Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-03T21:24:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-17T22:19:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T22:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Minelli Albuquerque Sousa.pdf: 1685422 bytes, checksum: aa0b6a25cf3fdcb5be14a26639ecfd22 (MD5) Previous issue date: 2011-12-20 / CAPES / Materiais queratinosos são insolúveis e resistentes à degradação por enzimas proteolíticas comuns, tornando-se importante o estudo de microrganismos produtores de queratinases para ser usado na indústria biotecnológica. O objetivo deste estudo foi selecionar fungos isolados do solo armazenados na Micoteca URM, para ser empregado na síntese de queratinases extracelular, caracterizar as cepas quanto a capacidade queratinolítica, efeito de diferentes substratos, da composição do meio e das condições de cultivo na produção de queratinase em cultivo submerso, otimizara aprodução, caracterizar e purificar a enzima. Para a determinação da capacidade de utilizar substratos queratinosos, 50 cepas fúngicas foram utilizadas. Elas foram cultivadas em fermentação submersa em meio contendo sais e penas durante 10 dias a 30 °C em agitador orbital a 120 rpm. Para avaliar a capacidade queratinolítica e o efeito de diferentes substratos na produção da queratinase foram utilizadas as seguintes cepas: Aspergillus sulphureus URM 5029, A. avenaceus URM5051, A. sclerotiorum URM5586 e Trichoderma aureoviride URM5574. Com a linhagem que apresentou a melhor produção e o melhor substrato, foi realizado estudos do efeito da composição do meio, condições de cultivo na produção da queratinase, otimização da produção, caracterização e purificação da enzima. Aspergillus sulphureus, Trichoderma aureoviride, Aspergillus avenaceus e A. sclerotiorum mostraram os melhores resultados com 7,35 U /ml, 7,2 U/ml, 6,7 U/ml e 6,05 U/ml de atividade queratinolítica, respectivamente. As espécies testadas se destacaram na colonização dos diferentes substratos queratinosos e o melhor substrato para a produção de queratinase foi a pena de frango. A produção de queratinase por A. sulphureus foi incrementada nas seguintes condições: 2 g/50 ml de pena de frango, 0,1 g/50 ml de NaNo₃, 0,001 g/50 ml de CaCl₂, pH 7,8, 35ºC, 160 rpm e 10⁶ esporos/ml em cultivo líquido submerso em 10 dias de incubação. A partir desses resultados foi realizado um planejamento fatorial completo 2⁴, para otimizar a produção da queartinase, e as melhores condições de produção foram: pH 8,0, 36 °C, 120 rpm, 2,5% (p/v) de penas de frango em 10 dias, com a máxima atividade de 10,06 U/ml, mostrando um aumento de 1,44 vezes. A queratinase de A. sulphureus apresentou melhor atividade em pH 10,0 e 35 ºC e é pouco inibida na presença de íons metais (Co²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺) e PMSF e fortemente inibida por EDTA, sugerindo ser uma metaloprotease. As melhores condições para purificação da queratinase de Aspergillus sulphureus, após análise estatística, foram: massa molecular do PEG, 8000; concentração do PEG, 20% e concentração de citrato 15%, apresentando aumento de pureza e recuperação queratinolítica de 25,04 e 184,9%, respectivamente. Com base nos resultados, concluímos que a preservação, sob óleo mineral é satisfatório para manter a viabilidade e a taxonomia das culturas por longos períodos de tempo e os microorganismos do solo podem ser uma interessante fonte de fungos produtores de queratinases. Além disso a capacidade da queratinase de A. sulphureus ser estável em uma ampla faixa de pH (6,5–9,0) e temperatura (25–60 °C) sugere o uso desta cepa em processos biotecnológicos industriais. / Keratinous materials are insoluble and resistant to degradation by common proteolytic enzymes, making it important to study keratinases producing microorganisms for use in the biotechnology industry. The aim of this study was to select fungi isolated from soil stored in the URM Culture Collection, to be employed in the synthesis of extracellular keratinases, characterize the strains and the ability queratinolítica, effect of different substrates, the medium composition and cultivation conditions in the production of keratinase in submerged culture, aprodução optimize, characterize and purify the enzyme. To determine the ability to use keratinous substrates, 50 fungal strains were used. They were grown in submerged fermentation in medium containing salts and penalties for 10 days at 30 ° C on an orbital shaker at 120 rpm. To assess the ability queratinolítica and the effect of different substrates on keratinase production we used the following strains: Aspergillus sulphureus URM 5029, A. avenaceus URM5051, A. sclerotiorum URM5586 and Trichoderma aureoviride URM5574. With a lineage that had the best production and best substrate, was carried out studies of the effect of medium composition, cultivation conditions on keratinase production, production optimization, characterization and purification of the enzyme. Aspergillus sulphureus, Trichoderma aureoviride, Aspergillus avenaceus and A. sclerotiorum showed the best results with 7.35 U / ml, 7.2 U / ml, 6.7 U / ml and 6.05 U / ml keratinolytic activity, respectively. The species tested stood out in the colonization of different keratinous substrates and the best substrate for the production of keratinase was the poultry feathers. Keratinase production by A. sulphureus was increased in the following conditions: 2 g/50 ml of poultry feathers, 0.1 g/50 ml of NaNO3, CaCl2 0.001 g/50 ml, pH 7.8, 35 ° C, 160 rpm and 106 spore/ml in submerged in liquid culture 10 days of incubation. From these results we carried out a full 2⁴ factorial design to optimize the production of queartinase, and the best production conditions were: pH 8.0, 36 ° C, 120 rpm, 2.5% (w/v) feather chicken in 10 days, with maximum activity of 10.06 U/ml, showing an increase of 1.44 times. The keratinase of A. sulphureus showed better activity at pH 10.0 and 35 ° C and is slightly inhibited in the presence of metal ions (Co²⁺, Mg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺) and PMSF and strongly inhibited by EDTA, suggesting that a metalloprotease. The best conditions for purification of keratinase from Aspergillus sulphureus, after statistical analysis were: molecular weight of PEG 8000, PEG concentration, 20% and 15% concentration of citrate, an increase of purity and keratinolytic recovery of 25.04 and 184.9%, respectively. Based on the results, we conclude that the preservation under mineral oil is satisfactory to maintain the viability and taxonomy of cultures for long periods of time and soil microorganisms may be an interesting source of keratinases producing fungi. Furthermore the ability of keratinase of A. sulphureus be stable over a wide pH range (6.5 to 9.0) and temperature (25-60 ° C) suggests the use of this strain in industrial biotechnology processes.