Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Tityus pachyurus é uma das espécies causadoras de escorpionismo grave na Colômbia e pouco se conhece sobre as toxinas que constituem sua peçonha. O presente projeto teve como objetivo principal identificar novas toxinas moduladoras de canais para Na+ na peçonha de T. pachyurus. Pela construção da biblioteca de cDNA da glândula peçonhenta de um escorpião T. pachyurus se identificarem 5 novas toxinas putativas da família dos peptídeos com atividade em canais para Na+ e por similaridade na estrutura primária dos peptídeos maduros, 3 foram classificados como alfa-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 e Tpa6 - e dois como beta- NaScTxs - Tpa7 e Tpa8 -, sendo que a toxina Tpa8 é o primeiro registro de uma beta toxina anti-inseto excitatória na peçonha de escorpiões do Novo Mundo. Essas NaScTxs foram usadas na construção de uma árvore filogenética incluindo NaScTxs do escorpião T. obscurus e de outras identificadas em escorpiões do gênero Tityus e depositadas nos bancos de dados públicos de proteínas. A análise filogenética coincide com a distribuição geográfica dos escorpiões do gênero Tityus divididos nas espécies que ocorrem ao norte do rio Amazonas e naquelas que habitam ao sul do rio Amazonas. A peçonha bruta de T. pachyurus, submetida a fracionamento por RPHPLC usando uma coluna C18, resultou em 55 frações cromatográficas. As três frações mais abundantes foram submetidas a recromatografias e os peptídeos puros obtidos foram seqüenciados por espectrometria de massa (MS). Três seqüências parciais que correspondem a três novas NaScTxs foram obtidas: Tpa9 com 7061,87 Da, Tpa10 com 6994,36 Da e Tpa11 com 7167,23 Da. Essas novas toxinas (500 nM) foram testadas em canais de sódio expressos em células HEK. Tpa9 reduziu em 20% as correntes de Na" em hNavU, como as (3NaScTx.Tpa10 apresentou efeito em hNav1.1, hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6 como as aNaScTx e a Tpa11 em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. A Tpa2, uma (3NaScTx previamente identificada na mesma espécie de escorpião, modificou as correntes de sódio em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. Essas quatro toxinas foram administradas em camundongos via i.p., indicando que Tpa2 e Tpa10 causam escorpionismo classe II (x2= 8,0; p-valor = 0,005) e degeneração vacuolar e infiltrado inflamatório no fígado (x2= 4,4; p-valor = 0,035). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although Tityus pachyurus is the scorpion species which is responsible for the most dangerous cases of scorpionism in Colombia, little is known about its venom toxins. This project aimed to identify new toxins having Na+ channels as molecular targets in the venom of T. pachyurus. By means of the library construction of the cDNA venomous gland of a scorpion T. pachyurus, five new putative toxins from NaScTx peptide family were identified and by the primary structure of the mature peptides, three of them were classified as alpha-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 and Tpa6 - and two as beta-NaScTxs - the Tpa7 and Tpa8. The last one is the first anti-insect excitatory beta-class toxin describedfor a New World scorpion. These five toxins, together with others NaScTxs described for Tityus species were used to construct a phylogenetic tree. Phylogenetic analysis indicated a marked geographic separation between toxins presented in scorpions occurring in the North of the Amazon River and those presented in the scorpions inhabiting the South of the Amazon River. The crude venom of T. pachyurus after being fractionated by RP-HPLC, using a C18 column, resulted in 55 chromatografic fractions. The three most abundant fractions were submitted to further fractioning and the purified peptides were sequenced by mass spectrometry (MS). Three NaScTxs partial sequences were described: Tpa9 with 7061.87 Da, Tpa10 with 6994.36 Da and Tpa11 with 7167, 23 Da. These new toxins (500 nM) were tested on Na+-channels expressed in HEK cells. Tpa9 reduced on 20% the Na+ currents in hNavl.1, similarly as the (3NaScTxs; Tpa10 acted on hNav1.1, hNavl .2, hNav1.3 and hNav1.6 as aNaScTxs, and Tpa11 had effect on hNavl .2, hNavl .3, and hNavl .6. The Tpa2, a (3-toxin previously identified, modified the currents in hNavl.2, hNavl.3 and hNavl .6. These four toxins were injected into mice showing that Tpa2 and Tpa10 caused class II scorpionism (x2 = 8.0, p = 0.005) and vacuolar degeneration and inflammatory infiltration in the liver (x2 = 4.4, p-value = 0.035).