8,0. A enzima PEG-colagenolítica ainda foi capaz de clivar o colágeno do tipo I e do colágeno extraído da pele de C. ocellaris (rendimento 2.9% de peso seco). A técnica de SDFA permitiu a remoção de contaminantes por um processo rápido, simples e econômico e funcionou como etapa principal de purificação capaz satisfazer a necessidade de isolamento para a produção de peptídeos de colágeno, como descritos no presente trabalho. A simplicidade e alto rendimento, somando investimentos mais baixos, tornam o SDFA uma opção promissora de extração de colagenases a partir de resíduos do processamento do pescado para a produção de peptídeos de colágeno, visando aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e de cosméticos. / This study aimed to obtain proteases with collagenolytic properties from the waste of three species of Neotropical fish (greater amberjack Seriola dumerili; hake Cynoscion leiarchus, and peacock bass Cichla ocellaris), through extraction by aqueous two-phase system (ATPS), to apply it in the production of collagen peptides. Initially, serine proteases were extracted and physicochemically characterized for optimum temperature and pH, as well as stability to the variation of these parameters and verification of its kinetic parameters (Km and Vmax). The sensitivity to the metal ions and natural and synthetic inhibitors was also assessed. Then, the collagenolytic activity of the extracts was measured, yielding 106.82 U/mg (C. ocellaris), 42.44 U/mg (S. dumerili) and 98.08 U/mg (C. leiarchus). Tests with inhibitors of serine (PMSF) and metalloproteinases (EDTA) yielded 18.53 and 23.29 U/mg, 14.09 and 14.94 U/mg and 37.45 and 15.55 U/mg such as enzymatic activities of C. ocellaris, S dumerili and C. leiarchus, respectively. Collagenolytic proteases with collagenolytic properties from C. leiarchus and C. ocellaris obtained optimum pH of 8.0 to 7.5, and is stable between 6.5 and 11.5; optimum temperature 55°C, thermostable between 25 and 60°C, respectively. Ca2+ and Mg2+ functioned as activators and Zn2+, and Pb2+ acted as inhibitors, as well as the action of Benzamidine and TLCK, specific inhibitors of trypsin. In the collagen specificity test enzyme of C. leiarchus, after 48 hours, cleaved all collagen types tested being effective in the following order: P. corruscans skin collagen > O. niloticus collagen skin > bovine collagen type I; while for the enzyme from C. ocellaris, after 36 hours, type I collagen > P. corruscans skin collagen > O. niloticus skin collagen. The physicochemical characteristics of the collagenase of C. ocellaris were more interesting for further analysis. Thus, there was obtained a Michaelis-Menten constant (Km) and Vmax, 5.92 mM and 294.40 U/mg, respectively. The enzyme was specific to the tested collagens, during the interval of 1 h at 55°C in the following condition: type I collagen > O. niloticus skin collagen > P. corruscans skin collagen. The intestinal collagenase C. ocellaris was recovered by means of aqueous two-phase system (ATPS) to obtain the enzyme purified to give 8.24 partition coefficient, using 20.0% (w/w) PEG 8000 and 12.5% (w/w) of pH 8.0 phosphate salt. PEG-collagenolytic enzyme was still able to cleave collagen type I and collagen extracted from skin of C. ocellaris (yield 2.9% dry weight). The ATPS allowed the removal of contaminants by a fast, simple and cost effective technique and worked as main stage of purification, meeting the need for isolation, as in the production of collagen peptides, as described in this work. The simplicity and high performance, adding lower investments, make the ATPS a promising option collagenase extraction from waste from the fish processing for the production of collagen peptides, aiming at application in the food industry, pharmaceutical and cosmetics.
