Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências e Tecnologias e Saúde, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-05-09T16:36:49Z No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / A doença de Chagas é endêmica da América Latina, tem como agente etiológico o parasito Trypanosoma cruzi. O tratamento da doença durante a fase crônica gera diversos efeitos colaterais. Nesse sentido, as proteases de tripanossomatídeos têm sido investigadas na busca de novos alvos terapêuticos. A dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) é uma enzima que faz parte das prolyloligopeptidases, essa família possui membros com conhecida relevância médica, dentre elas está a enzima ortóloga DPPIV humana, cuja inibição é utilizada como uma das formas de tratamento da diabetes tipo II. A DPP8Tc, foi investigada neste trabalho por meio da caracterização bioquímica e por nocaute físico dos alelos do gene dpp8tc do parasito T. cruzi da cepa CL Brener. Os resultados obtidos indicam que a DPP8Tc é uma enzima dimérica, solúvel, ativa em tampão tris 50mM em pH situado entre 7,5 e 8,0 e melhora sua atividade com aditivos. A temperatura ótima para atividade enzimática situa-se em torno dos 28ºC e substrato específico, Gly-Pro-AMC. Com o uso deste substrato, foram obtidos os parâmetros KM de 10,78 μM, Kcat de 1,67x10-3 s-1, Vmax 4,6x10-5 μmol de AMC liberado/min e Kcat/KM:1,55x10μM-1s-1. Os inibidores clássicos de proteases exercem baixa inibição enzimática da DPP8Tc. Em contrapartida, os inibidores de DPPIV exercem maior taxa de inibição entre eles o IB-7, o mais potente, inibe em 96,59% da DPP8Tc, com constante de inibição (Ki) de 8,2 nM. Outros inibidores da DPPIV apresentaram os seguintes ICs-50: KS (IV) com 95,47 nM, IB-4 com 484,9 nM e por último, KAII-23 com 2,7μM. A inibição enzimática ocorre principalmente por inibidores que possuem o grupo adamantil na sua composição química, semelhante à composição do inibidor vidaglipitina da DPPIV humana. A atividade ótima ocorre em torno dos 28ºC, temperatura requerida à sobrevivência da forma epimastigota, indicando potencial função no barbeiro. O nocaute simples do gene dpp8tc, diminuiu em 50% a atividade enzimática, em 20% a fluorescência e aumentou 2,9% a taxa de infecção do parasito DPP8Tc+. As diferenças existentes nas regiões UTRs 5’ e 3’ dos alelos do gene DPP8Tc, impediu o sucesso do nocaute duplo, sendo necessária a construção específica de um cassete direcionado para o nocaute do segundo alelo, visando conhecer por completo a função da DPP8Tc de Trypanosoma cruzi. / Chagas disease is endemic in Latin America, and has the parasite Trypanosoma cruzi as its etiological agent. Treatment of the disease during the chronic phase generates several side effects. In this sense, trypanosomatid proteases have been investigated in the search for new therapeutic targets. The dipeptidyl peptidase 8 of Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) is an enzyme that is part of the prolyloligopeptidases, this family has members with known medical relevance, among them is the human orthological enzyme DPPIV, whose inhibition is used as one of the forms of treatment of type diabetes II. DPP8Tc was investigated in this work through the biochemical characterization and physical knockout of the dpp8tc gene alleles of the T. cruzi parasite of the CL Brener strain. The results indicate that DPP8Tc is a soluble dimeric enzyme active in 50mM tris buffer at pH between 7.5 and 8.0 and improves its activity with additives. The optimal temperature for enzymatic activity is around 28ºC and specific substrate, Gly-Pro-AMC. With the use of this substrate, KM parameters of 10.78 μM, Kcat of 1.67x10-3 s-1, Vmax 4.6x10-5 μmol of released AMC / min and Kcat / KM were obtained: 1.55x10μM-1s -1. Classical protease inhibitors exert low enzymatic inhibition of DPP8Tc. In contrast, DPPIV inhibitors exert a greater inhibition rate among them, the more potent IB-7 inhibits in 96.59% of DPP8Tc, with inhibition constant (Ki) of 8.2 nM. Other DPPIV inhibitors showed the following ICs-50: KS (IV) with 95.47 nM, IB-4 with 484.9 nM and, finally, KAII-23 with 2.7 μM. Enzymatic inhibition occurs primarily by inhibitors that possess the adamantyl