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-12-02T15:18:07Z No. of bitstreams: 1 2014_KarinaSmidtSimon.pdf: 7781707 bytes, checksum: 40fadf97a8c91530c0bc1e7607cb65a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-12-03T10:59:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KarinaSmidtSimon.pdf: 7781707 bytes, checksum: 40fadf97a8c91530c0bc1e7607cb65a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-03T10:59:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KarinaSmidtSimon.pdf: 7781707 bytes, checksum: 40fadf97a8c91530c0bc1e7607cb65a6 (MD5) / A ocorrência de infecções causadas por patógenos oportunistas, dentro das UTIs são responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade, caracterizando um grave problema de saúde pública. Um desses patógenos é o Cryptococcus neoformans, um fungo basidiomiceto, causador da criptococose. Essa é uma doença manifestada principalmente por indivíduos imunocomprometidos, onde a incapacidade do organismo desses pacientes de eliminar o fungo acaba por permitir a migração do mesmo para diversos tecidos, incluindo o sistema nervoso. Lá ele se estabelece, causando a meningoencefalite, que é a forma mais grave da doença, e eventual morte. O sucesso terapêutico para a criptococcose é bastante baixo, necessitando-se, então, de novas estratégias para o tratamento da doença. AMPs vem sendo investigados como elementos promissores no tratamento de diversas doenças. Estes peptídeos são encontrados em todos os organismos pluricelulares, onde exercem atividades regulatórias e microbicida. Os peptídeos com atividade protetora do organismo, podem, no caso de animais venenosos, ser expressos constitutivamente nas glândulas de veneno. Considerado que esses peptídeos tem o potencial de eliminar patógenos e alterar a atividade de células relacionadas com a defesa dos organismo, foram testados seis peptídeos para ação fungicida contra o C. neoformans e atividade imunomodulatória com macrófagos murinos. Esses peptídeos foram sintetizados a partir da biblioteca de cDNA das glândulas de veneno de escorpiões das espécies Tityus obscurus, Tityus serrulatus e Hadrurus gerstchi. Testes de atividade hemolítica, atividade citotóxica para células de mamíferos, e capacidade microbicida direta e indireta foram executados para todos os peptídeos. Foi verificada a atividade antinflamatória de dois dos peptídeos, além a da alta tóxicidade para o fungo de um terceiro peptídeo Estes peptídeos apresentaram, na concentração em que foram capazes de exercer suas respectivas atividades, baixa capacidade hemolítica e baixa toxicidade para células de mamíferos. Além disso, foi feito um primeiro esforço para entender a estrutura secundária dos peptídeos com atividades modulatória e microbicida, na tentativa de compreender melhor a ação dessas sequências. A utilização desses peptídeos pode ser considerada promissora para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento da criptococose. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / The occurrence of infections caused by opportunistic pathogens within the ICU is responsible for high morbidity and mortality inside the hospitals, featuring a serious public health problem. One of them is the fungus Cryptococcus neoformans, a basidiomycete that is the cause of cryptococcosis. This is a disease manifested mainly in immunocompromised patients, where the body's inability to eliminate the pathogen eventually allow the fungus migration to various tissues, including the nervous system. There it establishes, causing meningoencephalitis, the most severe form of the disease, and eventual death. Successful treatment for cryptococcosis is rather low, so it becomes a necessity to search for new strategies of treatment for this infirmity. Antimicrobial peptides are being investigated as a promising treatment for many illness. These peptides are found in all multicellular organisms, where they exert regulatory and microbicidal activities. The peptides with protective activity of the organism may be expressed constitutively in venom glands, in the case of poisonous animals. Considering that these peptides has the potential to eliminate pathogens and alter the activity of cells related to the defense of the organisms, here we tested six peptides for a fungicide activity against C. neoformans and immunomodulatory capacity in murine macrophages. These peptides were synthesized from the cDNA library of the venom gland of Tityus obscurus, Tityus serrulatus and Hadrurus gerstchi scorpion