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Resíduos de processamento do pintado (Pseudoplatystoma corruscans) como fonte de protease ácida e colágeno

ANDRADE, Douglas Henrique de Holanda 23 February 2015 (has links)
Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-25T18:35:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Douglas Henrique de Holanda Andrade.pdf: 1920389 bytes, checksum: 8abacdd980331f1bb47cac33257d4967 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T18:35:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Douglas Henrique de Holanda Andrade.pdf: 1920389 bytes, checksum: 8abacdd980331f1bb47cac33257d4967 (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / CNPQ / A presente tese reporta a purificação parcial e caracterização enzimática de uma protease ácida proveniente do estômago do Pseudoplatystoma corruscans, bem como o aproveitamento de resíduos deste peixe para aplicação na extração de colágeno. Neste âmbito, o primeiro capítulo tratou da caracterização enzimática de uma protease ácida do estômago do pintado e aplicação desta enzima na extração de colágeno da pele de Oreochromis niloticus. A caracterização com substratos e inibidores específicos sugere que a protease ácida trata-se de uma pepsina-símile. Esta enzima foi pouco sensível à exposição a íons metálicos como Cu2+, Cd2+, Hg2+, Ca2+, Al3+, K+, Mg2+ e Ba2+. A protease demonstrou características interessantes como alta atividade, estabilidade em pH neutro e elevada temperatura ótima. Adicionalmente colágeno ácido e pepsino-solúvel (ASC e PSC) foram extraídos da pele de O. niloticus. Pepsina comercial e pepsina-símile proveniente do estômago do pintado foram utilizadas no processo de extração e favoreceram para o aumento do rendimento. No capítulo 2, foi realizada uma purificação parcial da protease ácida do estômago do pintado. Após as três etapas da purificação (tramento térmico, fracionamento salino e cromatografia de troca iônica) obteve-se um fator de purificação de 32 vezes. SDS-PAGE mostrou bandas proteicas entre 30,7 and 94 KDa, possivelmente isoformas da pepsina. O zimograma corroborou a presença da enzima. Além disso, o uso de inibidor específico produziu evidências de que a protease trata-se de uma pepsina-símile. A caracterização físico-química da protease ácida mostrou estabilidade da fração frente ao pH neutro, além de elevada temperatura ótima. Finalmente, o capítulo três objetivou a extração de colágeno (ácido e pepsino-solúvel) da pele do pintado, bem como a caracterização dessa proteína, sugerindo o seu uso como fonte alternativa de colágeno frente aos animais terrestres. ASC e PSC foram isolados da pele do pintado, evidenciando o aumento do rendimento da extração com a adição de pepsina. SDS-PAGE e espectro de absorção UV indicaram que o colágeno estudado foi do tipo I. ASC e PSC apresentaram alta solubilidade em pH ácido. Na presença de NaCl, PSC exibiu maior solubilidade em relação ao ASC. Diante dos resultados alcançados neste trabalho, pode-se dizer que os resíduos (pele e vísceras) do pintado apresentam um grande potencial para aplicações industriais, principalmente relacionadas à obtenção de colágeno. / The present work reports on the partial purification and enzymatic characterization of a acid protease from Pseudoplatystoma corruscans stomach as well as the use of this waste for fish collagen extraction. In this context, chapter one treated the enzymatic characterization of an acidic protease from spotted sorubim stomach and application of this enzyme in collagen extraction from Oreochromis niloticus skin. The characterization with substrates and specific inhibitors suggests that it is the acid protease pepsin-like. This enzyme was not sensitive to the exposure to metal ions such as Cu2+, Cd2+, Hg2+, Ca2+, Al3+, K+, Mg2+ and Ba2+. The protease showed interesting features like high activity, stability at neutral pH and high optimum temperature. Additionally, acid and pepsin soluble collagen (ASC and PSC) were extracted from the skin of O. niloticus. Commercial pepsin and pepsin-like from the spotted sorubim stomach were used in the extraction process and favored to increase the yield. In chapter two, it was performed a partial purification of acid protease from the spotted sorubim stomach. After the three steps purification it was obtained a 32 fold purification factor. SDS-PAGE revealed protein bands of 30.7 and 94 kDa, possibly pepsin isoforms. The zymography confirmed the presence of the enzyme. Furthermore, the use of specific inhibitor produced evidence that the protease is pepsin-like. The physicochemical characterization of acid protease showed stable fraction to neutral pH and high optimum temperature. Finally, chapter three brings the collagen extraction (acid and pepsin soluble) from the spotted sorubim skin as well the characterization this protein, suggesting its use as an alternative source of collagen front of land animals. ASC and PSC were isolated from the spotted sorubim skin showing increased extraction yield with the addition of pepsin. SDS-PAGE and UV absorption spectrum indicate that collagen studied is type I. ASC and PSC showed high solubility in acid pH. In the presence of NaCl, PSC exhibited higher solubility compared to ASC. With the results reported in the present thesis, it can be said that spotted sorubim wastes (skin and visceras) show great potential for industrial applications, mainly related to obtaining collagen as an alternative source.
