Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-07-29T13:45:26Z
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2013_DeboraTorresAlvesFigueiredo.pdf: 6275777 bytes, checksum: 517b44576fd1e1f2de64e008db5d0083 (MD5) / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanozoma cruzi, é um problema de saúde pública, principalmente na América Latina, e os tratamento; disponíveis são muitas vezes ineficazes, além de causar efeitos colaterais graves. O nosso grupo de pesquisadores tem como objetivo identificar e caracterizar proteases do parasito para a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos. Neste trabalho, apresentamos um estudo preliminar sobre a função dos genes da dipepdil-peptidase 8 (dpp8tc) e da otubaina (otutc), uma serino e uma cisteíno protease de T. cruzi, respectivamente. A DPP8 é uma protease da família DPPIV, que é conhecida pela sua importante função de clivar ligações peptídicas com prolina na segunda posição. Estas peptidases são importantes no processamento e degradação de peptideos como hormônios e neuropeptídeos. A OTU pertence a família das enzimas deubiquitinantes, importantes na regulação de alguns genes relatados em vários processos biológicos, como ativação da resposta imune. A DPP8 e a OTU são expressos em T. cruzi e se apresentam em cópia única no genoma deste parasito, o que nos permitiu realizar o estudo, por meio de nocaute físico, da função dessas proteínas na viabilidade e no processo de infecção do protozoário. Assim, cassetes para a realização do nocaute foram construídos com o gene de neomicina-fosfotransferase (neo) flanqueado pelas regiões 5`UTR. e 3`UTR do gene dpp8tc ou otutc. Esses cassetes foram transfectados em parasitos epimastigotas da cepa CL-Brener, produzindo parasitos resistentes a G418. Algumas PC Rs foram realizadas a fim de se verificar a presença dos genes dpp8tc, otutc e neo no genoma dos parasitos nocauteados, assim como no genoma dos parasitos controle não transformados (selvagens), que confirmaram a presença de uma outra cópia no genoma. Além disso, outras PCRs confirmaram a correta inserção do cassete no local do gene de interesse, indicando a ocorrência de nocaute simples (de um único alelo), o que demonstrou a eficácia do protocolo. O efeito do nocaute simples dos genes foi analisado por meio da observação do crescimento in vitro, em que os parasitos simples mutantes para otutc cresceram a uma taxa 22,5% inferior que o selvagem, ao passo que essa taxa nos mutantes simples para dpp8tc foi 25% superior a do selvagem Os parasitos nocauteados foram ainda capazes de se diferenciar em tripomastigotas e desafiados a infectar células L6 de mioblastos de camundongos. Os mutantes para otutc foram capazes de infectar 1.65 e 3 vezes mais células em 3 e 24 horas de infecção, respectivamente, comparado ao selvagem, enquanto nos mutantes para dpp8tc este aumento foi de 1,76 e 1,65 a mais que o selvagem. O teste enzimático in vitro para DPP8 no substrato Gly-Pro-AMC demonstrou haver atividade enzimática de 165% nos mutantes para o gene dessa enzima, sendo esse valor superior ao apresentado pelo selvagem (100%). Os resultados obtidos no presente estudo são preliminares e apontam estratégias futuras de pesquisa, tal como a análise do nocaute duplo (em ambos os alelos) paia os genes dpp8tc e otutc e a infecção in vivo de forma a contribuir com o entendimento da função dessas proteínas no parasito. / Chagas disease, caused by the protozoan Tripanosoma cruzi. is a public health burden, mainly in Latin America since available treatments are often ineffective and cause severe side effects. The aim of our research team is to study parasite proteases as potential new therapeutic targets. In this work. we present a preliminary functional study of dipeptidyl-peptidase 8-like (dpp8tc) and otubain (otutc), a serine and a cysteine protease of T. cruzi. respectively. DPPs are prolyl oligopeptidase family members involved in hormone processing or inactivation in mammalians. Otu belong to the deubiquitylating enzymes (DUBs) family, important in gene regulation and reported in several biological processes such as immune response activation The dpp8tc and otutc are expressed in T. cruzi and is present as a single copy gene in the genome, which allows us to study the genes by knockout (KO), the role of these proteins in the parasite viability and infection process. The KO cassettes were constructed with neomycin phosphotransferase gene (neo) flanked by 5’UTR and 3’UTR of dpp8tc or otutc. They were transfected into epimastigotes (CL-Brener strain) producing G418-resistant parasites. Several PCRs were carried out to verify the presence of dpp8tc otutc. and neo in the KO and wild type (WT) parasite genome. In addition, other PCR confirmed the correct insertion of the cassette in place of the target gene, in a single-allele knockout, demonstrating the efficacy of the protocol. The effect of the single-allele knockout was analyzed by observation of in vitro growth, in which the single mutants for otutc grew at a rate 22.5% lower than the WT, whereas the rate for the dpp8tc single mutants was 25% higher than WT. The mutants could differentiate into trypomastigotes and when challenged to infect L6 cells of mice myoblasts, the otutc mutants were able to infect 165% and 290.57% of cells. 3 and 24 hours after infection, respectively, while WT was able to infect 100%. These values for the dpp8tc mutants were 176.89% and 165.21%. 3 and 24 hours after infection, respectively. The in vitro enzymatic test for DPP8 on the substrate Gly-Pro-AMC demonstrated enzymatic activity of 165% in the mutants for the gene of this enzyme, when compared to wild type, this value being higher than drat presented by the WT (100%). The results obtained in this study are preliminary and suggest future research strategies, such as the analysis of double-allele knockout for the genes dpp8tc and otutc as well as in vivo mice infection in order to contribute to the understanding of the hole of these proteins in T. cruzi.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/13879 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Figueirêdo, Débora Torres Alves |
| Contributors | Charneu, Sébastien, Bastos, Izabela Marques Dourado |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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