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-04T22:57:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Felipe Rocha da Costa.pdf: 741317 bytes, checksum: 923dc646ea34ede74f15dfc2ce5f31b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-17T22:59:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Felipe Rocha da Costa.pdf: 741317 bytes, checksum: 923dc646ea34ede74f15dfc2ce5f31b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T22:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Felipe Rocha da Costa.pdf: 741317 bytes, checksum: 923dc646ea34ede74f15dfc2ce5f31b1 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / CAPES / Ulomoides dermestoides é um besouro cosmopolita, praga de produtos armazenados, nativo da Ásia. Popularmente conhecido como besouro do amendoim, e considerado um “remédio” na medicina popular sendo indicada sua utilização em casos como asma e artrite. Alguns trabalhos têm demonstrado que metabólitos obtidos a partir do U. dermestoides apresentam atividade biológica como, por exemplo, ação anti-inflamatória e citotóxica. Este trabalho teve como objetivo purificar proteases de U. dermestoides e caracterizar frente a substratos específicos, variação de temperatura e diferentes faixas de pH. Para tanto, uma criação de U. dermestoides foi mantida no laboratório de Engenharia Biomédica submetida a temperatura de 25ºC ±2 e umidade de 50-60%. O extrato foi preparado utilizando-se 10g de besouro triturados e homogeneizados em 20ml do tampão de extração (Tris-HCl 10mM, NaCl 130mM, KCl 5mM pH7,4) por 30min. Após centrifugação (8000 rpm, 20min) o sobrenadante foi coletado para realização dos testes propostos. A atividade proteolítica total foi avaliada utilizando-se o teste da hidrolise da azocaseína com leitura em comprimento de onda de 366nm. Os testes enzimáticos também foram realizados utilizando-se substratos específicos para serino protesases (Bapna/Tripsina e Sucphenan/Quimiotripsina) sendo a leitura realizada em comprimento de onda de 405nm. Para a caracterização térmica o extrato foi aquecido por 30mim nas temperaturas de 40ºC, 50ºC, 60ºC e 100ºC. O pH ótimo foi determinado aplicando o extrato bruto a uma faixa de pH variando do pH1 ao pH10. A purificação foi realizada usando cromatografia em coluna de exclusão molecular HiPrep 16/60 Sephacryl S-100HR e em uma coluna de troca iônica DEAE HiprepTM FF 16/10, ambos acoplados ao sistema AKTA-Prime. A leitura da atividade proteolítica mostra que o extrato de U. dermestoides apresentou elevada atividade (75,5U). A atividade proteolítica permaneceu mesmo após o material ser aquecido 100ºC (18,3U). A atividade enzimática demonstrou que o este inseto possui pelo menos uma enzima da classe serino protease do tipo tripsina, porem não apresentou proteases do tipo quimmiotripsina. A atividade enzimática revelou também que as serino proteases mantiveram sua atividade catalítica a 40ºC e na faixa de pH entre o pH3 e o pH8. A purificação mostrou que a enzima obtida é pequena apresentado peso molecular aproximado de 20,6KDa apos a exclusão molecular e 22,3 KDa após eletroforese. Por fim, a serino protease purificada apresentou Km =0,62 mM e Vmₐₓ =0,33 x 10⁻³ μmol BApNA/min. Os resultados obtidos apontam a necessidade de técnicas adicionais na purificação das enzimas de U. dermestoides visando a caracterização mais precisa da protease identificada e identificação e caracterização da protease termoestável. / Ulomoides dermestoides is a cosmopolitan beetle, pest of stored products and native from Asia. Popularly known as “besouro do amendoim” it is considered a medicine resource in folk medicine being indicated in cases such as asthma and arthritis. Some reports have demonstrated that metabolites obtained from the U. dermestoides exhibit biological activity eg. anti-inflammatory and cytotoxic activity. This paper aims to purify U. dermestoides proteases and characterize in relation to the specific substrates, variation of temperature and pH ranges and by eletrophoretic and zimography assays. For this purpose, Stock cultures of U. dermestoides were kept in the Laboratório de Engenharia Biomédica from Universidade Federal de Pernambuco at a relative humidity of 50-60% and temperature of 25 ±2ºC. Raw peanuts were offered as food source to beetles. Adult males and females were crushed for preparation of extracts and homogenized in 20 ml of extraction buffer (10mM Tris-HCl, 130 mm NaCl, 5mM KCl, pH 7, 4) for 30min. After centrifugation (8000 rpm, 20 min) the supernatant was saved for later use. The proteolytic activity was assessed using the azocaseinolitic assay for general proteases, read at a wavelength of 366nm and assessed by the specific substrates BApNA and SucPHenan, read at a wavelength of 405nm. Extract thermal an pH characterization were performed by heating crude extract for 30 minutes at temperatures of 40ºC, 50ºC, 60ºC and subjecting crude extract to a pH range from 1 to 10, respectively. Purification was carried out using gel filtration chromatography column HiPrep 16/60 Sephacryl S-100HR and an ion exchange Hiprepᵀᴹ 1D39 DEAE FF 16/10 column, both coupled to AKTA-Prime system. Proteolytic activity shows that the extract of U. dermestoides presents high proteolitic activity (75.5U). The proteolytic activity remains even when the material is heated to 100ºC (18.3U). The enzyme activity demonstrated that this insect has at least one enzyme of the serine protease class of the trypsin but does not presents chymotripsin type. The enzymatic activity also revealed that serine proteases maintained its catalytic activity at 40ºC and at pH values ranging from pH3 and pH8 with maximal activity at pH=7. Purification showed that the enzyme obtained is small and presents approximate molecular weight of 20.6 kDa on gel filtration and 22.3 kDa on electrophoresis. Zimography assay displays tow bands presenting caseinolitic activity weighting 49,5 and 43,9, respectivey. Finally, the purified serine protease showed Km = 0.62 mM Vmₐₓ = 0.33 x 10⁻³ μmol BApNA/min. The results indicate the need for additional techniques in order to completely purification of U. dermestoides proteases aiming to a more precisely characterization and identify and characterize the thermostable protease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2016-01-15T14:22:33Z No. of bitstreams: 1 2015_CarolinaDaSilvaCaniellesCaprara_Parcial.pdf: 17043 bytes, checksum: aa3a4af2c2797df0cbf341b8e65abd48 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-01-15T14:23:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CarolinaDaSilvaCaniellesCaprara_Parcial.pdf: 17043 bytes, checksum: aa3a4af2c2797df0cbf341b8e65abd48 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-15T14:23:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CarolinaDaSilvaCaniellesCaprara_Parcial.pdf: 17043 bytes, checksum: aa3a4af2c2797df0cbf341b8e65abd48 (MD5) / Proteases constituem um dos grupos de enzimas industriais mais importantes, com participação na indústria de detergentes, couro, alimentos e medicamentos. A indústria de detergentes é uma grande consumidora de enzimas hidrolíticas. Novas metodologias que possibilitem a purificação de biomoléculas são de grande interesse para a indústria pelas suas potenciais aplicações. O objetivo principal deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar proteases extracelulares de Penicillium restrictum cultivado sob fermentação submersa. A cepa de Penicillium restrictum isolada do solo do Cerrado foi capaz de produzir proteases extracelulares após 7 dias de cultivo a 28°C e 150 rpm em meio contendo farelo de trigo. Após os 7 dias de cultivo o filtrado do meio fermentado foi submetido ao processo de ultrafiltração em membrana de 100 kDa e a fração