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Caracterização bioquímica, dinâmica molecular e propriedades imunomoduladoras da prolil oligopeptidase de Mycobacterium tuberculosis

Portugal, Brina 24 January 2014 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Laboratório de Interação Patógeno-Hospedeiro, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-11T17:03:56Z No. of bitstreams: 1 2014_BrinaPortugal.pdf: 5308132 bytes, checksum: 69ee6a201953bbfef580a53ab902a8fa (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-11T18:14:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BrinaPortugal.pdf: 5308132 bytes, checksum: 69ee6a201953bbfef580a53ab902a8fa (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-11T18:14:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BrinaPortugal.pdf: 5308132 bytes, checksum: 69ee6a201953bbfef580a53ab902a8fa (MD5) / A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização de alvos potenciais para a quimioterapia de doenças como a de Chagas, Dengue, Leishmaniose e Tuberculose tendo as proteases como principal enfoque, uma vez que estão envolvidas em processos biológicos fundamentais para a viabilidade e virulência de patógenos. Neste contexto, esta tese aborda alguns aspectos bioquímicos, estruturais e funcionais da prolil oligopeptidase de Mycobacterium tuberculosis, microrganismo responsável por desencadear uma resposta inflamatória característica da tuberculose. A prolil oligopeptidase de Mycobacterium tuberculosis (rPOPMt) revelou possuir atividade catalítica sobre o substrato N-Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC, com uma atividade ótima a pH 7,5 e temperatura ótima a 28 °C. Aditivos como NaCl, DTT e íons não influenciaram a atividade enzimática da proteína. Os parâmetros cinéticos calculados para a enzima foram Km e kcat/Km de 108 μM e 21.838 mM-1 .s-1, respectivamente, com N-Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC como substrato. Neste contexto, esta tese aborda alguns aspectos bioquímicos, estruturais e funcionais da prolil oligopeptidase de Mycobacterium tuberculosis, microrganismo responsável por desencadear uma resposta inflamatória característica da tuberculose. A prolil oligopeptidase de Mycobacterium tuberculosis (rPOPMt) revelou possuir atividade catalítica sobre o substrato N-Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC, com uma atividade ótima a pH 7,5 e temperatura ótima a 28 °C. Aditivos como NaCl, DTT e íons não influenciaram a atividade enzimática da proteína. Os parâmetros cinéticos calculados para a enzima foram Km e kcat/Km de 108 μM e 21.838 mM-1 .s-1, respectivamente, com N-Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC como substrato. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Our group aims to identify and characterize potential targets for chemotherapy for diseases such as Chagas disease, dengue, leishmaniasis and tuberculosis. Proteases are the main focus since they are involved in fundamental biological processes for viability and virulence of pathogens. In this context, this thesis reports some biochemical, structural and functional aspects of the prolyl oligopeptidase of Mycobacterium tuberculosis, the microorganism responsible for triggering an inflammatory response characteristic of tuberculosis. The prolyl oligopeptidase of M. tuberculosis (rPOPMt) showed catalytic activity towards the substrate N-Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC, with optimal pH and temperature activity at 7.5 and 28 °C, respectively. Additives such as NaCl and DTT, and ions did not affect the enzymatic activity of the protein. The kinetic parameters for the enzyme using N-Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC as substrate were calculated showing Km and kcat/km of 108 μM and 21.838 mM-1.s-1, respectively. The enzyme was only susceptible to serine protease inhibitors such as AEBSF and TPCK, with a residual activity of 33 and 66 %, respectively. In presence of Z-Pro-prolinal, a specific inhibitor of prolyl oligopeptidase, a Ki value of 16.87 nM was calculated. Studies of homology modeling and molecular dynamics permitted the achievement of POPMt theoretical structure, and as for other POPs, the structure possess two domains: the catalytic and β-propeller domain, moreover, the catalytic site comprises the triad Ser-Asp-His is conserved along POPs. When the recombinant protein was used in a vaccine formulation with CpG DNA, it was observed a higher level of IgG2a antibody known as a marker for Th1-type immune response. The immunomodulatory properties of POPMt in triggering immune responses in vitro shows that the secretion of cytokines analyzed, TNF-α, IL-6, IL-12p70, IL-23, IL-10, IL-1β and MCP-1 induced by POPMt were largely dependent on the activity of the enzyme. Thus, the recombinant protein can help to determine the role of the native POP in M. tuberculosis.