group in their chemical composition, similar to the composition of the human DPPIV vidagliptin inhibitor. The optimal activity occurs around 28ºC, temperature required to the survival of the epimastigote form, indicating potential function in the barber. The simple knockout of the dpp8tc gene, decreased enzyme activity by 50%, fluorescence by 20% and the infection rate of the parasite DPP8Tc+- increased by 2.9%. Differences in the 5 'and 3' UTRs regions of the DPP8Tc gene alleles prevented the success of double knockout, necessitating the specific construction of a cassette directed to the knockout of the second allele, in order to fully understand the function of DPP8Tc from Trypanosoma cruzi.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-06T19:22:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-JanaínaNascimento.pdf: 2428494 bytes, checksum: 1f074c8519d239e65f167723cc34b5cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T19:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-JanaínaNascimento.pdf: 2428494 bytes, checksum: 1f074c8519d239e65f167723cc34b5cf (MD5) Previous issue date: 2012-05-14 / Os tripanossomatídeos são protozoários unicelulares que apresentam uma biologia molecular bastante divergente dos demais eucariotos e são responsáveis por doenças negligenciadas que afetam milhares de pessoas. A carência de drogas mais eficazes contra estes patógenos justifica a busca da compreensão dos seus processos celulares. Um desses processos é a síntese proteica que, nos eucariotos, é dividida em quatro etapas, sendo a primeira, a iniciação, a mais complexa. A iniciação da tradução é dependente dos fatores de iniciação eucarióticos (eIFs), dentre os quais destaca-se o complexo eIF4F, cuja subunidade eIF4E é responsável pelo reconhecimento do cap presente na extremidade 5’ do mRNAs. Em Leishmania major e Trypanosoma brucei foram identificados seis homólogos conservados de eIF4E, sendo os EIF4E5 e 6 identificados mais tardiamente. O presente trabalho buscou contribuir com a caracterização funcional destas proteínas, iniciando-se com uma análise comparativa das suas sequências onde foram identificados motivos conservados presentes em outros homólogos de eIF4E. Em T. brucei, experimentos de localização subcelular mostraram que ambas as proteínas são citoplasmáticas, porém com alguma localização nuclear. Utilizando RNAi na fase procíclica do parasita, somente TbEIF4E5 mostrou-se essencial a viabilidade celular enquanto que as células depletadas do TbEIF4E6 apresentaram alterações morfológicas. Através da purificação de fosfoproteínas constatou-se que ambos os fatores são fosforilados e a predição in silico dos possíveis sítios revelou a presença de múltiplos resíduos passíveis de fosforilação. Já em L. major seus respectivos homólogos foram expressos em bactéria e utilizados para a produção de soros policlonais. Esses soros foram capazes de detectar a expressão do LmEIF4E5 em extratos de formas promastigotas de Leishmania enquanto para LmEIF4E6 não foi observada expressão compatível com o peso molecular esperado. Os resultados e as ferramentas moleculares produzidas contribuem tanto para a compreensão da função desempenhada por estas proteínas, como para o conhecimento do processo de tradução nos tripanossomatídeos. / Trypanosomatids are unicellular protozoans characterized by a divergent molecular biology, when compared to other eukaryotes. They are responsible for neglected diseases which affect thousands of people and the lack of more effective drugs against these diseases justifies a better understanding of their basic processes. One of these is protein synthesis (translation), formally divided into four stages, the first of which, initiation, is the most complex. Translation initiation is entirely dependent on the “eukaryotic Initiation Factors” (eIFs), such as the complex eIF4F. eIF4E is an eIF4F subunit which is responsible for the recognition of the cap on the 5’ end of mRNAs. Six conserved eIF4E homologues were found in Leishmania major and Trypanosoma brucei, with EIF4E5 and 6 being the latest ones identified. This work aimed to contribute with the functional characterization of these proteins, starting with a comparative analysis