species. Tests of hemolytic activity, cytotoxic activities to mammalian cells, and direct and indirect microbicidal capacity were performed for all peptides. There was verified the anti-inflammatory activity of two of the peptides, in addition to the high toxicity to the fungus of a third peptide. At the concentration in which they were able to pursue their activities, these peptides presented low hemolytic capacity and low toxicity to mammalian cells. Furthermore, a first effort has been made to understand the secondary structure of peptides with microbicidal and modulatory activities, in an attempt to better understand the action of these sequences. The use of these peptides may be considered promising for the development of new therapies for the treatment of cryptococcosis.

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-10-24T14:14:09Z No. of bitstreams: 1 2014_NelsonGomesdeOliveiraJunior.pdf: 8361079 bytes, checksum: b75992b75e9b38333265338ebf305382 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:18:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_NelsonGomesdeOliveiraJunior.pdf: 8361079 bytes, checksum: b75992b75e9b38333265338ebf305382 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-24T15:18:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_NelsonGomesdeOliveiraJunior.pdf: 8361079 bytes, checksum: b75992b75e9b38333265338ebf305382 (MD5) / Potamotrygon falkneri e Potamotrygon motoro consistem em espécies de arraias da família Potamotrygonidae. Estas famílias são caracterizadas por terem um ferrão retro-serrilhado coberto por um epitélio glandular produtor de peçonha. A sintomatologia desses acidentes se dá por processos inflamatórios podendo progredir até a necrose e úlceras. O conhecimento acerca dos componentes proteicos desta peçonha ainda é muito limitado. No presente estudo, ferramentas transcritômicas foram utilizadas afim de melhor compreender o conteúdo proteico do ferrão das espécies P. falkneri e P. motoro. Primeiramente, uma extração de RNA com trizol foi realizada com subsequente análise por eletroforese em gel de agarose. Os RNAs obtidos foram sequenciados através da plataforma Illumina MiSeq. Para as análises do perfil transcritômico, as sequências foram montadas de novo através do programa Trinity. Após, para caracterização funcional, os dados foram submetidos à ferramenta BLAST contra base de dados UniProt seguida de subsequente análise na base de dados do KEGG Orthology. Posteriormente, um diagrama de Venn foi elaborado indicando o grau de semelhança entre as espécies. Após análise no KEGG, os transcritos foram divididos em grandes categorias, onde, a mais expressa das categorias correspondeu aos transcritos não relacionados a nenhuma via biológica aparente, representando 30% para P. falkneri e 31% para P. motoro, em seguida a categoria mais abundante e com grande importância foi a de metabolismo com 15% para P. falkneri e 14% para P. motoro. Vale ressaltar também a categoria de processos celulares com 10% para ambas as espécies. Após essa separação de classses, análises das vias relacionadas ao metabolismo e possíveis proteínas relacionadas aos sintomas observados nos acidentes ocasionados por arraias, foram discutidas, tais como, fosfolipases, metaloproteinases e desintegrinas. Em suma, as análises transcritoma ajudarão a elucidar como se dá o processo de envenenamento e quais as possíveis moléculas responsáveis pelos danos causados nesses acidentes, esse estudo permitirá ainda, entender como podemos minimizar os danos causados nesses acidentes, amenizando assim, os danos socioeconômicos causados a essas populações ribeirinhas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Potamotrygon falkneri and Potamotrygon motoro are stingray species from Potamotrygonidae family. This family has a typical aliasing sting covered by glandular epithelium producer venom. The symptomatology of such accidents occurs by inflammatory processes and may lead to necrosis and ulceration. The knowledge about the protein venom components of this, are still very limited. In the present study, transcriptomic tools were used in order to better understand the protein content of P. falkneri and P. motoro sting. Firstly, a RNA extraction was performed using trizol with subsequent agarose gel electrophoresis analysis. The obtained RNAs were sequenced using the Illumina MiSeq platform. For the transcriptome profile analysis, the sequences were de novo assembled by Trinity program. Furthermore, functional characterization was performed, where, data