Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-10-24T13:59:03Z No. of bitstreams: 1 2012_TayanaKariyadosSantos.pdf: 1916483 bytes, checksum: 1da6d0a3a422596840dde29ca4f8afbd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-29T11:50:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_TayanaKariyadosSantos.pdf: 1916483 bytes, checksum: 1da6d0a3a422596840dde29ca4f8afbd (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-29T11:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_TayanaKariyadosSantos.pdf: 1916483 bytes, checksum: 1da6d0a3a422596840dde29ca4f8afbd (MD5) / Os acidentes ofídicos, causados principalmente por serpentes do gênero Bothrops, são uma importante questão de saúde pública no Brasil. O tratamento de suas vítimas é baseado na administração do soro antiofídico produzido a partir do plasma de cavalos imunizados com peçonha. Por ser composto por anticorpos e outras moléculas, todas de origem equina, a utilização do soro pode gerar diversas respostas imunes adversas contra seus componentes, já que são heterólogos ao paciente. Com o objetivo de desenvolver novos anticorpos humanos para uso clínico, foram isolados Fabs específicos para peçonha de Bothrops atrox a partir de uma biblioteca combinatorial de Fabs humanos apresentada na superfície de fagos. Um deles, Fab D12, foi selecionado para expressão. Como sistema de expressão heteróloga do Fab em questão foi utilizada a levedura metilotrófica Pichia pastoris e o gene heterólogo foi posto sob controle do promotor AOX1, que é fortemente ativado na presença de metanol como única fonte de carbono. O melhor nível de produção em frasco, aproximadamente 30 mg/L, foi alcançado fazendo-se o acúmulo de biomassa durante 24 horas a 30 °C em meio contendo glicerol como fonte de carbono e a etapa de indução da síntese do Fab a 20 °C durante 48 horas, com alimentação de metanol a cada 12 horas. A purificação da proteína de interesse foi realizada por cromatografia de afinidade com íons Ni2+ já que ela carrega em sua porção carboxi-terminal uma cauda de histidina que tem afinidade por esses íons. Por meio de teste de ligação direta à peçonha verificou-se que o Fab D12 puro é capaz de reconhecer o extrato bruto da peçonha. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Snake bites, mainly caused by Bothrops snakes, are an important public health issue in Brazil. The treatment of victims is based on the administration of antiophidic serum which is produced from plasma of horses immunized with venom. As it is composed of antibodies and other molecules, all of equine origin, the serum can cause adverse immune responses against various components as they are heterologous to the patient. Aiming the development of new human antibodies for clinical use, it was isolated Fabs specific for the venom of Bothrops atrox from a combinatorial library of human Fabs displayed on the surface of phage. One of them, Fab D12, was chosen for expression. As system for heterologous expression of the Fab in question was used the methylotrophic yeast Pichia pastoris and the heterologous gene was put under the control of AOX1 promoter, which is strongly activated in the presence of methanol as sole carbon source. The higher level of production in flask, approximately 30 mg/L, was achieved by performing the growth of biomass for 24 hours at 30 ° C in media containing glycerol as sole carbon source and induction of the synthesis of Fab at 20 ° C for 48 hours, with methanol feed at each 12 hours. The purification of the protein of interest was performed by affinity chromatography with Ni2+ ions as it carries on its carboxy-terminus a histidine tail which has affinity for these ions. Through direct binding assay was confirmed that pure Fab D12 is capable of recognizing the crude extract of B. atrox venom.