of their sequences where conserved motifs also found in other eIF4E homologues were identified. In T. brucei, subcellular localization experiments indicated that both proteins are predominantly cytoplasmic, but with minor nuclear localization. Using RNAi in the procyclic stage, only TbIF4E5 proved to be essential for cell viability, while cells depleted of TbEIF4E6 showed morphological abnormalities. Through phosphoprotein affinity purification, both proteins were observed to be phosphorylated, and the in silico prediction of possible phosphorylation sites revealed the presence of multiple putative sites. Regarding the L. major homologues, the corresponding proteins were expressed in bacteria and used to produce polyclonal antisera which were able to detect the expression of LmEIF4E5 in Leishmania promastigotes. However the expression observed for LmEIF4E6 is not consistent with its expected molecular weight. The results and molecular tools produced in this work contribute not only to the understanding of the functional role of these proteins, but also to the knowledge of the translation process in trypanosomatids.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:01:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3642_1.pdf: 6130351 bytes, checksum: 0d75c1901369305978b575398eefcd51 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os tripanossomatídeos são caracterizados por processos moleculares atípicos como o controle pós-transcricional da expressão gênica, através da degradação de mRNA e controle da tradução. Na maioria dos eucariotos, a iniciação da tradução começa com a ligação do complexo eIF4F (composto pelas subunidades eIF4A, eIF4E e eIF4G) ao cap monometilado presente na região 5 dos mRNAs, permitindo seu reconhecimento pelo ribossomo e outros eIFs participantes. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteína de ligação a cauda poli-A (PABP), que atua através de uma interação direta com o eIF4G. Vários homólogos às subunidades do eIF4F e PABP foram previamente identificados nos tripanossomatídeos, como cinco homólogos do eIF4G (EIF4G1-5) e múltiplos homólogos das demais subunidades (EIF4E1-4, EIF4AI e III e PABP1-2) e suas funções vem sendo investigadas em Leishmania major e Trypanosoma brucei. Como parte deste estudo, nós demonstramos que tanto o LmEIF4G3 como o LmEIF4G4 interagem com o LmEIF4AI, embora mutações nos aminoácidos LNK destas proteínas abolam suas interações com o LmEIF4AI. As proteínas LmEIF4G3 e LmEIF4G4 também se ligam respectivamente aos homólogos LmEIF4E4 e LmEIF4E3 e diferentes aminoácidos foram associados a estas interações. A substituição dos resíduos FSL no LmEIF4G3 abole sua interação com o LmEIF4E4 e a mutagênese dos resíduos IL no LmEIF4G4 abole sua ligação ao LmEIF4E3. Adicionalmente, nós demonstramos que as proteínas LmEIF4G3 e LmEIF4G4 ligam-se à LmPABP1 e nós também sugerimos funções distintas para o TbEIF4AI e TbEIF4AIII em ambas as formas procíclica e sanguínea de T. brucei. Em síntese, nossos resultados indicam uma maior complexidade na iniciação da tradução nos tripanossomatídeos e provavelmente a mesma é regulada por pelo menos dois diferentes complexos eIF4F

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo777_1.pdf: 7000051 bytes, checksum: a8e29b3f2773bafb86a39a499e858a7d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A regulação da expressão gênica nos tripanosomatídeos é realizada principalmente por mecanismos pos-transcricionais tais como o controle da estabilidade dos mRNAs e da sua tradução. Em eucariotos a tradução é controlada principalmente no recrutamento dos ribossomos para os mRNAs, mediada pelos fatores eucarióticos de iniciação da tradução (eIFs). Neste contexto, o reconhecimento dos mRNAs é realizado principalmente pelo complexo eIF4F, composto pelas subunidades eIF4E, eIF4A, e eIF4G. Um dos principais fatores envolvidos no controle da tradução é o eIF4E, que além de participar na síntese de proteínas, tem sido implicado em um número de processos envolvidos no metabolismo de mRNAs, como o transporte e controle de sua estabilidade. Este trabalho visou a caracterização dos homólogos ao eIF4E de tripanossomatídeos usando como organismo modelo o Trypanosoma brucei. A