were submitted to BLAST against UniProt database, followed by KEGG Orthology database analysis. Subsequently, a Venn diagram was prepared, indicating the similarity between species. After the KEGG analysis, the transcripts were divided into categories, where the most explicit category was the category with transcripts unrelated to any apparent biological pathways corresponding to 30% for P. falkneri and 31% for P. motoro, in sequence, the most abundant and very important category was metabolism with 15% for P. falkneri and 14% for P. motoro, it is also worth mentioning the category of cellular processes with 10% for both species. After this separation, subsequent analysis of pathways related to metabolism and possible proteins related to symptoms observed in accidents caused by stingrays were discussed, such as, phospholipases, metalloproteinases and disintegrins. In short, the transcriptome analyzes will help elucidate how is the process of poisoning, and what the possible molecules responsible for the damage caused in these accidents, in addition, this study also allow, to understand how we can minimize the damage caused in such accidents, thus mitigating the physical and socio-economic damage to these riverine populations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-08T20:32:58Z No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-11T18:04:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T18:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / O escorpião Tityus fasciolatus faz parte da família Buthidae, que contém espécies causadoras de envenenamentos graves em humanos. As moléculas responsáveis pelos efeitos mais severos são conhecidas como neurotoxinas que, em sua maioria, são componentes peptídicos cujos principais alvos são os canais iônicos, os quais são relevantes para o funcionamento dos diversos sistemas orgânicos. Os compostos relacionados aos envenenamentos por peçonhas de escorpiões são conhecidos por agirem com especificidade nos canais iônicos. Os constituintes proteicos de T. fasciolatus foram caracterizados com o auxílio de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC), com coluna C18 analítica, espectrometria de massa MALDI/ TOF-MS e uma biblioteca transcritômica da glândula de peçonha. Mais de 200 diferentes massas moleculares foram identificadas nas frações cromatográficas, assim como 9.130 transcritos na biblioteca transcritômica, dentre os quais foram identifcados 278 que codificam toxinas. A atividade biológica de três toxinas e de uma fração foram testadas com canais iônicos expressos em oócitos de Xenopus laevis, através da técnica de Voltage clamp de dois eletrodos. Foram utilizados canais de Na+ de mamíferos hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 e rNav1.8/1. Duas toxinas (Tf3 e Tf4) foram classificadas como -NaScTx (Sodium Scorpion Toxins), por causarem aumento da corrente de Na+ e retardo da inativação rápida do canal. A Tf3 foi ativa em hNav 1.1 à hNav1.7, enquanto a Tf4 agiu apenas nos hNav1.2 e hNav1.7. A fração 63 também apresentou atividade α, sendo sua atividade significativa em hNav1.7. A toxina Tf2 foi identificada como -NaScTx, cuja característica é a ativação dos canais de Na+ em potenciais onde antes os canais estavam em repouso. Dentre os oito canais de Na+ de mamífero testados, a Tf2 foi seletiva para hNav1.3, à concentração de 1M. Além da descrição da atividades dessas toxinas de Na+, este trabalho gerou um acervo de sequências de nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, um perfil das massas moleculares associadas aos seus respectivos tempos de retenção, 18 sequências de prováveis NaScTxs e 15 sequências de prováveis KTxs. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tityus fasciolatus is a scorpion belonging to the Buthidae family, known by the species that cause severe evenomation in humans. The molecules responsible for the most severe effects are known as neurotoxins, which are mostly peptide components, targeting ion channels, which are relevant to the functioning of the various organ systems. The compounds responsible for envenomation are usually known to act with specificity on ion channels. The proteic components of T. fasciolatus venom were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), MALDI/TOF mass spectrometry and a transcriptomic library of the venom gland. More than 200 different molecular masses were detected in chromatographic fractions, as well as 9,130 transcripts that encode compounds, among them 278 encode toxins. Two Electrodes