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-12-09T12:09:31Z No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Os venenos de serpentes são muito pesquisados pela diversidade de moléculas e suas atividades. Dentre as principais classes de moléculas presentes nesses venenos podem ser destacas PLA2s e neurotoxinas, por possuírem moléculas com ações ocultas, presentes em diferentes sítios das mesmas moléculas. As serpentes da família Elapidae são excelentes representantes desta diversidade, por apresentarem os dois tipos de moléculas. As serpentes brasileiras da família Elapidae estão restritas ao gênero Micrurus, chamadas corais-verdadeiras, pela coloração característica. Micrurus frontalis representa bem esse gênero devido à diversidade de moléculas contidas em seus venenos e alta imunogenicidade, que a levou a ser a principal espécie utilizada na fabricação de soro antielapídico. Este estudo objetivou o isolamento de PLA2s presentes no veneno de Micrurus frontalis, e caracterização de atividades de peptídeos encriptados em suas estruturas primárias. Foram purificadas aproximadamente 30 frações doveneno de M. frontalis por meio de RP-HPLC em coluna semipreparativa, onde as de concentração de fase móvel ACN de eluição maior que 35% em geral apresentavam ao menos uma molecula de massa correspondente à de PLA2s. A fração Mf18 foi escolhida pela pureza e abundancia do componente de massa 13.447,37 Da. Sua estrutura primária foi determinada por Degradação de EDMAN e seqüenciamento de novo após redução, alquilação e digestão com enzima Glu-C. Após comparação com banco de dados de PLA2s presentes em venenos de Elapídeos, a proteína Mf18 foi enquadrada por homologia, na categoria de PLA2s de Classe I, pela presença da alça elapídica característica, número de pontes dissulfeto e comprimento da sequência. Pela conservação da região correspondente à alça ligante ao íon calcio de todas as outras enzimas da Classe I, e pela identidade de seu N-terminal com peptídeos opióides, principalmente encefalina, foram sintetizados 3 peptídeos chamados Elapidorfina-Y, Elapidorfina-W e Elapidorfina-F. Os peptídeos encontrados encriptados na sequência da PLA2 de M. frontalis foram liberados através de síntese em sílica. Após síntese em fase sólida por Fmoc e purificados, as atividades antinociceptivas foram avaliadas pelo ensaio de tailflick e ensaio de formalina. O peptídeo Elapidorfina-Y apresentou significativa atividade antinociceptiva quando comparada ao controle, que se mostrou dependente da dose, do tempo após aplicação e da relação dose X tempo após aplicação. Essa atividade em doses nanoMolares foi comparável aquela obtida com morfina. Nos ensaios de formalina, todos os peptídeos apresentaram atividade antinociceptiva, sendo notadamente maior do que o controle na fase inflamatória para o peptídeo Elapidorfina-W. Muitas proteínas são fontes de peptídeos menores, utilizando para isso diversas formas de serem obtidas, sendo a principal as clivagens de suas sequências mais longas em sítios específicos, dando origem a peptídeos com diversas atividades biológicas, em alvos distintos. Um exemplo dessa possibilidade é o peptídeo Crotalphine que possui atividade antinociceptiva, e a mesma sequência da porção N-terminal da Crotoxina, proteína isolada do mesmoveneno (Crotalus durissus). Os resultados obtidos concordam com o descrito para a própria encefalina, que também é resultado da liberação endógena de um peptídeo por meio de modificações postraducionais da proteína precursora Proencefalina. O presente trabalho mostrou a identificação e caracterização parcial de PLA2 doveneno de Micrurus frontalis e apresentou a atividade antinociceptiva no SNC e periférica de peptídeos liberados de sua sequência por meio de síntese em fase sólida. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Many researches focus on snake venoms due to the diversity of the molecules they possess and their activities. Among the main classes of molecules in these venoms, the PLA2s and neurotoxins are emphasized for pursuing different effects encrypted in each site. The elapidae snakes are excellent representatives of such diversity, because their venoms contain the two kinds of molecules. The brazillian elapidae are restricted to the Micrurus genus also known as the coral-snakes for their characteristic color. Micrurus frontalis well represents this genus for the diversity of molecules and high immunogenicity of its venom that led to its use in the manufacturing of the elapidae antivenom. The objective of this study was to identify, characterize and evaluate the PLA2s present in M. frontalis venom and isolate encrypted peptides with sequences similar to that of bioactive peptides. The initial chromatography step led to the fractionation of the crude M. frontalis venom in approximately 30 fractions by RP-HPLC with C18 semi preparative column. Each fraction that eluted at an ACN mobile phase concentration of 35% and more