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Análise funcional preliminar da dipeptidil peptidase 8 e da otubaína de Trypanosoma cruzi por meio de nocaute gênico

Figueirêdo, Débora Torres Alves January 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-07-29T13:45:26Z No. of bitstreams: 1 2013_DeboraTorresAlvesFigueiredo.pdf: 6275777 bytes, checksum: 517b44576fd1e1f2de64e008db5d0083 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-08-06T20:23:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DeboraTorresAlvesFigueiredo.pdf: 6275777 bytes, checksum: 517b44576fd1e1f2de64e008db5d0083 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T20:23:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DeboraTorresAlvesFigueiredo.pdf: 6275777 bytes, checksum: 517b44576fd1e1f2de64e008db5d0083 (MD5) / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanozoma cruzi, é um problema de saúde pública, principalmente na América Latina, e os tratamento; disponíveis são muitas vezes ineficazes, além de causar efeitos colaterais graves. O nosso grupo de pesquisadores tem como objetivo identificar e caracterizar proteases do parasito para a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos. Neste trabalho, apresentamos um estudo preliminar sobre a função dos genes da dipepdil-peptidase 8 (dpp8tc) e da otubaina (otutc), uma serino e uma cisteíno protease de T. cruzi, respectivamente. A DPP8 é uma protease da família DPPIV, que é conhecida pela sua importante função de clivar ligações peptídicas com prolina na segunda posição. Estas peptidases são importantes no processamento e degradação de peptideos como hormônios e neuropeptídeos. A OTU pertence a família das enzimas deubiquitinantes, importantes na regulação de alguns genes relatados em vários processos biológicos, como ativação da resposta imune. A DPP8 e a OTU são expressos em T. cruzi e se apresentam em cópia única no genoma deste parasito, o que nos permitiu realizar o estudo, por meio de nocaute físico, da função dessas proteínas na viabilidade e no processo de infecção do protozoário. Assim, cassetes para a realização do nocaute foram construídos com o gene de neomicina-fosfotransferase (neo) flanqueado pelas regiões 5`UTR. e 3`UTR do gene dpp8tc ou otutc. Esses cassetes foram transfectados em parasitos epimastigotas da cepa CL-Brener, produzindo parasitos resistentes a G418. Algumas PC Rs foram realizadas a fim de se verificar a presença dos genes dpp8tc, otutc e neo no genoma dos parasitos nocauteados, assim como no genoma dos parasitos controle não transformados (selvagens), que confirmaram a presença de uma outra cópia no genoma. Além disso, outras PCRs confirmaram a correta inserção do cassete no local do gene de interesse, indicando a ocorrência de nocaute simples (de um único alelo), o que demonstrou a eficácia do protocolo. O efeito do nocaute simples dos genes foi analisado por meio da observação do crescimento in vitro, em que os parasitos simples mutantes para otutc cresceram a uma taxa 22,5% inferior que o selvagem, ao passo que essa taxa nos mutantes simples para dpp8tc foi 25% superior a do selvagem Os parasitos nocauteados foram ainda capazes de se diferenciar em tripomastigotas e desafiados a infectar células L6 de mioblastos de camundongos. Os mutantes para otutc foram capazes de infectar 1.65 e 3 vezes mais células em 3 e 24 horas de infecção, respectivamente, comparado ao selvagem, enquanto nos mutantes para dpp8tc este aumento foi de 1,76 e 1,65 a mais que o selvagem. O teste enzimático in vitro para DPP8 no substrato Gly-Pro-AMC demonstrou haver atividade enzimática de 165% nos mutantes para o gene dessa enzima, sendo esse valor superior ao apresentado pelo selvagem (100%). Os resultados obtidos no presente estudo são preliminares e apontam estratégias futuras de pesquisa, tal como a análise do nocaute duplo (em ambos os alelos) paia os genes dpp8tc e otutc e a infecção in vivo de forma a contribuir com o entendimento da função dessas proteínas no parasito. / Chagas disease, caused by the protozoan Tripanosoma cruzi. is a public health burden, mainly in Latin America since available treatments are often ineffective and cause severe side effects. The aim of our research team is to study parasite proteases as potential new therapeutic targets. In this work. we present a preliminary functional study of dipeptidyl-peptidase 8-like (dpp8tc) and otubain (otutc), a serine and a cysteine protease of T. cruzi. respectively. DPPs are prolyl oligopeptidase family members involved in hormone processing or inactivation in mammalians. Otu belong to the deubiquitylating enzymes (DUBs) family, important in gene regulation and reported in several biological processes such as immune response activation The dpp8tc and otutc are expressed in T. cruzi and is present as a single copy gene in the genome, which allows us to study the genes by knockout (KO), the role of these proteins in the parasite viability and infection process. The KO cassettes were constructed with neomycin phosphotransferase gene (neo) flanked by 5’UTR and 3’UTR of dpp8tc or otutc. They were transfected into epimastigotes (CL-Brener strain) producing G418-resistant parasites. Several PCRs were carried out to verify the presence of dpp8tc otutc. and neo in the KO and wild type (WT) parasite genome. In addition, other PCR confirmed the correct insertion of the cassette in place of the target gene, in a single-allele knockout, demonstrating the efficacy of the protocol. The effect of the single-allele knockout was analyzed by observation of in vitro growth, in which the single mutants for otutc grew at a rate 22.5% lower than the WT, whereas the rate for the dpp8tc single mutants was 25% higher than WT. The mutants could differentiate into trypomastigotes and when challenged to infect L6 cells of mice myoblasts, the otutc mutants were able to infect 165% and 290.57% of cells. 3 and 24 hours after infection, respectively, while WT was able to infect 100%. These values for the dpp8tc mutants were 176.89% and 165.21%. 3 and 24 hours after infection, respectively. The in vitro enzymatic test for DPP8 on the substrate Gly-Pro-AMC demonstrated enzymatic activity of 165% in the mutants for the gene of this enzyme, when compared to wild type, this value being higher than drat presented by the WT (100%). The results obtained in this study are preliminary and suggest future research strategies, such as the analysis of double-allele knockout for the genes dpp8tc and otutc as well as in vivo mice infection in order to contribute to the understanding of the hole of these proteins in T. cruzi.