Voltage Clamp was used to test the biological activity of three toxins and a fraction in Xenopus laevis oocytes expressing ion channels. The Nav channels used were all mammals, hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 and rNav1.8/1. Two toxins (Tf3 and Tf4) were classified as -NaScTx (Sodium Scorpion toxins), since they cause an increase in Na+ currents and a delay in the rapid inactivation of the channel (Tf3 and Tf4). The Tf3 was active in hNav 1.1 to hNav1.7, while Tf4 affected only hNav1.2 and hNav1.7. Fraction 63 also showed α activity in hNav1.7. Tf2 was identified as β-NaScTx, whose characteristic is the activation of Nav channels at more negative potentials. Among the eight mammal Nav channels tested, Tf2 was hNav1.3 selective, at 1μM. This work led to a collection of sequences of nucleotides and amino acid residues, a molecular mass profile with their respective retention times, and 18 putative NaScTxs and 15 putative KTxs sequences.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Itens 3.4, 4.1, 4.2 e 4.3. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-05-15T10:49:00Z No. of bitstreams: 1 2013_FabiolaFernandesdosSantosCastro_Parcial.pdf: 6574803 bytes, checksum: 704abe7ea9a67b0a5cc45d5fb569ed9d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-15T13:36:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FabiolaFernandesdosSantosCastro_Parcial.pdf: 6574803 bytes, checksum: 704abe7ea9a67b0a5cc45d5fb569ed9d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-15T13:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FabiolaFernandesdosSantosCastro_Parcial.pdf: 6574803 bytes, checksum: 704abe7ea9a67b0a5cc45d5fb569ed9d (MD5) / O surgimento de bactérias resistentes pode ser observado desde a introdução na prática clínica, dos primeiros agentes antimicrobianos. Desde então, a rápida disseminação destes patógenos multirresistentes tem representado uma séria ameaça, considerando-se fatores como as altas taxas de mortalidade, a restrição de tratamentos e a alta prevalência de bactérias resistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar. Até o momento, são considerados, pela comunidade científica internacional, patógenos multirresistentes causadores de infecções/colonizações relacionadas à assistência em saúde: Enterococcus spp resistente aos glicopeptídeos, Staphylococcus spp.resistente ou com sensibilidade intermediária a vancomicina, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii, e Enterobactérias resistentes a carbapenêmicos (ertapenem, meropenem ou imipenem), destacando-se entre estas a Klebsiella pneumoniae e as espécies de Enterobacter,spp. Os peptídeos antimicrobianos (PAM), são capazes de exercer uma atividade antimicrobiana potente contra diferentes e numerosos micro-organismos, além da grande vantagem de não apresentar nenhuma toxicidade às células animais, ou uma toxicidade extremamente baixa. Neste contexto, o estudo de peptídeos isolados da peçonha de artrópodes peçonhentos tem apresentado um grande potencial.Vespas sociais produzem peptídeos com atividade muito superior, até dezoito vezes maior, que espécies solitárias, os quais agem como barreira inicial contra a invasão microbiana das colônias. A peçonha de vespas sociais é constituída por uma variedade de compostos bioativos, com diversas ações farmacológicas, entre elas a antimicrobiana. Neste trabalho foi feita uma avaliação da atividade antimicrobiana de um novo peptídeo isolado da peçonha da vespa social Polybia dimorpha, em testes de inibição do crescimento bacteriano de cepas sensíveis e multirresitentes, gram negativas e gram positivas, por metodologia de disco difusão e microdiluição em caldo, comparando os resultados aos do desempenho de antimicrobianos convencionais utilizados na última linha de tratamento de infecções graves. Isolou-se um peptídeo de pequeno tamanho, de cadeia linear, que demonstrou potente atividade antimicrobiana contra bactérias gram positivas e gram negativas. O peptídeo descrito nesta pesquisa apresenta atividade contra bactérias padrão, conhecidamente sensíveis aos antibióticos comerciais, não portadoras de genes de resistência, e também sobre cepas multirresistentes, nestas últimas em concentrações inferiores a 1μg/mL. A capacidade de inibição do crescimento bacteriano foi maior e mais potente nas cepas com expressão de elaborados mecanismos de resistência. O estudo da peçonha de vespas tem proporcionado uma gama de novos compostos, com ações farmacológicas diferenciadas e que podem ser utilizados como fármacos