avaliação da expressão dos quatro homólogos de T. brucei (aqui chamados TbEIF4E1 a 4) em extratos protéicos mostrou que todas as proteínas são expressas constitutivamente durante o seu ciclo de vida, e que as proteínas TbEIF4E3 e TbEIF4E4 são as mais abundantes. Quando fusionadas a proteínas fluorescentes in vivo os TbEIF4E1 e 2 apresentaram localização nuclear e citoplasmática, enquanto os TbEIF4E3 e 4 mostraram-se estritamente citoplasmáticos. A depleção por RNAi mostrou que o TbEIF4E3 é o único essencial para a viabilidade na forma procíclica. Já na forma saguínea, TbEIF4E1, 3 e 4 foram essenciais. A depleção simultânea de TbEIF4E1/E2 causou a morte em células procíclicas, sem impacto na tradução, por outro lado o TbEIF4E3 ou duplo nocaute TbEIF4E1/E4 levaram à inibição substancial da tradução anterior a interrupção do crescimento e morte celular. Análises de imunoprecipitados mostraram que somente os TbEIF4E3 e 4 interagem com homólogos de eIF4G, as proteínas TbEIF4G3 e 4. Estes resultados são consistentes com a formação de complexos eIF4F distintos pelas proteínas TbEIF4E3 e 4, e estes complexos podem participar na tradução de maneira independente, o que revela propriedades da família eIF4E novas e intrigantes nestes organismos

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:03:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9598_1.pdf: 7683157 bytes, checksum: 0a5c0a98daf12b68a6ab6903f4d4966b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os tripanossomatídeos são protozoários parasitas que incluem patógenos humanos dos gêneros Trypanosoma e Leishmania e que apresentam como característica marcante a presença de mecanismos moleculares diferenciados, como a regulação da expressão gênica basicamente pós-transcricional. Nestes organismos a tradução pode desempenhar um papel importante para esta regulação, principalmente durante a etapa de iniciação, quando ocorrem interações controladas por fatores protéicos que permitem o recrutamento do ribossomo para a ligação aos mRNAs a serem traduzidos. De fato, indícios obtidos até o momento sugerem que a iniciação da síntese proteica nestes parasitas pode incluir processos diferenciados daqueles observados em outros organismos. Nos eucariotos em geral, o complexo de iniciação da tradução eIF4F desempenha várias funções relacionadas ao recrutamento do ribossomo ao mRNA e é formado por um componente central o fator eIF4G, além de seus parceiros eIF4E e eIF4A. Em L. major, cinco homólogos do fator eIF4G foram identificados (LmEIF4G1- 5), todos conservados em T. brucei (TbEIF4G1-5). Em trabalhos anteriores, dois destes homólogos (LmEIF4G3 e LmEIF4G4) apresentaram propriedades compatíveis com uma atuação na tradução. Neste trabalho, seus ortólogos de T. brucei, TbEIF4G3 e TbEIF4G4, foram selecionados com o intuito de continuar a sua caracterização funcional utilizando agora técnicas in vivo. Em um primeiro momento, reações de imunofluorescência confirmaram a localização citoplasmática das duas proteínas. Em seguida, em ensaios de depleção por RNAi, ambas se mostraram essenciais à viabilidade do parasita, embora apenas no caso do TbEIF4G3 tenha se observado uma diminuição significativa da tradução imediatamente após sua depleção. Ensaios de imunoprecipitação confirmaram interações específicas com homólogos do eIF4E (TbEIF4G3 com TbEIF4E4 e TbEIF4G4 com TbEIF4E3) e ainda a interação entre TbEIF4G3 e um homólogo da proteína de ligação à cauda poli-A (TbPABP1). Para ambos os homólogos, células procíclicas expressando proteínas com mutações em motivos putativos de ligação ao eIF4E apresentaram pequena redução no crescimento. Já em relação ao motivo de ligação ao eIF4A, modificações em sua sequência no TbEIF4G3 levaram a uma forte redução no crescimento de células em cultura, mas nenhum efeito foi observado em mutações equivalentes no TbEIF4G4. Para investigar mais diretamente o papel destas proteínas na tradução, ensaios com mRNAsrepórteres foram desenvolvidos, mas os dados preliminares não se mostraram úteis na identificação da função individual das proteínas avaliadas. Entretanto, vários vetores de transfecção e uma nova linhagem celular com expressão constitutiva da enzimarepórter luciferase foram obtidos e poderão ser usados na otimização dos ensaios e investigação da atuação dos homólogos selecionados em trabalhos futuros. Em resumo, os resultados confirmam a existência de dois complexos eIF4F distintos, mediados por motivos de interação eIF4G/eIF4E diferenciados, e ressaltam o papel crítico do TbEIF4G3 na manutenção da viabilidade e da síntese proteica em T. brucei