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Preparação e caracterização de compósitos magnéticos contendo Azocaseína para purificação de tripsina

ALVES, Maria Helena Menezes Estevam 21 February 2017 (has links)
Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-07-25T20:10:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Maria Helena Menezes Estevam Alves.pdf: 6983006 bytes, checksum: 85aa90c9abe94339acd77b4d9115bfd0 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-07-27T22:22:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Maria Helena Menezes Estevam Alves.pdf: 6983006 bytes, checksum: 85aa90c9abe94339acd77b4d9115bfd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-27T22:22:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Maria Helena Menezes Estevam Alves.pdf: 6983006 bytes, checksum: 85aa90c9abe94339acd77b4d9115bfd0 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / CAPES / Proteases estão entre as mais produzidas no mundo. Dentre elas a tripsina é a mais utilizada em diversas áreas da biotecnologia. A purificação de biomoléculas por partículas magnéticas baseia-se na interação dos ligantes, componentes químicos presentes na superfície das partículas, com a molécula alvo. Neste trabalho, foram preparados dois compósitos magnéticos: o primeiro a partir de azocaseína e óxido de ferro (mAzo) e o segundo, a partir de partículas de óxido de ferro revestidas com polianilina tratadas com azocaseína (mPANI-Azo). Os novos compósitos foram avaliados como matriz para a purificação de tripsina de extrato bruto de Tilapia (Oreochromis niloticus). Uma caracterização físico-química do compósito magnético (mAzo) foi também realizada para descrever as principais características do material sintetizado. Os resultados da purificação mostraram que as partículas mAzo e mPANI-Azo permitiram purificar o extrato bruto de peixe, sem nenhum pré tratamento, 61 vezes e 43 vezes, respectivamente. A eletroforese (SDS-PAGE) da alíquota purificada revelou uma banda a 24 kDa, valor compatível com tripsina obtida de vísceras de tilapia. As analises das técnicas de caracterização (MEV-EDX, DRX, FTIR e medidas de magnetização) evidenciaram o sucesso da síntese do compósito magnético (mAzo). Além disso, foi observado que as partículas mAzo são heterogêneas e apresentam rápida resposta magnética. Por fim, ao purificar a tripsina com precipitação, dialise e mAzo obteve-se um aumento da purificação de até 220 vezes. Concluímos que o compósito magnético mAzo mostrou ser uma matriz eficiente para a purificação de e o reuso do manteve a qualidade da purificação. Nesta pesquisa desenvolvemos uma técnica de purificação simples, eficaz e econômica que pode ser utilizada para a purificação de proteases utilizando as partículas mAzo como matriz. / Proteases are among the most produced in the world. Among them trypsin is the most used in several areas of biotechnology. The purification of biomolecules by magnetic particles is based on the interaction of the binders, chemical components present on the surface of the particles, with the target molecule. In this work, two magnetic composites were prepared: the first from azocasein and iron oxide (mAzo) and the second from iron oxide particles coated with azacasein-treated polyaniline (mPANI-Azo). The new composites were evaluated as a matrix for the purification of trypsin from Tilapia (Oreochromis niloticus) crude extract. A physical-chemical characterization of the magnetic composite (mAzo) was also performed to describe the main characteristics of the synthesized material. The results of the purification showed that the mAzo and mPANI-Azo particles allowed to purify the fish crude extract, without any pretreatment, 61 times and 43 times, respectively. Electrophoresis (SDS-PAGE) of the purified aliquot revealed a band at 24 kDa, trypsin compatible value obtained from tilapia viscera. The analysis of the characterization techniques (SEM-EDX, XRD, FTIR and measurements of magnetization) evidenced the success of the synthesis of the magnetic composite (mAzo). In addition, it was observed that the mAzo particles are heterogeneous and have a fast magnetic response. Finally, after precipitation, dialysis and mAzo treatment, a purification increase up to 220 times was obtained. We conclude that the magnetic composite mAzo has proved to be an efficient matrix for the purification and reuse of the quality of the purification. In this research we have developed a simple, efficient and economical purification technique that can be used for the purification of proteases using the mAzo particles as matrix.