ultrafiltrada foi adicionada ao SMDFA em diferentes condições, sendo avaliada a purificação através de um planejamento fatorial 2³ com três repetições no ponto central. Os resultados mostraram que o SMDFA foi eficaz na partição das proteases presentes na fração < 100 kDa para a fase pobre em micelas, apresentando um coeficiente de partição (k) menor que 1 para todos os sistemas testados. O sistema 3 apresentou 80 de balanço de massas e 138,24% de rendimento. Baseado nos valores de k e nos valores do balanço de massa e do rendimento, o sistema contendo 10% Triton X114, 10% de caldo e separado a 31°C foi escolhido para dar continuidade ao processo de purificação da enzima de interesse. A fração pobre em micelas, foi ultrafiltrada em membrana de 30 kDa e o fator de purificação desta fração foi igual a 10,4. A purificação parcial de duas proteases extracelulares foi confirmada por SDS-PAGE seguido de zimograma. As bandas com atividade proteolítica revelaram pesos moleculares de aproximadamente 19,2 e 30,5 kDa. As proteases parcialmente purificadas apresentaram atividade máxima em pH 8,0 e a temperatura ótima foi estimada em 55°C. A enzima foi levemente inibida por PMSF e bastante inibida pelos íons metálicos Fe e Zn e o íon metálico Mg+2 induziu um aumento da atividade enzimática. As enzimas parcialmente purificadas foram aplicadas junto a detergentes comerciais apresentando potencial para possível aplicação na indústria de detergentes. / Proteases are one of the largest groups of industrial enzymes, participating in the detergent industry, leather, food and medicine. The detergent industry is a large consumer of hydrolytic enzymes. New methodologies for the purification of biomolecules are of great interest to the industry for its potential applications. The aim of this work was to produce and purify extracellular proteases from Penicillium restrictum under submerged fermentation. The strain of Penicillium restrictum isolated from cerrado soil was able to produce extracellular protease after 7 days of cultivation at 28°C and 150 rpm in medium with wheat bran. After 7 days of fermentation, broth culture was submitted to ultrafiltration process through a membrane of 100 kDa. Ultrafiltered fraction was added to SMDFA under different conditions, purification being evaluated through a factorial design 2³ with three replications at center point. The results showed that the SMDFA was effective in partitioning of proteases present in the fraction <100 kDa poor phase micelles, with a partition coefficient (k) less than 1 for all tested systems. The system 3 showed 80 mass balance and 138.24% yield. These results being the best mass balance and the best performance. Based on the k values in the mass balance and income values, the system containing 10% Triton X-114, 10% of broth and separated at 31°C was chosen to continue the process of purification of the enzyme of interest. Micelles poor fraction was ultrafiltered through a membrane of 30 kDa and the purification factor of this fraction was equal to 10.4. The partial purification of two extracellular proteases was confirmed by SDS-PAGE followed by zymography. The proteolytic activity showed bands with molecular weights of approximately 19.2 and 30.5 kDa. The partially purified protease showed maximum activity at pH 8.0 and the optimum temperature was estimated at 55 ° C. The enzyme was slightly inhibited by PMSF and quite inhibited by metal ions Fe and Zn and the metal ion Mg+2 induced an increased enzyme activity. Partially purified enzymes were applied to commercial detergent Ypê Premium® where the detergent has potential for possible application in the detergent industry aiding the detergent in removing proteinaceous stains.

FREITAS, A. C. de. Produção de extrato enzimático proteolítico por Aspergillus Oryzae CCBP001 em reator instrumentado por fermentação semi-sólida. 2013. 115 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2013-06-13T12:10:25Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_acfreitas.pdf: 2140453 bytes, checksum: 4256f57b3e405f33d943565e977863d9 (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2013-06-13T17:24:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_acfreitas.pdf: 2140453 bytes, checksum: 4256f57b3e405f33d943565e977863d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-13T17:24:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_acfreitas.pdf: 2140453 bytes, checksum: 4256f57b3e405f33d943565e977863d9 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Enzyme production by solid state fermentation (SSF) is influenced by several factors that affect crop growth and production of microbial metabolites. The study of factors such as aeration and moisture in the air becomes indispensable for this bioprocess optimization. In this context, the present study aimed to assess the protease production by Aspergillus oryzae CCBP001 by FSS bioreactor columns. The FSS for the production of protease using the filamentous fungus A. oryzae CCBP 001 occurred in dynamic and static conditions in order to observe the method with the highest production. Therefore, tested the agroindustrial waste: canola cake, sunflower cake, wheat bran, almond cashew film and cottonseed meal as substrate, observing the production profile for different water activity (Aw) obtained by initial adding different volumes of water for humidification. Protease production in reactor columns in the optimized conditions was compared to production in flasks for 10 days. Evaluated procedures to recover, identify, focus and store the enzyme extract produced. For the concentration of the enzyme extract produced a study was conducted in dry "spray dryer" and followed up the storage time of the dry extract for 90 days. From the results it was possible to select the canola cake as the substrate where it presented a production 33% higher than the other substrates tested. In the study of operating conditions in reactor columns was possible to evaluate the influence of air flow, air humidity and substrate moisture in protease production. The use of glucose, maltodextrin and carboxymethylcellulose as adjuvants proved to be efficient with regard to maintenance of protease activity during the drying process using a "spray dryer", where it was possible to obtain a dry product with low values of humidity and Aw important for the storage process of enzyme extract. Spray drying of the enzyme extract and concentrate stockpile allowed the enzyme. / A produção de enzimas por fermentação semi-sólida (FSS) é influenciada por diversos fatores de cultivo que afetam o crescimento microbiano e a produção de metabólitos. O estudo de fatores como aeração e umidade do ar torna-se indispensável para a otimização deste bioprocesso. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de protease pelo fungo Aspergillus oryzae CCBP001 por FSS em biorreator de colunas. A FSS para a produção de protease utilizando o fungo filamentoso A. oryzae CCBP 001 ocorreu em condições dinâmica e estática, visando observar o método que apresentou a maior produção. Para tanto foram testados os resíduos agroindustriais: torta de canola, torta de girassol, farelo de trigo, película da amêndoa de caju e farelo de algodão como substrato, observando o perfil de produção em função de diferentes atividades de água (Aw) iniciais obtidas pela adição de distintos volumes de água para umidificação. A produção de protease em reator de colunas nas condições otimizadas foi comparada com a produção em Erlenmeyer, durante dez dias. Foram avaliados procedimentos para recuperar, identificar, concentrar, e estocar o extrato enzimático produzido. Para a concentração do extrato enzimático produzido realizou-se estudo de secagem em “spray dryer” e acompanhou-se o tempo de estocagem do extrato seco durante 90 dias. Com os resultados foi possível selecionar a torta de canola como o substrato onde apresentou uma produção 33% superior aos demais substratos testados. No estudo das condições operacionais em reator de colunas foi possível avaliar a influência da vazão do ar, umidade relativa do ar e umidade do substrato na produção de protease. A utilização de glicose, maltodextrina e carboximetilcelulose como adjuvantes se mostraram eficientes com relação à manutenção da atividade de protease durante o processo de secagem utilizando “spray dryer”, onde foi possível obter um produto seco com baixos valores de umidade e Aw, importante para o processo de estocagem do extrato enzimático. A secagem por atomização do extrato enzimático possibilitou concentrar e estocar a enzima.

PEREIRA, D. A. Proteases e inibidores de proteases em látex vegetal e intestino de lagartas: aspectos sobre resistência e suscetibilidade das plantas alvo. 2014. 115 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-25T18:18:03Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_dapereira.pdf: 2673759 bytes, checksum: 7774cf88f545c534e580605cea0c8aa2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-15T20:17:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_dapereira.pdf: 2673759 bytes, checksum: 7774cf88f545c534e580605cea0c8aa2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-15T20:17:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_dapereira.pdf: 2673759 bytes, checksum: 7774cf88f545c534e580605cea0c8aa2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Plant latex is produced and stored in channels formed by highly specialized cells structures. A remarkable feature of these fluids is the presence of complex proteolytic systems. Many studies report that latex possesses a variety of defense proteins against insects and fungi. However, some insects overlap this defense and feed on latex-producing plants, for example Pseudosphinx tetrio and Danaus plexippus, both of the order Lepidoptera. The biochemical aspects of insect resistance to latex defense proteins are still not widely elucidated. This issue was addressed in this work. Initially, the proteolytic activity of Pseudosphinx tetrio gut was characterized and evaluated in its ability to degrade latex proteins of its host plant (Plumeria rubra) and non-host plants (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Furthermore, we assessed whether protease inhibitors from latex fluids (C. procera, P. rubra and Cr. grandiflora) inhibit intestinal proteases from P. tetrio and D. plexippus and vice versa. The effect of latex enzymes on peritrophic membrane (PM) of D. plexippus was also assessed. Intestinal proteases from P. tetrio are predominantly of serine type and their activities are higher in basic pHs. P. tetrio gut proteases rapidly and completely digested latex proteins of its host plant and C. procera and partially digested proteins from Cr. grandiflora. D. plexippus larvae were not affected when fed on artificial diet containing latex proteins (1%) from non-host plants. In vitro assays detected serine and cysteine peptidase inhibitors in both gut homogenates and latex fluids. Protease inhibitors from latex inhibited the proteolytic activity of gut homogenates of both larvae. Nevertheless, in vivo analysis demonstrated that latex inhibitors do not affect the development of D. plexippus. Only the gut homogenate from D. plexippus showed inhibitory activity towards proteases latex from its host plant (Calotropis procera). Slight changes were observed in the protein profile of the PMs from D. plexippus subjected to latex protein fractions in vivo, whilst in vitro treatment resulted in more severe damage. This study concludes that proteolysis and inhibition of proteolysis are involved in the defensive systems of both caterpillars and their host plants. Even though latex peptidase inhibitors inhibit gut peptidases (in vitro), the ability of gut peptidases to promptly digest latex proteins (in vivo) regardless of their origin seems to be a pivotal event favoring caterpillars overcoming plant defense. / O látex vegetal é produzido e estocado em sistemas de canais formados por células altamente especializadas, os laticíferos. Uma característica marcante destes fluidos é a presença de sistemas proteolíticos complexos. Muitos estudos relatam que proteínas de defesa contra insetos e fungos são encontradas em látex. No entanto, alguns insetos sobrepõem esta defesa e alimentam-se de plantas laticíferas, como Pseudosphinx tetrio e Danaus plexippus, ambas da ordem Lepidoptera. As bases bioquímicas da resistência de insetos às proteínas defensivas do látex ainda não são amplamente elucidadas. Esta problemática foi abordada neste trabalho. Inicialmente a atividade proteolítica do extrato intestinal de P. tetrio foi caracterizada e avaliada sua capacidade de degradar as proteínas do látex de sua planta hospedeira, Plumeria rubra, bem como de plantas laticíferas não hospedeiras (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Além disso, foi avaliado se inibidores de proteases de fluidos laticíferos (C. procera, P. rubra e Cr. grandiflora) inibem as proteases intestinais de P. tetrio e D. plexippus e vice-versa. Em adição, foi analisado o efeito de enzimas laticíferas sobre a membrana peritrófica (MP) de D. plexippus. As proteases intestinais de P. tetrio são predominantemente do tipo serínica e suas atividades são maiores em pHs básicos. O extrato intestinal de P. tetrio rapidamente e completamente digeriu as proteínas do látex de sua planta hospedeira e de C. procera, bem como digeriu parcialmente as proteínas do látex de Cr. grandiflora. Larvas de D. plexippus se desenvolveram plenamente quando alimentadas com dieta artificial contendo 1% das frações proteicas dos látex de plantas não hospedeiras. Ensaios in vitro indicaram que ambos, extratos intestinais e látex das espécies em estudo, possuem inibidores de proteases serínicas e cisteínicas. Inibidores provenientes dos fluidos laticíferos em estudo inibiram a atividade proteolítica dos extratos intestinais de ambas as larvas. Entretanto, análise in vivo demonstrou que estes inibidores não afetam o desenvolvimento de D. plexippus. Somente o extrato intestinal de D. plexippus apresentou atividade inibidora de proteases do látex de sua planta hospedeira (Calotropis procera). Apenas discretas mudanças foram observadas no perfil proteico das MPs de D. plexippus submetidas às frações proteicas dos fluidos laticíferos in vivo, enquanto que o tratamento in vitro resultou em danos mais acentuados. A partir dos resultados obtidos conclui-se que proteólise e a inibição de proteólise fazem parte do sistema defensivo das larvas especialistas em plantas laticíferas e de suas plantas hospedeiras. Embora inibidores de proteases de fluidos laticíferos sejam capazes de inibir as proteases intestinais das larvas (in vitro), in vivo, a habilidade das proteases intestinais em prontamente digerir as proteínas do látex parece ser crucial para a sobreposição da defesa vegetal.