modelo para o desenvolvimento de novos antimicrobianos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The emerging of multi-drug resistant bacteria can be observed since the introduction of clinical practice of the first antimicrobial agents. Ever since, the rapid spread of these multi-drug resistant pathogens is representing a serious threat, considering factors such as high rates of mortality, treatment restrictions and high prevalence of multi-drug resistant bacteria into the hospital environment. Nowadays, the scientific community considers as multi-drug resistant, the pathogens which are able to cause infections/colonizations related to health assistance: glycopeptides resistant Enterococcus spp; vancomycin resistant or reduced susceptibility Staphylococcus spp; Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii and carbapenem-resistant enterobacterias (ertapenem, imipenem or meropenem), among those, highlighting Klebsiella pneumoniae and Enterobacter spp. The antimicrobial peptides (PAM) are capable of produce a powerful antimicrobial activity against different and various microorganisms, also presenting the great advantage of having no toxicity consequences to animal cells, or an extremely low toxicity. In this sense, the study of those peptides isolated from the venom of poisonous arthropods has shown a great potencial. Social wasps can produce peptides with a much higher superiority, up to eighteen times more, than lonely species, which act as an initial barrier against microbial invasion of the colonies. The venom of social wasps comprises a variety of bioactive compounds, with many pharmacologic actions, including antimicrobial. In this study, an evaluation of the antimicrobial activity of a new peptide isolated from the venom of the social wasp Polybia dimorpha was made, with bacterial inhibition of growth tests using strains of multi-drug resistant gram-negative and gram-positive bacteria, by disk-diffusion and microdilution methodology, comparing the results with the performance from conventional antimicrobial used in the last line treatment for severe infections. An small-sized, straight chained peptide was isolated, demonstrating a powerful antimicrobial activity against both gram-negative and gram-positive bacteria. The described peptide in this research represented activity against standard strains (noncarriers of multi-resistance genes), recognizably sensible against commercialized antimicrobials, and also against multi-drug resistant strains, at concentrations less than 1μg/mL. The bacterial growth inhibition capacity was greater and more powerful in the strains representing more elaborated resistance mechanism expression. The study of the wasps venom is providing a series of new compounds, with differentiated pharmacology actions which can be used as model drugs for the development of new antimicrobials.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-24T19:42:50Z No. of bitstreams: 1 2014_DanielOliveiraFreire.pdf: 1843339 bytes, checksum: 0c23e13ac289983a2324f079c4c1aab6 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T12:18:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DanielOliveiraFreire.pdf: 1843339 bytes, checksum: 0c23e13ac289983a2324f079c4c1aab6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T12:18:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DanielOliveiraFreire.pdf: 1843339 bytes, checksum: 0c23e13ac289983a2324f079c4c1aab6 (MD5) / Nas últimas décadas, a busca por novos antimicrobianos tem despertado o interesse dos pesquisadores pelos Peptídeos Antimicrobianos (AMPs). Os AMPs apresentam em media de 10 a 100 resíduos de aminoácidos e, em geral, fazem parte do sistema de defesa inato dos organismos vertebrados e invertebrados ou de secreções, promovendo uma proteção contra uma variedade de microrganismos. Os AMPs por sua característica catiônica são atraídos pela superfície aniônica das membranas bacterianas, e após a interação, estes peptídeos sofrem mudanças conformacionais, causando uma pertubação na estrutura da bicamada lipídica. Atualmente, um número expressivo de estudos tem identificado da peçonha de vespas diversos peptídeos bioativos classificados por suas estruturas químicas e por suas atividades biológicas, em especial, as ações antimicrobianas. Synoeca surinama é uma vespa social que compõe um pequeno gênero com cinco espécies descritas: S. chalibea, S. virginea, S. surinama, S. septentrionalis e S. cyanea. Frente ao desafio do crescente número de cepas resitentes e à potencialidade dos