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Otimização da produção, caracterização enzimática e purificação de queratinases de fungos procedentes do solo, estocados na Micoteca URM

SOUSA, Minelli Albuquerque 20 December 2011 (has links)
Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-03T21:24:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-17T22:19:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T22:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) Previous issue date: 2011-12-20 / CAPES / Materiais queratinosos são insolúveis e resistentes à degradação por enzimas proteolíticas comuns, tornando-se importante o estudo de microrganismos produtores de queratinases para ser usado na indústria biotecnológica. O objetivo deste estudo foi selecionar fungos isolados do solo armazenados na Micoteca URM, para ser empregado na síntese de queratinases extracelular, caracterizar as cepas quanto a capacidade queratinolítica, efeito de diferentes substratos, da composição do meio e das condições de cultivo na produção de queratinase em cultivo submerso, otimizara aprodução, caracterizar e purificar a enzima. Para a determinação da capacidade de utilizar substratos queratinosos, 50 cepas fúngicas foram utilizadas. Elas foram cultivadas em fermentação submersa em meio contendo sais e penas durante 10 dias a 30 °C em agitador orbital a 120 rpm. Para avaliar a capacidade queratinolítica e o efeito de diferentes substratos na produção da queratinase foram utilizadas as seguintes cepas: Aspergillus sulphureus URM 5029, A. avenaceus URM5051, A. sclerotiorum URM5586 e Trichoderma aureoviride URM5574. Com a linhagem que apresentou a melhor produção e o melhor substrato, foi realizado estudos do efeito da composição do meio, condições de cultivo na produção da queratinase, otimização da produção, caracterização e purificação da enzima. Aspergillus sulphureus, Trichoderma aureoviride, Aspergillus avenaceus e A. sclerotiorum mostraram os melhores resultados com 7,35 U /ml, 7,2 U/ml, 6,7 U/ml e 6,05 U/ml de atividade queratinolítica, respectivamente. As espécies testadas se destacaram na colonização dos diferentes substratos queratinosos e o melhor substrato para a produção de queratinase foi a pena de frango. A produção de queratinase por A. sulphureus foi incrementada nas seguintes condições: 2 g/50 ml de pena de frango, 0,1 g/50 ml de NaNo₃, 0,001 g/50 ml de CaCl₂, pH 7,8, 35ºC, 160 rpm e 10⁶ esporos/ml em cultivo líquido submerso em 10 dias de incubação. A partir desses resultados foi realizado um planejamento fatorial completo 2⁴, para otimizar a produção da queartinase, e as melhores condições de produção foram: pH 8,0, 36 °C, 120 rpm, 2,5% (p/v) de penas de frango em 10 dias, com a máxima atividade de 10,06 U/ml, mostrando um aumento de 1,44 vezes. A queratinase de A. sulphureus apresentou melhor atividade em pH 10,0 e 35 ºC e é pouco inibida na presença de íons metais (Co²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺) e PMSF e fortemente inibida por EDTA, sugerindo ser uma metaloprotease. As melhores condições para purificação da queratinase de Aspergillus sulphureus, após análise estatística, foram: massa molecular do PEG, 8000; concentração do PEG, 20% e concentração de citrato 15%, apresentando aumento de pureza e recuperação queratinolítica de 25,04 e 184,9%, respectivamente. Com base nos resultados, concluímos que a preservação, sob óleo mineral é satisfatório para manter a viabilidade e a taxonomia das culturas por longos períodos de tempo e os microorganismos do solo podem ser uma interessante fonte de fungos produtores de queratinases. Além disso a capacidade da queratinase de A. sulphureus ser estável em uma ampla faixa de pH (6,5–9,0) e temperatura (25–60 °C) sugere o uso desta cepa em processos biotecnológicos industriais. / Keratinous materials are insoluble and resistant to degradation by common proteolytic enzymes, making it important to study keratinases producing microorganisms for use in the biotechnology industry. The aim of this study was to select fungi isolated from soil stored in the URM Culture Collection, to be employed in the synthesis of extracellular keratinases, characterize the strains and the ability queratinolítica, effect of different substrates, the medium composition and cultivation conditions in the production of keratinase in submerged culture, aprodução optimize, characterize and purify the enzyme. To determine the ability to use keratinous substrates, 50 fungal strains were used. They were grown in submerged fermentation in medium containing salts and penalties for 10 days at 30 ° C on an orbital shaker at 120 rpm. To assess the ability queratinolítica and the effect of different substrates on keratinase production we used the following strains: Aspergillus sulphureus URM 5029, A. avenaceus URM5051, A. sclerotiorum URM5586 and Trichoderma aureoviride URM5574. With a lineage that had the best production and best substrate, was carried out studies of the effect of medium composition, cultivation conditions on keratinase production, production optimization, characterization and purification of the enzyme. Aspergillus sulphureus, Trichoderma aureoviride, Aspergillus avenaceus and A. sclerotiorum showed the best results with 7.35 U / ml, 7.2 U / ml, 6.7 U / ml and 6.05 U / ml keratinolytic activity, respectively. The species tested stood out in the colonization of different keratinous substrates and the best substrate for the production of keratinase was the poultry feathers. Keratinase production by A. sulphureus was increased in the following conditions: 2 g/50 ml of poultry feathers, 0.1 g/50 ml of NaNO3, CaCl2 0.001 g/50 ml, pH 7.8, 35 ° C, 160 rpm and 106 spore/ml in submerged in liquid culture 10 days of incubation. From these results we carried out a full 2⁴ factorial design to optimize the production of queartinase, and the best production conditions were: pH 8.0, 36 ° C, 120 rpm, 2.5% (w/v) feather chicken in 10 days, with maximum activity of 10.06 U/ml, showing an increase of 1.44 times. The keratinase of A. sulphureus showed better activity at pH 10.0 and 35 ° C and is slightly inhibited in the presence of metal ions (Co²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺) and PMSF and strongly inhibited by EDTA, suggesting that a metalloprotease. The best conditions for purification of keratinase from Aspergillus sulphureus, after statistical analysis were: molecular weight of PEG 8000, PEG concentration, 20% and 15% concentration of citrate, an increase of purity and keratinolytic recovery of 25.04 and 184.9%, respectively. Based on the results, we conclude that the preservation under mineral oil is satisfactory to maintain the viability and taxonomy of cultures for long periods of time and soil microorganisms may be an interesting source of keratinases producing fungi. Furthermore the ability of keratinase of A. sulphureus be stable over a wide pH range (6.5 to 9.0) and temperature (25-60 ° C) suggests the use of this strain in industrial biotechnology processes.