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6427_1.pdf: 827153 bytes, checksum: 46e5c27e183efa7400b36d0ab21be789 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Trypanosoma cruzi e Leishmania são parasitas intracelulares obrigatórios em células de hospedeiros mamíferos. A infecção humana mediada por parasitas é um processo extremamente rápido e estes devem dispor de estratégias de evasão da lise imediatamente após a inoculação para escapar dos efeitos deletérios do soro após ativação do sistema complemento. Distintas moléculas da superfície celular em diferentes organismos estão envolvidas nos processos de resistência a lise pelo complemento. Em T. cruzi foi identificada uma molécula envolvida com a resistência a lise pelo complemento. Uma proteína de 160 kDa denominada CRP (complement regulatory protein) de T. cruzi restringe a ativação das vias clássica e alternativa evitando a ação proteolítica da C3 convertase. Em Leishmania moléculas tais como gp-63, LPG parecem ser responsáveis pela evasão da lise, mas os mecanismos ainda não estão claros. Um outro exemplo de mecanismo de resistência a lise pelo complemento é conferido por uma proteína de 32 kDa chamada CRIT (C2 receptor inhibitor trispaning) expressa na superfície de formas adultas de Schistosoma que se liga ao componente C2 evitando a formação da C3 convertase. Neste trabalho pretende-se entender a ativação do sistema complemento por parasitas e identificar moléculas envolvidas com a lise pelo complemento em tripanosamatideos. Através de procedimentos de transfecção e sobrexpressão de CRP e CRIT em T. cruzi e Leishmania analisamos a função destes genes, difrenciando-os de parasitas selvagens. Foram realizadas cinéticas de ativação do complemento em diferentes tripanosomatideos com o uso de soro humano normal para avaliar o efeito do complemento sobre os parasitas. A aquisição de resistência à lise pelo complemento com o uso de parasitas transgênicos favorece a compreensão dos mecanismos que determinam a infecção e possibilita o desenvolvimento de medidas quimioterápicas

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6719_1.pdf: 1718714 bytes, checksum: bd74bdae33e28d1e9514c43b983a8308 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A regulação da expressão gênica nos tripanossomatídeos é predominantemente póstranscricional, ocorrendo através de mecanismos como controle da estabilidade e tradução dos RNAs mensageiros (mRNAs). Em eucariotos a tradução é controlada principalmente no recrutamento dos ribossomos para os mRNAs, sendo mediada pelos fatores eucarióticos de iniciação da tradução (eIFs). Neste contexto, o reconhecimento dos mRNAs é realizado principalmente pelo complexo eIF4F, formado pelas subunidades eIF4E, eIF4A e eIF4G. O eIF4G é a proteína estruturadora do complexo, interagindo com o eIF4E e o eIF4A, além de outras proteínas, pois apresenta em sua estrutura inúmeros domínios de ligação, entre eles, o MIF4G e o MA3, responsáveis pela ligação ao eIF4A. A proteína eIF4G é o protótipo de uma família de polipeptídeos que apresentam estes domínios, onde foi incluída recentemente a proteína NOM1, proteína com localização nucleolar, identificada em pacientes que apresentavam Leucemia Mielóide Aguda, sendo encontrados ortólogos em diferentes espécies, incluindo os tripanossomatídeos. Em trabalhos prévios, os genes da NOM1 de T.brucei e L.major foram clonados em vetores de expressão e a proteína recombinante TbNOM1 foi utilizada para imunização de coelhos. No presente trabalho, iniciamos a caracterização funcional da TbNOM1, demonstrando que a proteína é capaz tanto de interagir com os homólogos do eIF4A de T.brucei, como de formar dímeros ou estruturas mais complexas de ligação TbNOM1-TbNOM1. Sua expressão é constante durante todo o ciclo celular na forma procíclica e na forma sanguínea é expressa em