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-05T21:59:32Z No. of bitstreams: 1 TESE_CorrelaçãoAtividadeProteassoma.pdf: 2922794 bytes, checksum: bde4f13f98b7a755e7aadc3b3b3c1f62 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-12T21:23:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE_CorrelaçãoAtividadeProteassoma.pdf: 2922794 bytes, checksum: bde4f13f98b7a755e7aadc3b3b3c1f62 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-12T21:23:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_CorrelaçãoAtividadeProteassoma.pdf: 2922794 bytes, checksum: bde4f13f98b7a755e7aadc3b3b3c1f62 (MD5) Previous issue date: 2011 / Os inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI) são moléculas protéicas contendo dois domínios inibitórios distintos para enzimas semelhantes à tripsina e quimotripsina. O interesse por essa classe de inibidores decorre de estudos que demonstraram o efeito protetor dos BBI no câncer induzido quimicamente. No presente trabalho avaliou-se o efeito dos BBI isolados de Macrotyloma axillare e Glycine max na prevenção de neoplasias colo-retal induzidas por injeções intraperitoneais de dimetilhidrazina (DMH) durante 12 semanas. Os grupos de camundongos controle e testes (tratados com DMH) receberam uma dieta contendo BBI, na dose de 0,1% (p/p) associada (DMHV) ou não às vitaminas A, C e E, durante 24 semanas. Camundongos tratados com DMH apresentaram alterações histopatológicas compatíveis com a formação de pólipos neoplásicos. Em concordância com a histologia, a análise do marcador tumoral CD44, por Western blotting, revelou aumento significativo de expressão nos animais tratados com DMH e DMHV. Os extratos protéicos provenientes desses tecidos apresentaram aumento significativo de atividade proteolítica dependente de proteassoma, em ensaios peptidásicos para as atividades tripsina e quimotripsina símiles. Por outro lado, para o grupo de animais tratados com DMH e BBI observou-se atividade proteassomal comparável àquela dos animais do grupo controle. O tratamento de animais com BBI isoladamente promoveu a redução da atividade proteolítica dependente de proteassoma quando comparada àquela de animais alimentados com dieta normal. Além disso, retenção de enzimas com atividades proteolíticas tripsina e quimotripsina-símile, provenientes das frações lisossomal e solúvel, foi observada utilizando uma coluna de afinidade sepharose-BBI. As atividades dessas enzimas também se mostraram significativamente aumentadas no grupo de animais tratados com DMH. Esses resultados demonstraram que inibições de atividades proteolíticas distintas podem contribuir para o mecanismo protetor dos BBI. Coletivamente os resultados permitiram concluir que o tratamento com BBI foi capaz de prevenir a formação de pólipos intestinais, impedir o estabelecimento de eventos inflamatórios no intestino delgado, cólon e glândula anal, e manter em níveis normais o marcador clássico tumoral CD44. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Bowman-Birk inhibitors (BBI) are protein molecules containing two distinct inhibitory domains for trypsin and chymotrypsin-like enzymes. The interest for this class of inhibitors is based on studies which demonstrated a protective effect promoted by BBI, particularly for chemically-induced cancers. In the present work, we evaluated the effects of BBI isolated from Macrotyloma axillare and Glycine max in the prevention of colon cancers induced by intraperitoneal injections of dimethylhydrazine (DMH) during 12 weeks. Control and DMH-treated animals were fed a diet containing BBI at a dose of 0.1% (p/p) associated (DMHV) or not with the vitamins A, C and E, during 24 weeks. DMH-treated animals exhibited hystopathological alterations compatible with the formation of neoplastic polyps. In agreement with the hystological examinations, analysis of the tumor marker CD44, by Western blotting, revealed a significant increase in its expression for the DMH-treated group. Protein extracts from these tissues also contained increased proteasome-dependent proteolytic activity as judged by peptidase assays for the trypsin and chymotrypsin-like activities. In contrast, for DMH + BBI-treated animals proteasomal activity was comparable to that observed for the control group. In fact, animals given BBI alone, as a diet supplement, exhibited decreased proteasomal activity when compared to that from animals fed a normal diet. In addition, by using a sepharose-BBI affinity column, it was observed retention of enzymes displaying trypsin and chymotrypsin-like activities obtained from the lysosomal and soluble fractions. These proteolytic activities were also shown to be increased for DMH-treated animals. These results suggest that the inhibition of distinct proteolytic activities could account for the protective mechanisms produced by BBI. Collectively our analyses allowed us to conclude that BBI treatment was able to prevent intestine polyp formation, decrease any associated inflammatory processes and keep at basal levels the classic tumor marker CD44.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-04T10:47:40Z No. of bitstreams: 1 MARY-ANN ELVINA XAVIER.pdf: 1811588 bytes, checksum: b6a72e0cbefad213d4d0806947b0b504 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-21T13:44:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MARY-ANN ELVINA XAVIER.pdf: 1811588 bytes, checksum: b6a72e0cbefad213d4d0806947b0b504 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-21T13:44:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARY-ANN ELVINA XAVIER.pdf: 1811588 bytes, checksum: b6a72e0cbefad213d4d0806947b0b504 (MD5) / Com o intuito de desenvolver novos materiais para tratamento do câncer, o objetivo deste trabalho foi associar dois componentes, sendo um com atividade anticarcinogênica comprovada: o BTCI e nanopartículas de maghemita recobertas por dextrana (MagDex) e caracterizar magnética e biofisicamente o complexo formado. A atividade antitumoral do BTCI foi comprovada contra células MCF-7 e essa molécula associada às nanopartículas biocompatíveis pode ser direcionada para um local sítio específico e lisar células tumorais no processo de magnetohipertermia. A caracterização do complexo foi feita pelos métodos: microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, espalhamento de luz dinâmico (diâmetro hidrodinâmico, potencial zeta e polidispersividade), fluorescência (número de sítios e constante de associação), dicroismo circular, ensaios enzimáticos colorimétricos para avaliação da atividade inibitória do BTCI, birrefrigência magnética estática, ensaios de associação do inibidor. De acordo com análises de diâmetro hidrodinâmico, o BTCI complexou com as nanopartículas de MagDex. A constante de associação do complexo foi de 104 M-1 em pH 4,0 e 103 M-1 em pH 7,4 e pH 10,0. Segundo os parâmetros termodinâmicos, nessas três condições de pH, a associação do complexo foi espontânea, dirigida entropicamente com contribuições de associações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio. A associação de BTCI a MagDex não alterou o conteúdo das