had at least one molecule with molecular mass corresponding to that of a PLA2. Fraction Mf18 was chosen for its purity and abundance of a component with a mass of 13.447,37 Da, which was then reduced, alkylated had its N-terminal sequenced by EDMAN degradation. The main fraction resulting of refractioning with analytical C18 was digested using a GLU-C V8 enzyme. Each generated enzymatic cleavage fragment was purified and had their primary structure determined by de novo sequencing. After comparisons with online elapidae snake PLA2s databanks, Mf18 protein was placed in the Class I snake PLA2s category due to its similarity, the presence of the elapid loop, the number of disulfide bridges and the sequence length. The high conservation of the region corresponding to the Calcium binding loop among all the Class I snake PLA2s and the identity of this region’s N-terminal to enkephalin’s, led us to use it as a model for the synthesis of three peptides named Elapidorphin-Y, Elapidorphin-W e Elapidorphin-F which only differ in their N-terminal by Y,W and F. Tertiary structure alignment of PLA2s from elapid snakes venoms and mammal pancreas also revealed similarity in the three dimensional structure of this region. After the synthesis, they were purified and had their sequence confirmed my mass spectrometry fragmentation and sequencing. Since the primary and tertiary structures resembles that of the antinociceptive peptide enkephalin, antinociceptive activity was evaluated through the tailflick and the formalin assay. The Elapidorphin-Y peptide presented significant antinociceptive activity when compared to control, dependent on the dose, time after infusion and the relation dose X time. This activity in nanoMolar scale was comparable to that of morphine. In the formalin assays, all the peptides presented antinociceptive activity, and was statistically higher than control in the inflammatory phase for the peptide Elapidorphin-W. The encrypted peptides discovered in a M. frontalis PLA2 sequence were released by solid phase synthesis. Many proteins are sources of smaller peptides, using many different mechanisms to be obtained, among which the main is the cleavage of their sequence at specific sites by endoproteinases originating peptides with diverse activities in various localities. The peptide Crotalphine possesses antinociceptive activity, and in a interesting way presents the same sequence as the Nterminal portion of Crotoxin, a longer PLA2 isolated from the venom of Crotalus durissus, raising the possibility of multiple cleavages after the endogenous synthesis. The obtained results agrees with the described for enkephalin itself, which is also the result of the cleavage from its precursor protein Proenkephalin by different enzymes. In conclusion, the present work showed for the first time the partial sequence of a PLA2 from the venom of M. frontalis and the peripheral and central nervous system antinociceptive activity of peptides released from its sequence by solid phase synthesis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2010 / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:50:07Z No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / As serpentes corais pertencentes ao gênero Micrurus possuem uma peçonha rica em proteínas e peptídeos biologicamente ativos. No entanto, estudos bioquímicos e farmacológicos com os componentes desses venenos são escassos devido à grande dificuldade de coleta, manutenção em cativeiro das serpentes e a pequena quantidade de veneno obtida em cada extração. O presente estudo descreve o isolamento, a determinação da massa molecular e o seqüenciamento completo e parcial de algumas moléculas biologicamente ativas presentes no veneno de Micrurus frontalis. Os componentes foram purificados após vários passos de fracionamento em cromatografia líquida de fase reversa. A pureza e as massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massa de tipo MALDI-TOF e electrospray (ESI). As sequências de aminoácidos dos componentes nativos e dos peptídeos gerados após proteólise foram determinadas por degradação de Edman e sequenciamento De novo. Foram identificadas toxinas da família de três-dígitos, PLA2 e waprinas. As toxinas do tipo três dígitos receberam o nome de Frontoxinas (FTx) I a VI. As FTx I, II, III e VI possuem 4 ligações dissulfeto conservadas e são estruturalmente similares às ?