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Caracterização e purificação parcial de proteases de Ulomoides dermestoides (Coleptera, Tenebrionidae)

COSTA, Felipe Rocha da 27 February 2014 (has links)
Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-04T22:57:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Felipe Rocha da Costa.pdf: 741317 bytes, checksum: 923dc646ea34ede74f15dfc2ce5f31b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-17T22:59:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Felipe Rocha da Costa.pdf: 741317 bytes, checksum: 923dc646ea34ede74f15dfc2ce5f31b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T22:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Felipe Rocha da Costa.pdf: 741317 bytes, checksum: 923dc646ea34ede74f15dfc2ce5f31b1 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / CAPES / Ulomoides dermestoides é um besouro cosmopolita, praga de produtos armazenados, nativo da Ásia. Popularmente conhecido como besouro do amendoim, e considerado um “remédio” na medicina popular sendo indicada sua utilização em casos como asma e artrite. Alguns trabalhos têm demonstrado que metabólitos obtidos a partir do U. dermestoides apresentam atividade biológica como, por exemplo, ação anti-inflamatória e citotóxica. Este trabalho teve como objetivo purificar proteases de U. dermestoides e caracterizar frente a substratos específicos, variação de temperatura e diferentes faixas de pH. Para tanto, uma criação de U. dermestoides foi mantida no laboratório de Engenharia Biomédica submetida a temperatura de 25ºC ±2 e umidade de 50-60%. O extrato foi preparado utilizando-se 10g de besouro triturados e homogeneizados em 20ml do tampão de extração (Tris-HCl 10mM, NaCl 130mM, KCl 5mM pH7,4) por 30min. Após centrifugação (8000 rpm, 20min) o sobrenadante foi coletado para realização dos testes propostos. A atividade proteolítica total foi avaliada utilizando-se o teste da hidrolise da azocaseína com leitura em comprimento de onda de 366nm. Os testes enzimáticos também foram realizados utilizando-se substratos específicos para serino protesases (Bapna/Tripsina e Sucphenan/Quimiotripsina) sendo a leitura realizada em comprimento de onda de 405nm. Para a caracterização térmica o extrato foi aquecido por 30mim nas temperaturas de 40ºC, 50ºC, 60ºC e 100ºC. O pH ótimo foi determinado aplicando o extrato bruto a uma faixa de pH variando do pH1 ao pH10. A purificação foi realizada usando cromatografia em coluna de exclusão molecular HiPrep 16/60 Sephacryl S-100HR e em uma coluna de troca iônica DEAE HiprepTM FF 16/10, ambos acoplados ao sistema AKTA-Prime. A leitura da atividade proteolítica mostra que o extrato de U. dermestoides apresentou elevada atividade (75,5U). A atividade proteolítica permaneceu mesmo após o material ser aquecido 100ºC (18,3U). A atividade enzimática demonstrou que o este inseto possui pelo menos uma enzima da classe serino protease do tipo tripsina, porem não apresentou proteases do tipo quimmiotripsina. A atividade enzimática revelou também que as serino proteases mantiveram sua atividade catalítica a 40ºC e na faixa de pH entre o pH3 e o pH8. A purificação mostrou que a enzima obtida é pequena apresentado peso molecular aproximado de 20,6KDa apos a exclusão molecular e 22,3 KDa após eletroforese. Por fim, a serino protease purificada apresentou Km =0,62 mM e Vmₐₓ =0,33 x 10⁻³ μmol BApNA/min. Os resultados obtidos apontam a necessidade de técnicas adicionais na purificação das enzimas de U. dermestoides visando a caracterização mais precisa da protease identificada e identificação e caracterização da protease termoestável. / Ulomoides dermestoides is a cosmopolitan beetle, pest of stored products and native from Asia. Popularly known as “besouro do amendoim” it is considered a medicine resource in folk medicine being indicated in cases such as asthma and arthritis. Some reports have demonstrated that metabolites obtained from the U. dermestoides exhibit biological activity eg. anti-inflammatory and cytotoxic activity. This paper aims to purify U. dermestoides proteases and characterize in relation to the specific substrates, variation of temperature and pH ranges and by eletrophoretic and zimography assays. For this purpose, Stock