peptídeos como precursores para a descoberta de novos fármacos antimicrobianos, este trabalho visou buscar novas alternativas para o tratamento de infecções bacterianas. Os ninhos da vespa S. surinama foram coletados na área de mata do Centro Olímpico da UnB (Universidade de Brasília). Para a separação dos constituintes da peçonha por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a peçonha foi liofilizada e resssuspendida em água deionizada com 5% de acetonitrila e 0,1% de ácido trifluoracético. A avaliação da ação antimicrobiana foi realizada pela técnica de microdiluição em placas para determinação do MIC (Concentração Inibitória Mínima). Um peptídeo da classe dos mastoparanos foi isolado apresentando uma massa molecular de 1594,8 Da. O peptídeo foi sequenciado em por MALDI/TOF no modo linear refletido. A sequencia foi determinada como I/L-N-W-I/L-K-I/L-G-K-K-I/L-I/L-A-S-I/L-NH2. Trata-se de peptídeo inédito, pois não foi encontrado nos bancos de dados referências desta sequencia. O peptídeo foi, então, denominado Synoeca-MP e foi sintetizada pela AminoTech Pesquisa e Desenvolvimeto Ltda. O peptídeo Synoeca-MP foi testado contra 10 cepas ATCC nas doses: 62,5; 31,5; 15,6, 6,25; 3,12; 1,5 e 0,62 μM. O Synoeca-MP apresentou uma exelente ação antimicrobiana, para as doses testadas o MIC50 variou de 1,97 μM a 10,8 μM e o MIC90 variou de 1,24 μM a 17,8 μM. Os valores dos MICs foram calculados estatisticamente por regressões não-lineares sigmoidais. O EC50 calculado para a atividade hemolítica do peptídeo foi de 185μM, que representa 17 vezes a dose antimicrobiana efetiva mais alta realizada nos ensaios. Sendo assim, o Synoeca-MP pode ser considerado um promissor fármaco antimicrobiano. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In recent decades , the search for new antimicrobials has piqued the interest of researchers for Antimicrobial peptides ( AMPs ) . The AMPs have on average 10 to 100 amino acid residues and usually are part of the innate defense of vertebrate and invertebrate organisms or secretion system , providing a protection against a variety of microorganisms. The MPAs by its cationic character are attracted to the anionic surface of bacterial membranes , and after the interaction , these peptides undergo conformational changes , causing a disturbance in the structure of the lipid bilayer . Currently , a significant number of studies have identified the wasp venom of many bioactive peptides ranked by their chemical structures and their biological activities , in particular , the antimicrobial actions . Synoeca surinama is a social wasp which makes up a small genus with five species are described: S. chalibea , virginea , S. surinama , S. septentrionalis and S. cyanea . Forward to the challenge of the increasing number of seem quite resistant strains and potential of peptides as precursors for the discovery of new antimicrobial drugs , this work aims to seek new alternatives for the treatment of bacterial infections . Wasp Nests S. surinama were collected in the forested area of the Olympic Centre at UNB ( University of Brasilia ) . For the separation of the constituents of the venom by high performance liquid chromatography (HPLC ), the venom is lyophilized and resssuspendida in deionized water with 5% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid. The evaluation of the antimicrobial activity was performed by microdilution plates for determination of MIC ( Minimum Inhibitory Concentration ) . A class of peptide was isolated mastoparanos having a molecular mass of 1594.8 Da The peptide was sequenced by MALDI / TOF reflected in the linear mode. The sequence was determined as I/LNWI/LKI/LGKKI/LI/LASI/L-NH2 . This is unheard of peptide because it was not found in the data banks of references this sequence . The peptide was then called Synoeca - MP and was synthesized by Aminotech Research and Desenvolvimeto Ltda . The Synoeca - MP peptide was tested against 10 strains ATCC doses : 62.5 ; 31.5 ; 15.6, 6.25; 3.12; 1.5 and 0.62 mM . The Synoeca - MP presented an excellent antimicrobial activity for the MIC50 doses tested ranged from 1.97 mM to 10.8 mM and MIC90 ranged from 1.24 mM to 17.8 mM . The MIC values were calculated statistically by a sigmoidal non- linear regression. The EC50 calculated for the hemolytic activity of the peptide was 185μM , which is 17 times the highest effective dose antimicrobial held in rehearsals. Thus, the Synoeca -MP could be considered a promising antimicrobial drug .