-neurotoxinas de cadeia curta. Já as FTx IV e V apresentaram alta similaridade com ?-neurotoxinas de cadeia longa, com 10 resíduos de cisteína conservados. Quando aplicadas em junção neuromuscular de rã, as FTx II, III e IV reduziram a amplitude dos potenciais de ação em miniatura de maneira tempo- e concentração-dependente, sugerindo que essas FTxs bloqueiam os receptores nicotínicos de acetilcolina. As PLA2 foram identificadas após o sequenciamento de fragmentos, os quais apresentaram alta similaridade com PLA2 de elapídeos. Uma nova família de proteínas ofídicas, a waprina, foi encontrada na peçonha de M. frontalis. Esta toxina, pouco abundante no veneno, possui quatro ligações dissulfeto conservadas e recebeu o nome de Miwaprina, em virtude da alta identidade com waprina de Naja nigricollis. As FTx I, V, VI, as PLA2s e a Miwaprina, não foram submetidas à testes biológicos devido à quantidade insuficiente de amostra purificada. Este trabalho corresponde ao primeiro estudo de caracterização da estrutura primária e biológica de componentes isolados a partir do veneno de M. frontalis, abrindo perspectivas não só para a identificação dos demais componentes, como também do provável papel dos mesmos na captura de presas e nos envenenamentos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Coral snakes (Micrurus genus) venoms contain a wide spectrum of biologically active proteins and peptides. The major obstacle to study Micrurus venoms is the small amount of material that can be collected. Therefore, the biochemistry and pharmacology of components from coral snakes venoms are mostly unknown. In this study we describe the isolation, molecular mass determination, complete and partial amino acid sequencing of short and long -chain three-finger toxins, PLA2 and waprin isolated from Micrurus frontalis venom. Components were purified using multiple steps of RP-HPLC. Molecular masses were determined by MALDI-TOF and ESI ion-trap mass spectrometry. The amino acid sequences of toxins were determined by sequencing of overlapping proteolytic fragments by Edman degradation and by De novo sequencing. The three-finger toxins were named Frontoxin (FTx) I-VI. The amino acid sequences of FTx I, II, III and VI predict 4 conserved disulphide bonds and structural similarity to previously reported short-chain -neurotoxins. FTx IV and V each contained 10 conserved cysteines and share high similarity with long-chain - neurotoxins. At the frog neuromuscular junction FTx II, III and IV reduced miniature endplate potential amplitudes in a time-and concentration-dependent manner suggesting Frontoxins block nicotinic acetylcholine receptors. Fragments of isolated PLA2 were determined and share high similarity scores with PLA2 from other Elapids. The waprin member possesses four conserved disulfide bonds and showed high identity with waprin from Naja nigricollis venom. Because of the significant sequence similarity with WAPs, the molecule was named Miwaprin. Due the insufficient amount of purified FTx I, V, VI, PLA2s and Miwaprin, these toxins were not submitted to the biological assays. These are the first complete primary structure characterization of M. frontalis snake venom toxins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Gabriela Ribeiro (gaby_ribeiro87@hotmail.com) on 2011-09-19T14:42:10Z No. of bitstreams: 1 2011_KatiaReginaPenaSchesquiniRoriz.pdf: 1493089 bytes, checksum: 3f93522a67b82e0aeb4a6b63353ebc30 (MD5) / Approved for entry into archive by LUCIANA SETUBAL MARQUES DA SILVA(lucianasetubal@bce.unb.br) on 2011-09-20T15:00:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_KatiaReginaPenaSchesquiniRoriz.pdf: 1493089 bytes, checksum: 3f93522a67b82e0aeb4a6b63353ebc30 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-09-20T15:00:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_KatiaReginaPenaSchesquiniRoriz.pdf: 1493089 bytes, checksum: 3f93522a67b82e0aeb4a6b63353ebc30 (MD5) / O Brasil tem o maior número de casos de acidentes por serpentes da América do Sul, os quais na grande maioria se concentram nas regiões Centro-Oeste e Norte. Este trabalho foi o primeiro levantamento realizado na macrorregião de Porto Velho, através do estudo observacional descritivo dos aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais, dos casos de acidentes ofídicos encaminhados ao Centro de Medicina Tropical do