cultures of U. dermestoides were kept in the Laboratório de Engenharia Biomédica from Universidade Federal de Pernambuco at a relative humidity of 50-60% and temperature of 25 ±2ºC. Raw peanuts were offered as food source to beetles. Adult males and females were crushed for preparation of extracts and homogenized in 20 ml of extraction buffer (10mM Tris-HCl, 130 mm NaCl, 5mM KCl, pH 7, 4) for 30min. After centrifugation (8000 rpm, 20 min) the supernatant was saved for later use. The proteolytic activity was assessed using the azocaseinolitic assay for general proteases, read at a wavelength of 366nm and assessed by the specific substrates BApNA and SucPHenan, read at a wavelength of 405nm. Extract thermal an pH characterization were performed by heating crude extract for 30 minutes at temperatures of 40ºC, 50ºC, 60ºC and subjecting crude extract to a pH range from 1 to 10, respectively. Purification was carried out using gel filtration chromatography column HiPrep 16/60 Sephacryl S-100HR and an ion exchange Hiprepᵀᴹ 1D39 DEAE FF 16/10 column, both coupled to AKTA-Prime system. Proteolytic activity shows that the extract of U. dermestoides presents high proteolitic activity (75.5U). The proteolytic activity remains even when the material is heated to 100ºC (18.3U). The enzyme activity demonstrated that this insect has at least one enzyme of the serine protease class of the trypsin but does not presents chymotripsin type. The enzymatic activity also revealed that serine proteases maintained its catalytic activity at 40ºC and at pH values ranging from pH3 and pH8 with maximal activity at pH=7. Purification showed that the enzyme obtained is small and presents approximate molecular weight of 20.6 kDa on gel filtration and 22.3 kDa on electrophoresis. Zimography assay displays tow bands presenting caseinolitic activity weighting 49,5 and 43,9, respectivey. Finally, the purified serine protease showed Km = 0.62 mM Vmₐₓ = 0.33 x 10⁻³ μmol BApNA/min. The results indicate the need for additional techniques in order to completely purification of U. dermestoides proteases aiming to a more precisely characterization and identify and characterize the thermostable protease.
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Detecção e caracterização parcial de colagenases obtidas de dermatófitos esticados na coleção de culturas Micoteca URM

de Lima Ferreira Junior, Djair January 2006 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6479_1.pdf: 326813 bytes, checksum: 6a19f07bcd3d7b7fc5a6b89d4f86cc73 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O grupo de fungos dermatófitos, em seus principais gêneros, tem sido citado na literatura como produtor de várias enzimas proteolíticas, dentre elas a colagenase tem sido isolada desde 1967. Neste trabalho, trinta amostras de dermatófitos foram testadas quanto à capacidade de degradar gelatina em meio sólido. Para esta seleção em meio sólido foram testadas espécies de Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis e Microsporum gypseum, das quais foram escolhidas aquelas que apresentaram maiores diâmetros de colônia, para realizar-se a produção enzimática em cultivo liquido submerso, onde foram determinados a biomassa, pH, atividade proteásica, colagenolítica e conteúdo protéico. A maior atividade proteásica e colagenolítica foi obtida no quinto dia de cultivo na fase exponencial de crescimento, onde o pH do meio de cultura atingiu a faixa alcalina.O extrato bruto da enzima do maior produtor tanto de protease como de colagenase, o Microsporum gypseum, foi caracterizado quanto ao efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade na enzima, bem como avaliado o efeito de inibidores. O pH ótimo da enzima deste microrganismo foi pH igual a 9,0 e a temperatura ótima foi a 70º C. A enzima apresentou-se estável à temperatura de até 80º C, retendo cerca de 32% de sua atividade durante 90 minutos de incubação. Quanto à estabilidade da colagenase ao pH, esta apresentou uma atividade residual de 116% no pH 9,0 durante o período do ensaio (90 min). A enzima sofreu inibição pelo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), confirmando a inclusão desta enzima no grupo das metaloproteases

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