estruturas secundárias, nem a atividade inibitória do BTCI complexado contra suas enzimas cognatas de forma expressiva. Adicionalmente, BTCI-MagDex manteve as características magnéticas de MagDex, como a maior resposta de susceptibilidade magnética a campos de (300 Oe), mesmo após diluições. O ensaio de sedimentação magnética sugere que 80% do BTCI associa às nanopartículas. Em conclusão, os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que BTCI-MagDex apresenta características físico-químicas que favorecem a estabilidade e atividade do BTCI e a manutenção das propriedades magnéticas das nanopartículas, condição esta que é fundamental para estudos futuros que visem a aplicação desse sistema na terapia contra o câncer. / In order to develop new materials for the treatment of cancer, the objective was to associate two components, one with proven anticancer activity: the BTCI and maghemite nanoparticles coated with dextran (MagDex) and magnetic and biophysically characterize the complex formed. The antitumor activity of BTCI was proven against MCF-7 cells and this molecule associated with biocompatible nanoparticles can be targeted to a specific site location and kill tumor cells in the process of magnetohipertermia. The characterization of the complex was made by the methods: transmission electron microscopy and scanning electron microscopy, dynamic light scattering (hydrodynamic diameter, zeta potential and polydispersity), fluorescence (number of sites and association constant), circular dichroism, enzymatic colorimetric assays for assessment inhibitory activity of BTCI, static magnetic birefringence, tests of association of the inhibitor. According to analysis of hydrodynamic diameter, BTCI formed a complex with MagDex nanoparticles. The association constant of the complex was 104 M-1 at pH 4.0 and 103 M-1 at pH 7.4 and pH 10.0. According to the thermodynamic parameters, these three pH conditions, the association of the complex was spontaneous, entropically driven with contributions from hydrophobic associations and hydrogen bonding. The association of BTCI-MagDex did not alter the content of secondary structures, nor the inhibitory activity of the complexed BTCI against their cognate enzymes significantly. Additionally, BTCI-MagDex kept MagDex magnetic characteristics, such as susceptibility response to magnetic fields (300 Oe), even after dilution. The test of magnetic sedimentation suggests that 80% of BTCI associated with nanoparticles. In conclusion, the results suggest that BTCI-MagDex has physicochemical characteristics that favor the stability and activity of BTCI and maintenance of the magnetic properties of nanoparticles, a condition which is critical for future studies aimed at applying this system in therapy against cancer.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-12-09T12:09:31Z No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Os venenos de serpentes são muito pesquisados pela diversidade de moléculas e suas atividades. Dentre as principais classes de moléculas presentes nesses venenos podem ser destacas PLA2s e neurotoxinas, por possuírem moléculas com ações ocultas, presentes em diferentes sítios das mesmas moléculas. As serpentes da família Elapidae são excelentes representantes desta diversidade, por apresentarem os dois tipos de moléculas. As serpentes brasileiras da família Elapidae estão restritas ao gênero Micrurus, chamadas corais-verdadeiras, pela coloração característica. Micrurus frontalis representa bem esse gênero devido à diversidade de moléculas contidas em seus venenos e alta imunogenicidade, que a levou a ser a principal espécie utilizada na fabricação de soro antielapídico. Este estudo objetivou o isolamento de PLA2s presentes no veneno de Micrurus frontalis, e caracterização de atividades de peptídeos encriptados em suas estruturas primárias. Foram purificadas aproximadamente 30 frações doveneno de M. frontalis por meio de RP-HPLC em coluna semipreparativa, onde as de concentração de fase móvel ACN de eluição maior que 35% em geral apresentavam ao menos uma molecula de massa correspondente à de PLA2s. A fração Mf18 foi escolhida pela pureza e abundancia do componente de massa 13.447,37 Da. Sua estrutura primária foi determinada por Degradação de EDMAN e seqüenciamento de novo após redução, alquilação e digestão com enzima Glu-C. Após comparação com banco de dados de PLA2s presentes em venenos de Elapídeos, a proteína Mf18 foi enquadrada por homologia, na categoria de PLA2s de Classe I, pela presença da alça elapídica característica, número de pontes dissulfeto e comprimento da sequência. Pela conservação da região correspondente à alça ligante ao íon calcio de todas as outras enzimas da Classe I, e pela identidade de seu N-terminal com peptídeos opióides, principalmente encefalina, foram sintetizados 3 peptídeos chamados Elapidorfina-Y, Elapidorfina-W e Elapidorfina-F. Os peptídeos encontrados encriptados na sequência da PLA2 de M. frontalis foram liberados através de síntese em sílica. Após síntese em fase sólida por Fmoc e purificados, as atividades antinociceptivas foram avaliadas pelo ensaio de tailflick e ensaio de formalina. O peptídeo Elapidorfina-Y apresentou significativa atividade antinociceptiva quando comparada ao controle, que se mostrou dependente da dose, do tempo após aplicação e da relação dose X tempo após aplicação. Essa atividade em doses nanoMolares foi comparável aquela obtida com morfina. Nos ensaios de formalina, todos os peptídeos apresentaram atividade antinociceptiva, sendo notadamente maior do que o controle na fase inflamatória para o peptídeo Elapidorfina-W. Muitas proteínas são fontes de peptídeos menores, utilizando para isso diversas formas de serem obtidas, sendo a principal as clivagens de suas sequências mais longas em sítios específicos, dando origem a peptídeos com diversas atividades biológicas, em alvos distintos. Um exemplo dessa possibilidade é o peptídeo Crotalphine que possui atividade antinociceptiva, e a mesma sequência da porção N-terminal da Crotoxina, proteína isolada do mesmoveneno (Crotalus durissus). Os resultados obtidos concordam com o descrito para a própria encefalina, que também é resultado da liberação endógena de um peptídeo por meio de modificações postraducionais da proteína precursora Proencefalina. O presente trabalho mostrou a identificação e caracterização parcial de PLA2 doveneno de Micrurus frontalis e apresentou a atividade antinociceptiva no SNC e periférica de peptídeos liberados de sua sequência por meio de síntese em fase sólida. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Many researches focus on snake venoms due to the diversity of the molecules they possess and their activities. Among the main classes of molecules in these venoms, the PLA2s and neurotoxins are emphasized for pursuing different effects encrypted in each site. The elapidae snakes are excellent representatives of such diversity, because their venoms contain the two kinds of molecules. The brazillian elapidae are restricted to the Micrurus genus also known as the coral-snakes for their characteristic color. Micrurus frontalis well represents this genus for the diversity of molecules and high immunogenicity of its venom that led to its use in the manufacturing of the elapidae antivenom. The objective of this study was to identify, characterize and evaluate the PLA2s present in M. frontalis venom and isolate encrypted peptides with sequences similar to that of bioactive peptides. The initial chromatography step led to the fractionation of the crude M. frontalis venom in approximately 30 fractions by RP-HPLC with C18 semi preparative column. Each fraction that eluted at an ACN mobile phase concentration of 35% and more had at least one molecule with molecular mass corresponding to that of a PLA2. Fraction Mf18 was chosen for its purity and abundance of a component with a mass of 13.447,37 Da, which was then reduced, alkylated had its N-terminal sequenced by EDMAN degradation. The main fraction resulting of refractioning with analytical C18 was digested using a GLU-C V8 enzyme. Each generated enzymatic cleavage fragment was purified and had their primary structure determined by de novo sequencing. After comparisons with online elapidae snake PLA2s databanks, Mf18 protein was placed in the Class I snake PLA2s category due to its similarity, the presence of the elapid loop, the number of disulfide bridges and the sequence length. The high conservation of the region corresponding to the Calcium binding loop among all the Class I snake PLA2s and the identity of this region’s N-terminal to enkephalin’s, led us to use it as a model for the synthesis of three peptides named Elapidorphin-Y, Elapidorphin-W e Elapidorphin-F which only differ in their N-terminal by Y,W and F. Tertiary structure alignment of PLA2s from elapid snakes venoms and mammal pancreas also revealed similarity in the three dimensional structure of this region. After the synthesis, they were purified and had their sequence confirmed my mass spectrometry fragmentation and sequencing. Since the primary and tertiary structures resembles that of the antinociceptive peptide enkephalin, antinociceptive activity was evaluated through the tailflick and the formalin assay. The Elapidorphin-Y peptide presented significant antinociceptive activity when compared to control, dependent on the dose, time after infusion and the relation dose X time. This activity in nanoMolar scale was comparable to that of morphine. In the formalin assays, all the peptides presented antinociceptive activity, and was statistically higher than control in the inflammatory phase for the peptide Elapidorphin-W. The encrypted peptides discovered in a M. frontalis PLA2 sequence were released by solid phase synthesis. Many proteins are sources of smaller peptides, using many different mechanisms to be obtained, among which the main is the cleavage of their sequence at specific sites by endoproteinases originating peptides with diverse activities in various localities. The peptide Crotalphine possesses antinociceptive activity, and in a interesting way presents the same sequence as the Nterminal portion of Crotoxin, a longer PLA2 isolated from the venom of Crotalus durissus, raising the possibility of multiple cleavages after the endogenous synthesis. The obtained results agrees with the described for enkephalin itself, which is also the result of the cleavage from its precursor protein Proenkephalin by different enzymes. In conclusion, the present work showed for the first time the partial sequence of a PLA2 from the venom of M. frontalis and the peripheral and central nervous system antinociceptive activity of peptides released from its sequence by solid phase synthesis.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-13T16:48:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lidiane (versão final).pdf: 2079756 bytes, checksum: 59bb3bdcf001b436d125cd653b130aea (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T16:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lidiane (versão final).pdf: 2079756 bytes, checksum: 59bb3bdcf001b436d125cd653b130aea (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / CAPES / A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) é um dos peixes mais importantes para a aquicultura brasileira, apresentando-se como o mais cultivado no país. Suas vísceras têm sido estudadas para obtenção de biomoléculas, especialmente as proteases digestivas que apresentam alta eficiência catalítica e estabilidade em diferentes condições. Dentre as proteases digestivas da tilápia do Nilo, destaca-se a tripsina, que apresenta características favoráveis a sua aplicação na área biotecnológica e industrial. Com o propósito de ampliar o conhecimento acerca desta enzima, o presente trabalho objetivou purificar e caracterizar bioquimicamente uma tripsina-símile do intestino de O. niloticus. A purificação da enzima foi realizada seguindo quatro etapas: aquecimento a 45 °C, fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de exclusão molecular e afinidade. A pureza da tripsina foi verificada através da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e o peso molecular de 23,9 kDa foi confirmado a partir da espectrometria de massa (MALDI-TOF). A atividade da enzima foi testada na presença de inibidores específicos para proteases, com forte inibição de sua atividade por TLCK e PMSF. Ademais, a tripsina da tilápia apresentou atividade em ampla faixa de pH (7,0 a 12,0) e manteve-se ativa a altas temperaturas, conservando sua atividade até 60 °C. O íon cálcio e o polietilenoglicol (PEG), em diferentes concentrações, apresentaram efeito ativador da enzima. A tripsina manteve atividade residual acima de 70 % na presença de surfactantes (Tween 20, Triton x-100, Triton X-450 e saponina), exceto na presença de SDS, que foi responsável por uma redução acima de 50% na atividade da enzima. A tripsina-símile da tilápia apresentou eficiência na hidrólise de substratos com asparaginina (N) e treonina (T) na posição P1’ e isoleucina (I), leucina (L) e ácido aspártico (D) na posição P2. Considerando os resultados, foi possível verificar o potencial da tripsina da tilápia do Nilo para aplicações industriais e biotecnológicas, que necessitem da presença de agentes surfactantes, íons e ampla faixa de pH e temperaturas. / Nile tilapia (Oreochromis niloticus) is the most farmed fish in Brazil. Its viscera had been studied to obtain biomolecules, mainly digestive proteases which present high catalytic efficiency and stability at different conditions. Among Nile tilapia digestive proteases, with emphasis to a trypsin, which shows favorable characteristics for its biotechnological and industrial application. In order to increase the knowledge about this enzyme, the present work aimed to purify and characterize biochemically a trypsin-like from O. niloticus intestine. The enzyme purification was carried out following four-step: heating at 45 °C, ammonium sulphate fractionation and size exclusion and affinity chromatography. Trypsin purity was checked by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the molecular weight of 23.9 kDa was confirmed by mass spectrometry (MALDI-TOF). The enzyme activity was tested on the presence of specific protease inhibitors, with stronger inhibition by TLCK and PMSF. Furthermore, tilapia’s trypsin showed activity in a wide pH range (7.0 to 12.0) and high temperatures, keeping its activity until 60 °C. Calcium ion and polyethylene glycol (PEG), at different concentrations presented activator effect on the enzyme. The trypsin kept over 70 % of its activity in surfactants (Tween 20, Triton x-100, Triton X-450 and saponin). SDS was an exception, since it diminished the enzyme activity below 50 %. Moreover, trypsin-like from tilapia showed efficiency by hydrolyzing substrates presenting asparaginine (N) and treonine (T) residues at P1’ position and isoleucine (I), leucine (L) and aspartic acid (D) at P2 position. Considering these results, it was possible to determine the potential of Nile tilapia trypsin to industrial and biotechnological applications that require surfactants agents and ion presence, wide pH range and high temperature.