Estado de Rondônia (CEMETRON), no período de setembro de 2008 a setembro de 2010. Os dados foram coletados conforme protocolo específico, sendo incluídos pacientes entre 18 e 59 anos e excluídos grupos vulneráveis (indígenas, idosos, gestantes e crianças). Foram estudados 92 casos de envenenamentos por serpentes, sendo 81 homens (88,04%) e 11 mulheres (11,96%), com idade média de 37 anos, oriundos principalmente da zona rural (91,3%). Os acidentes ocorreram durante o desempenho das atividades de trabalho (63%) e na estação do ano correspondente ao inverno amazônico (78,3%). A grande maioria dos casos era procedente da macrorregião de Porto Velho (84,7%). O principal acidente foi do tipo botrópico com 88 casos (95,6%) seguido de 2 casos laquéticos e 2 casos elapídicos. Em 48,9%, o acidente foi classificado como grave e quando correlacionado com o tempo decorrido até a chegada ao hospital (< ou > 6hs), não houve associação entre o tempo decorrido e a gravidade do caso (p=0,565). Foi necessário procedimento cirúrgico em 10 casos (fasciotomia em 9 casos e amputação de membro inferior direito em 1 caso). Não houve óbito nesta casuística, porém 4 casos (4,3%) evoluíram com seqüelas em membros inferiores. Os exames laboratoriais analisados, pré e pós-soroterapia, foram: hematimetria, leucometria, CK, creatinina, TC, ALT, AST e uréia. Ocorreu diminuição significativa nos valores de uréia e creatinina, sendo mais sensível a redução dos níveis de uréia (p=0,000473). Houve aumento dos níveis de ALT no pós-soro (p=0,043903) e os demais parâmetros não apresentaram significância estatística nos seus valores pré e pós-soroterapia. Assim, houve predomínio do acidente do tipo botrópico e grave. A chegada ao hospital em tempo superior a 6 horas e o uso de medicamentos alternativos não influenciou na classificação de gravidade dos acidentes. A função renal apresentou reversão das alterações 48h após soroterapia, porém a ALT aumentou após soroterapia. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brazil has the largest number of cases of bites by snakes of South America, which in the vast majority are concentrated in the Midwest and North. This research was the first survey in macro-region of Porto Velho - Rondonia, through of a descriptive observational, clinical, epidemiological and laboratorial study of cases of snakebites forwarded to the center of Tropical Medicine of Rondônia (CEMETRON) from September 2008 to September 2010. The data were collected according to a specific protocol that included patients between 18 and 59 years old excluding vulnerable groups (indians, elderly, pregnant women and children). We studied 92 cases of envenenomation by snakes, 81 men (88.04%) and 11 women (11.96%), mean age 37 years, coming mainly from rural areas (91.3%). The accidents occurred during the performance of work activities (63%) and the season corresponds to Amazon winter (78.3%). The majority of cases came from the macro-region of Porto Velho (84.7%). Among 92 accidents, 88 (95.6%) were caused by Bothrops, 2 were caused by Lachesis and two were caused by Micrurus. In 48.9% of the cases, the accident was classified as serious, but when correlated with the time elapsed until the arrival at the hospital (prior or after 6 hrs), there was no significant difference between time elapsed and the severity of the case (p = 0.565). Surgery was necessary in 10 cases (9 cases of fasciotomy and 1 case of amputation of right lower limb). There were no deaths in this series, but in 4 cases (4.3%) there were sequelae on lower limbs. Laboratory tests performed before and after serum therapy, were: red and white blood cells count, CK, creatinine, TC, ALT, AST and urea. There was a significant decrease in levels of urea and creatinine in the blood of patients, more expressive in terms of urea (p = 0.000473). There was a significant increased only in ALT serum levels before and after treatment in patients post serum therapy (p=0.0439), other parameters were not significantly different in their values before and after serum therapy. Thus, there was a predominance of snakebites by Bothrops and classified as serious. The arrival to the hospital longer than six hours and the use of alternative drugs did not affect the classification of severity of accidents.Renal function changes reverted to 48h after serum therapy, but ALT increased after serum therapy.