maior concentração entre 0 e 6 horas, não sendo regulada por fosforilação em suas formas nativas. A localização subcelular da proteína TbNOM1 é citoplasmática, tendo sido confirmada em experimentos de imunofluorescência, fracionamento celular e superexpressão de proteína fluorescente. Outro aspecto relevante avaliado foi que a TbNOM1 é uma proteína não essencial, uma vez que sua depleção mediada por interferência de RNA, não afeta de forma significativa a viabilidade celular. Neste trabalho iniciou-se a caracterização funcional da TbNOM1, sendo necessário a realização de outras abordagens metodológicas para dar prosseguimento a este processo de investigação

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo775_1.pdf: 2674039 bytes, checksum: 2d48ce1a10b6a494268836174af90e47 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O Trypanosoma brucei é um protozoário unicelular causador da doença do sono em humanos, e cujo ciclo de vida se alterna entre dois hospedeiros, sendo a forma procílica encontrada em insetos vetores e a forma sanguínea em mamíferos suscetíveis. Nesse parasita a regulação da expressão gênica ocorre basicamente em nível pós-transcricional e a biossíntese de proteínas, principalmente na etapa denominada iniciação da tradução, é um ponto potencialmente crítico dessa regulação. Análises genômicas identificaram um número consideravelmente grande de proteínas quinases, o que levou a especulação de que a fosforilação de proteínas, dentre as modificações pós-traducionais, também seja um mecanismo chave para eventos dessa regulação. Em eucariotos, o complexo eIF4F (formado pelas subunidades eIF4A, eIF4E e eIF4G), auxiliado pela proteína de ligação ao poli-A (PABP), atua na iniciação da tradução e tem sua atividade regulada por modificações como fosforilação. Este trabalho buscou analisar a expressão de homólogos selecionados de eIF4E, eIF4G e PABP de T. brucei (TbEIF4E1, TbEIF4E3 e 4, TbEIF4G4 e 5) e investigar a ocorrência de modificações pós-traducionais que possam estar associadas ao controle da sua função. Primeiro, curvas de crescimento foram geradas e extratos protéicos produzidos a partir de células derivadas de pontos selecionados destas curvas. Foi possível observar que todas as proteínas selecionadas eram expressas ao longo das curvas em ambas as formas do ciclo de vida do parasita, porém com padrões de expressão distintos. Os TbEIF4E1 e 3 são as proteínas menos e mais expressas, respectivamente, em ambas as formas procíclica e sanguínea. Os TbEIF4E3 e 4 e o TbEIF4G4 foram representados por mais de uma isoforma, ao contrário dos demais fatores estudados, e observou-se que as três proteínas eram encontradas sob formas fosforiladas. Através da eletroforese bidimensional foi possível visualizar que TbPABP1, TbEIF4E3 e TbEIF4E4 possuem 2, 5 e 4 isoformas, respectivamente, enquanto o TbEIF4AI, não fosforilado, possui apenas uma. Adicionalmente, foi demonstrado que a fosforilação do TbEIF4G4 não impede sua a interação com o TbEIF4E3. Esses resultados indicam que a fosforilação é um mecanismo que parece possuir um papel predominante na regulação da função dos fatores estudados

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-08-29T14:48:46Z No. of bitstreams: 1 2016_AgneloRodriguesdeSouza.pdf: 1916299 bytes, checksum: 92e8cd180025da449e27b13a19f259c3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-01T21:44:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AgneloRodriguesdeSouza.pdf: 1916299 bytes, checksum: 92e8cd180025da449e27b13a19f259c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T21:44:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AgneloRodriguesdeSouza.pdf: 1916299 bytes, checksum: 92e8cd180025da449e27b13a19f259c3 (MD5) / Durante o processo de divisão celular os tripanossomatídeos e alguns microrganismos do reino Fungi mantém o núcleo intacto em um processo denominado de mitose fechada. Além disso, os tripanossomatídeos não apresentam condensação da cromatina e ocorre um alongamento do núcleo para acomodar os cromossomos já replicados. Em leveduras e metazoários, a manutenção das cromátides irmãs juntas durante a divisão celular até a sua separação na transição metáfase e anáfase é realizada pelo complexo