A proteína recombinante inibidora de serinoprotease denominada de Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense, construída e utilizada para identificar um gene que codifica um inibidor de serinoprotease do tipo Kunitz. O Amblyomin-X inibe a formação da massa tumoral in vivo, no entanto o mecanismo envolvido neste efeito não está totalmente esclarecido. Visto que um dos mecanismos anti-carcinogênicos dos inibidores de serinoproteases é a inibição do processo de angiogênese, este trabalho foi delineado para avaliar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial envolvidas neste processo. A angiogênese in vivo foi estudada em modelo de câmara dorsal por microscopia intravital. Quarenta e oito horas após a implantação da câmara dorsal, os animais receberam tratamento tópico de salina ou de Amblyomin-X por 8 dias, com intervalos de 48 horas a cada dose (10, 100 ou 1000ng/mL). Os efeitos foram avaliados em condições basais e na vigência do crescimento tumoral (injeção de 1x105 células B16-F10 de melanoma murino no tecido subcutâneo). Adicionalmente, os efeitos do Amblyomin-X sobre a permeabilidade vascular foram avaliados pela mensuração espectrofotométrica da quantidade de corante extravasado no tecido dos animais após injeção intradérmica do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) ou do Amblyomin-X. Uma série de estudos in vitro foram realizados em células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End) para avaliar os efeitos do Amblyomin-X (10, 100 e 1000ng/mL) sobre: 1) a migração destas células, usando modelos bidimensional (2D) de cicatrização in vitro e tridimensional (3D) em câmara de Boyden modificada, na ausência e frente ao fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF; 100 ng/mL); 2) sobre a aderência em Matrigel® e 3) sobre a secreção de prostaglandina E2 (PGE2) e a produção de óxido nítrico (NO) por ensaio imunoenzimático e reação de Griess, respectivamente. Ademais, foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre a viabilidade das células B16-F10 (1x105) por citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostram que a aplicação tópica de Amblyomin-X reduziu o número de vasos no tecido subcutâneo dorsal (10ng/mL = 21,7%; 100ng/mL= 35,7%; 1000ng/mL= 36,8% vs 1° dia de tratamento). O mesmo efeito foi observado na presença de células B16-F10 (1000ng/mL= 44,3% vs 1° dia de tratamento), além de uma redução no desenvolvimento da massa tumoral (1000ng/mL= 88% vs controle). O tratamento com Amblyomin-X reduziu a migração basal das células t-End no modelo 2D (10ng/mL=16,4%; 1OOng/mL=23, 1%; 1000ng/mL=26,8% vs controle) e 3D (10ng/mL=39,2%; 100ng/mL=49,4%; 1000ng/mL=50,4% vs controle); inibiu a adesão destas células endoteliais em Matrigel® (100ng/mL=46,4%; 1000ng/mL=48,4% vs controle); não alterou produção os mediadores químicos NO e PGE2 pelas células endoteliais; não modificou a permeabilidade vascular e não alterou a viabilidade das células de melanoma murino B16-F10. Em conjunto, os dados obtidos mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos em condições basais e na vigência de crescimento tumoral in vivo que este efeito pode estar relacionado à redução do desenvolvimento tumoral, uma vez que a concentração de Amblyomin-X que inibe a angiogênese não causou citotoxicidade às células tumorais in vitro. Além disso, os mecanismos envolvidos no processo de angiogênese podem ser decorrentes, pelo menos em parte, de prejuízos na migração e adesão das células endoteliais. / The recombinant serine protease inhibitor protein called Amblyomin-X was obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajennense salivary glands constructed and used to identify a gene encoding a kunitz type serine protease inhibitor. Amblyomin-X presents inhibitory effect on tumoral mass formation in vivo. Nevertheless, the mechanisms involved in the effects have not been clarified. Considering that interference on angiogenesis process is one of the mechanisms responsible for the antitumor activity displayed by serine protease inhibitors, this project was undertaken to study the Amblyomin-X actions on this process and on related endothelial cell functions. In vivo angiogenesis was studied using dorsal chamber model associated to intravital microscopy. Forty eight hours after dorsal chamber implantation, the animals were topically treated with saline or Amblyomin-X during 8 days, with intervals at each 48hs (10, 100 ou 1000ng/mL). The effects were evaluated at basal conditions or during tumoral development (1x105 B16-F10 murine melanoma cells injected into subcutaneous tissue). In addition, the effects of Amblyomin-X on vascular permeability were evaluated by measuring the dye leakage into dorsal intradermic tissue after local injection of vascular endothelial growth factor (VEGF) or Amblyomin-X, or both. In vitro assays were also performed using endothelial cells from microcirculation (t-End) and the effects of Amblyomin-X (10, 100 e 1000ng/mL) were studied on: 1) cell migration, using bidimensional (2D) and tridimensional (3D) models in modified Boyden chamber using chemotatic factor (VEGF100 ng/mL); 2) Matrigel® adherence and, 3) prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO) secretion by enzymatic assay and Griess reaction, respectively. In addition, the Amblyomin-X toxicity was evaluated on the B16-F10 cells (1x105), using flow citometry. Results obtained show that topic application of Amblyomin-X reduced the number of vessels in the subcutaneous dorsal tissue (10ng/mL = 21,7%; 100ng/mL= 35,7%; 1000ng/mL= 36,8% vs 1st day of treatment). The same effect was observed in the presence of B16-F10 cells (1000ng/mL= 44,3% vs 1st day of treatment), simultanesouly to a significant reduction on tumoral mass development (1000ng/mL= 88% vs control). Amblyomin-X treatment impaired basal migration of tEnd in the 2D (10ng/mL=16,4%; 100ng/mL=23, 1%; 1000ng/mL=26,8% vs control) and 3D model (10ng/mL=39,2%; 100ng/mL=49,4%; 1000ng/mL=50,4% vs controle); inhibited the adhesion of t-End in Matrigel® (100ng/mL=46,4%; 1000ng/mL=48,4% vs control); did not alter the production of chemical mediators (PGE2 and NO); did not modify the vascular permeability and did not affect the B16-F10 cells viability. Taken together, data here obtained show that Amblyomin-X inhibited the new vessels formation under basal conditions, and during tumoral development. The effect could be related to the reduction of tumoral progress also detected in vivo, asthe schedule of treatment employed did not induce cancer cell toxicity. The mechanisms involved in the reduced angiogenesis may be related, at least in part, to the impaired endothelial cell migration and adhesion.