Doctor en Farmacología / Kisspeptina es un péptido de 145 aa. el cual juega un rol clave en la secreción de GnRH, participando en conjunto con las catecolaminas en la regulación de la ovulación a nivel hipotalámico. La mayoría de las neuronas kisspeptinérgicas en el núcleo paraventricular del hipotálamo coexpresan mRNA para tirosina hidroxilasa (TH), lo que sugiere una estrecha relación catecolaminérgica-kisspeptinérgica. El hecho que kisspeptina se exprese en el bulbo raquídeo y en las astas dorsales de la medula espinal, sugiere la existencia de un mecanismo de comunicación hacia y desde los órganos periféricos en el cual participe la kisspeptina. A nivel periférico, se ha descrito que kisspeptina y su receptor es sintetizado en células del ovario (siendo las células de la teca una de las que la expresa) y que aumenta su expresión antes de la ovulación, sin establecer aún la función de kisspeptina intraovárica. Estos antecedentes, siguieren que podría existir un control kisspeptinérgico neuronal que llega al ovario a través del sistema simpático (kisspeptina extraovárica) y por otra parte la kisspeptina intraovárica podría estar bajo control simpático, la cual podría ser importante en la regulación de la función ovárica. Con estos antecedentes, se postuló la hipótesis que: “Kisspeptina se expresa en el eje ganglio celíaco-ovario y es activado por el sistema simpático. En el ovario kisspeptina activa la esteroidogénesis y regula la función ovárica tanto en la pubertad como durante la etapa adulta”. Para responder esta hipótesis: se caracterizó la expresión de kisspeptina y su receptor en ganglio celíaco y ovario. Se estudiaron los cambios durante el desarrollo puberal, sobre la apertura vaginal, la ciclicidad estral y la secreción hormonal. Se determinaron los efectos de la estimulación adrenérgica sobre la expresión de kisspeptina en el ovario in vitro y por el estrés por frío crónico de 4 y 8 semanas de duración in vivo. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que: 1.- Kisspeptina se sintetiza en ganglio celíaco y en el ovario, el cual fue determinado por PCR en tiempo real y EIA. Además, se colocaliza con neuronas TH positivas como muestran las inmunohistofluorescencia. Más importante aún es que kisspeptina aumenta en el eje ganglio celiaco-ovario al inicio de la pubertad, participando en la regulación del desarrollo folicular y la ciclicidad estral en ratas adultas. Esto fue confirmado al bloquear la acción de kisspeptina (antagonista p234), en el cual se retrasó la apertura vaginal, sugiriendo que kisspeptina podría jugar un rol protector de la ovulación. 2.- Kisspeptina se expresa tanto en células de la granulosa y de la teca en ovarios de rata. La inmunodetección mostró reactividad positiva desde folículos primarios hasta preovulatorios. 3.- Kisspeptina es regulado por el sistema simpático ya que la activación in vitro de receptores β-adrenérgica aumenta la expresión de la kisspeptina ovárica. Es así como una sobre activación del sistema simpático (eje hipotálamo-ganglio-ovario) mediante un estrés agudo (64 horas a 4°C) o crónico (3 hrs/día a 4°C durante 5 días a la semana por 4 and 8 semanas) altera el sistema kisspeptinérgico periférico (eje GC-O). 4.- Con respecto a la función ovárica, la administración in-vivo de kisspeptina (bomba miniosmótica Alzet) mostró que posee un efecto esteroidogénico, aumentando la concentración plasmática de testosterona y progesterona. Además, favorece la mantención de los cuerpos lúteos, posiblemente inhibiendo la luteólisis. Esto determinado al administrar directamente en el ovario kisspeptina a través de un minibomba osmótica. Por otro lado el bloqueo de la acción de kisspeptina por el antagonista p234 no mostró efectos significativos en la función reproductiva. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis han mostrado que kisspeptina es sintetizada en ganglio celíaco (kisspeptina extraovárica), siendo parte de una vía neuronal (eje H-GC-O) que podría contribuir en la regulación de la función ovárica. Por otra parte, la kisspeptina intraovárica presente en todos los folículos en desarrollo estaría participando en el proceso ovulatorio. Los resultados siguieren que participa en el proceso de ovulación, teniendo una función esteroidogénica y protectora de este proceso. / Kisspeptin, is a peptide of 145 aa that has been described as key components in the GnRH secretion playing a complementary role with catecholamines. Studies have shown that most of the kisspeptin neurons in the paraventricular nucleus coexpress the mRNA for tyrosine