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Previous issue date: 2012-05-14 / Os tripanossomatídeos são protozoários unicelulares que apresentam uma biologia
molecular bastante divergente dos demais eucariotos e são responsáveis por
doenças negligenciadas que afetam milhares de pessoas. A carência de drogas
mais eficazes contra estes patógenos justifica a busca da compreensão dos seus
processos celulares. Um desses processos é a síntese proteica que, nos eucariotos,
é dividida em quatro etapas, sendo a primeira, a iniciação, a mais complexa. A
iniciação da tradução é dependente dos fatores de iniciação eucarióticos (eIFs),
dentre os quais destaca-se o complexo eIF4F, cuja subunidade eIF4E é responsável
pelo reconhecimento do cap presente na extremidade 5’ do mRNAs. Em Leishmania
major e Trypanosoma brucei foram identificados seis homólogos conservados de
eIF4E, sendo os EIF4E5 e 6 identificados mais tardiamente. O presente trabalho buscou contribuir com a caracterização funcional destas proteínas, iniciando-se com uma análise comparativa das suas sequências onde foram identificados motivos conservados presentes em outros homólogos de eIF4E. Em T. brucei, experimentos de localização subcelular mostraram que ambas as proteínas são citoplasmáticas, porém com alguma localização nuclear. Utilizando RNAi na fase procíclica do parasita, somente TbEIF4E5 mostrou-se essencial a viabilidade celular enquanto que as células depletadas do TbEIF4E6 apresentaram alterações morfológicas.
Através da purificação de fosfoproteínas constatou-se que ambos os fatores são
fosforilados e a predição in silico dos possíveis sítios revelou a presença de múltiplos resíduos passíveis de fosforilação. Já em L. major seus respectivos homólogos foram expressos em bactéria e utilizados para a produção de soros policlonais.
Esses soros foram capazes de detectar a expressão do LmEIF4E5 em extratos de formas promastigotas de Leishmania enquanto para LmEIF4E6 não foi observada expressão compatível com o peso molecular esperado. Os resultados e as ferramentas moleculares produzidas contribuem tanto para a compreensão da função desempenhada por estas proteínas, como para o conhecimento do processo de tradução nos tripanossomatídeos. / Trypanosomatids are unicellular protozoans characterized by a divergent molecular
biology, when compared to other eukaryotes. They are responsible for neglected
diseases which affect thousands of people and the lack of more effective drugs
against these diseases justifies a better understanding of their basic processes. One
of these is protein synthesis (translation), formally divided into four stages, the first of
which, initiation, is the most complex. Translation initiation is entirely dependent on
the “eukaryotic Initiation Factors” (eIFs), such as the complex eIF4F. eIF4E is an
eIF4F subunit which is responsible for the recognition of the cap on the 5’ end of
mRNAs. Six conserved eIF4E homologues were found in Leishmania major and
Trypanosoma brucei, with EIF4E5 and 6 being the latest ones identified. This work
aimed to contribute with the functional characterization of these proteins, starting with
a comparative analysis of their sequences where conserved motifs also found in other eIF4E homologues were identified. In T. brucei, subcellular localization experiments indicated that both proteins are predominantly cytoplasmic, but with minor nuclear localization. Using RNAi in the procyclic stage, only TbIF4E5 proved to be essential for cell viability, while cells depleted of TbEIF4E6 showed morphological abnormalities. Through phosphoprotein affinity purification, both proteins were observed to be phosphorylated, and the in silico prediction of possible phosphorylation sites revealed the presence of multiple putative sites. Regarding the L. major homologues, the corresponding proteins were expressed in bacteria and used to produce polyclonal antisera which were able to detect the expression of LmEIF4E5 in Leishmania promastigotes. However the expression observed for LmEIF4E6 is not consistent with its expected molecular weight. The results and molecular tools produced in this work contribute not only to the understanding of the functional role of these proteins, but also to the knowledge of the translation process in trypanosomatids.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/18512 |
| Date | 14 May 2012 |
| Creators | NASCIMENTO, Janaína de Freitas |
| Contributors | MELO NETO, Osvaldo Pompílio de, REIS, Christian Robson de Sousa |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Genetica, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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