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2010 / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:50:07Z No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / As serpentes corais pertencentes ao gênero Micrurus possuem uma peçonha rica em proteínas e peptídeos biologicamente ativos. No entanto, estudos bioquímicos e farmacológicos com os componentes desses venenos são escassos devido à grande dificuldade de coleta, manutenção em cativeiro das serpentes e a pequena quantidade de veneno obtida em cada extração. O presente estudo descreve o isolamento, a determinação da massa molecular e o seqüenciamento completo e parcial de algumas moléculas biologicamente ativas presentes no veneno de Micrurus frontalis. Os componentes foram purificados após vários passos de fracionamento em cromatografia líquida de fase reversa. A pureza e as massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massa de tipo MALDI-TOF e electrospray (ESI). As sequências de aminoácidos dos componentes nativos e dos peptídeos gerados após proteólise foram determinadas por degradação de Edman e sequenciamento De novo. Foram identificadas toxinas da família de três-dígitos, PLA2 e waprinas. As toxinas do tipo três dígitos receberam o nome de Frontoxinas (FTx) I a VI. As FTx I, II, III e VI possuem 4 ligações dissulfeto conservadas e são estruturalmente similares às ?-neurotoxinas de cadeia curta. Já as FTx IV e V apresentaram alta similaridade com ?-neurotoxinas de cadeia longa, com 10 resíduos de cisteína conservados. Quando aplicadas em junção neuromuscular de rã, as FTx II, III e IV reduziram a amplitude dos potenciais de ação em miniatura de maneira tempo- e concentração-dependente, sugerindo que essas FTxs bloqueiam os receptores nicotínicos de acetilcolina. As PLA2 foram identificadas após o sequenciamento de fragmentos, os quais apresentaram alta similaridade com PLA2 de elapídeos. Uma nova família de proteínas ofídicas, a waprina, foi encontrada na peçonha de M. frontalis. Esta toxina, pouco abundante no veneno, possui quatro ligações dissulfeto conservadas e recebeu o nome de Miwaprina, em virtude da alta identidade com waprina de Naja nigricollis. As FTx I, V, VI, as PLA2s e a Miwaprina, não foram submetidas à testes biológicos devido à quantidade insuficiente de amostra purificada. Este trabalho corresponde ao primeiro estudo de caracterização da estrutura primária e biológica de componentes isolados a partir do veneno de M. frontalis, abrindo perspectivas não só para a identificação dos demais componentes, como também do provável papel dos mesmos na captura de presas e nos envenenamentos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Coral snakes (Micrurus genus) venoms contain a wide spectrum of biologically active proteins and peptides. The major obstacle to study Micrurus venoms is the small amount of material that can be collected. Therefore, the biochemistry and pharmacology of components from coral snakes venoms are mostly unknown. In this study we describe the isolation, molecular mass determination, complete and partial amino acid sequencing of short and long -chain three-finger toxins, PLA2 and waprin isolated from Micrurus frontalis venom. Components were purified using multiple steps of RP-HPLC. Molecular masses were determined by MALDI-TOF and ESI ion-trap mass spectrometry. The amino acid sequences of toxins were determined by sequencing of overlapping proteolytic fragments by Edman degradation and by De novo sequencing. The three-finger toxins were named Frontoxin (FTx) I-VI. The amino acid sequences of FTx I, II, III and VI predict 4 conserved disulphide bonds and structural similarity to previously reported short-chain -neurotoxins. FTx IV and V each contained 10 conserved cysteines and share high similarity with long-chain - neurotoxins. At the frog neuromuscular junction FTx II, III and IV reduced miniature endplate potential amplitudes in a time-and concentration-dependent manner suggesting Frontoxins block nicotinic acetylcholine receptors. Fragments of isolated PLA2 were determined and share high similarity scores with PLA2 from other Elapids. The waprin member possesses four conserved disulfide bonds and showed high identity with waprin from Naja nigricollis venom. Because of the significant sequence similarity with WAPs, the molecule was named Miwaprin. Due the insufficient amount of purified FTx I, V, VI, PLA2s and Miwaprin, these toxins were not submitted to the biological assays. These are the first complete primary structure characterization of M. frontalis snake venom toxins.