coesina. Análise dos genomas de tripanossomatídeos mostrou que genes do complexo coesina e de proteínas centrinas estão presentes e são conservados. Para investigar a função da subunidade TcSCC1 do complexo coesina e das cinco proteínas centrinas preditas em T. cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, foram feitas clonagens dos genes TcSCC1 e TcCEN1 a 5. Para a análise de citolocalização dessas proteínas no parasita, os genes TcSCC1, TcCEN2, 4 e 5 foram subclonados no vetor de expressão transiente pRTEGFP que contém o promotor ribossomal, a região 5’UTR do gene para a amastina, o gene para a proteína fluorescente verde (EGFP) e a região 3’UTR do gene TCR27. A subclonagem foi realizada de modo que as proteínas de estudo foram expressas como fusão no N-terminal da EGFP. Esses plasmídeos foram utilizados em transfecção transiente e a expressão da EGFP com e sem as fusões proteicas foram visualizadas por microscopia de fluorescência. As centrinas 2, 4 e 5 e a subunidade TcSCC1 da coesina fusionadas com EGFP apresentaram uma localização predominantemente nuclear, embora não exclusivo, quando comparado com a EGFP sem fusão. Para verificar se as proteínas estudadas são expressas em T. cruzi foram realizadas análises de PCR quantitativa nas suas três formas de vida: amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas. Verificamos que todos os genes são expressos na forma de mRNA. As centrinas 2 e 5 apresentaram a maior expressão relativa nas três formas enquanto que as centrinas 1 e 3 apresentaram expressão equivalente à GAPDH em amastigotas e epimastigotas, mas em tripomastigotas uma expressão maior. A centrina 4 apresentou uma expressão relativa muito menor que a GAPDH e às outras centrinas nas três formas do parasita. Deste modo, concluímos que as cinco centrinas e a subunidade SCC1 são expressas em T. cruzi com uma possível localização nuclear. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / During cell division the trypanosomatids and some fungi microorganisms keeps the nucleus intact in a so-called closed mitosis. Furthermore, the trypanosomes do not show chromatin condensation and it occurs nucleus elongation to accommodate the replicated chromosomes. In yeast and metazoan, maintenance of sister chromatids together during cell division until their separation in metaphase and anaphase transition is performed by cohesin complex. Analysis of trypanosomatid genomes showed that genes for the cohesin complex and for centrin proteins are present and conserved. To investigate the function of TcSCC1 subunit of cohesin complex and the five predicted centrin proteins in T. cruzi, the causative agent of Chagas disease, cloning of the TcSCC1 gene and all five TcCEN genes was performed. For cytolocalization analysis of these proteins in the parasite, TcSCC1 and TcCEN2, 4 and 5 genes were subcloned into the transient expression vector pRTEGFP that contains the ribosomal promoter, the 5'UTR region of the amastin gene, the gene for green fluorescent protein (EGFP) and the 3'UTR region of the TCR27 gene. Subcloning was performed so that the proteins were expressed as fusion proteins at the N-terminus of EGFP. These plasmids were used in transient transfection and expression of EGFP with and without the protein fusions were visualized by fluorescence microscopy. The centrins 2, 4 and 5 and TcSCC1 cohesin subunit fused to EGFP showed a predominantly nuclear localization, although not unique, when compared to EGFP without fusion. To verify that the studied proteins are expressed in T. cruzi quantitative PCR analysis was performed in its three forms of life: amastigotes, epimastigotes and trypomastigotes. We found that all genes are expressed as mRNA. The centrins 2 and 5 had the highest relative expression in three forms while centrins 1 and 3 had equivalent expression to GAPDH in amastigotes and epimastigotes, but higher expression in trypomastigotes. The centrin 4 showed a much smaller relative expression to GAPDH and the other centrins in the three forms of the parasite. Thus, we conclude that the five centrins and the SCC1 subunit are expressed in T. cruzi with a possible nuclear localization.

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