hydroxylase (TH), suggesting a close kisspeptin-catecholamine relationship. Moreover, kisspeptin is present in other regions in the central nervous system, as the medulla oblongata and the dorsal horn in the bone marrow, suggesting that kisspeptin could be involved in both afferent and efferent pathway. At peripheral level, it has been described that kisspeptin and its receptor GPR54 is expressed in the ovary (especially at the theca cells of the ovarian follicle), and its expression increase before the ovulation without known function in the ovulatory process. Available data suggest that it could exist a neuronal kisspeptinergic network that arrive to the ovary through the sympathetic nervous system (extraovarian kisspeptin) and on the other hand, an intraovarian kisspeptin system without known if they could be controlled by the sympathetic nervous system, and if this control could be important for the ovarian function. Thus, we postulated that: “Kisspeptin is expressed in the celiac ganglion-ovary axis and it is activated by the sympathetic system. In the ovary, kisspeptin activate the steroidogenesis and regulates the ovary function, both during the pubertal and the adult age”. To answer this hypothesis the kisspeptin and GPR54 expression was characterized in the celiac ganglion and the ovary. The changes through the pubertal development, vaginal opening and hormonal secretion, were studied, and the adrenergic stimulation effects over the kisspeptin expression in the ovary in-vitro and the 4 and 8 week of chronic cold stress in-vivo was determined. The results presented in this thesis were the following: 1.- RT-PCR and EIA determinations showed that kisspeptin is synthetized in the celiac ganglion and the ovary. Furthermore, dual labeled immunofluorescence showed that kisspeptin is probably co-expressed within TH neurons. More important the kisspeptin along the celiac ganglion-ovary axis, increased with the puberty start, and thus, it could participate in the regulation of the follicular development and estrous ciclycity in adults rats. This suggestion was confirmed by blocking the in vivo kisspeptin action with the kisspeptin antagonist, p234, resulting in a delay in the vaginal opening, suggesting that kisspeptin could play a protector role in the ovulation process. 2.- Kisspeptin is expressed in both granulosa and theca cells. The immunodetection shows that kisspeptin is present through primary to preovulatory follicles. 3.- Kisspeptin is regulated by the sympathetic system because the in-vitro incubation of the ovaries with isoproterenol, a β-adrenergic agonist, increased the kisspeptin expression and the presence of the B-blocker propranolol eliminated the action of isoproterenol. Therefore, if this neuronal pathway is activated in the presence of a sympathetic stressor like acute (64 hour at 4°C) or chronic stress (3 hrs/day at 4°C during 5 days a week for 4 and 8 weeks) alter the peripheral kisspeptinergic system. 4.- Respect to ovarian function, in-vivo model (Alzet miniosmotic pumps to deliver Kisspeptin), show the capacity of kisspeptin to stimulate the steroidogenesis, increasing the testosterone and progesterone plasma concentration. The increased levels of plasma progesterone could favor the corpus luteum maintenance, possibly due to the decrease in the luteolysis process. Moreover, the kisspeptin antagonist administration (p234) don´t show significant effects in the reproductive function. In conclusion, in this thesis, the results have shown the existence of an extraovarian (neuronal) pathway (H-GC-O axis) that could contribute to the ovarian function regulation, and a intraovarian kisspeptin system (present in all follicles in development), that could participates in the ovulatory process, stimulating the steroidogenesis and hence regulating the ovulation. / Fondecyt

El objetivo del presente estudio fue evaluar la susceptibilidad del cuerpo lúteo al cloprostenol sódico (análogo sintético de la PGF2α) durante el desarrollo de la fase luteal en alpacas inducidas a ovulación con plasma seminal. El plasma seminal se obtuvo de muestras de semen de alpaca colectadas mediante vagina artificial y diluidas en proporción 1:1 en buffer fosfato salino (PBS), luego fueron centrifugadas y conservadas a -20°C hasta su posterior uso. 96 alpacas hembras con un folículo ≥7mm fueron inducidas a ovulación mediante la inyección de plasma seminal (n=48) y GnRH (n=48). Luego fueron seleccionadas aleatoriamente en 6 grupos distintos: un grupo control y animales tratados con PGF2α los dias 4, 5, 6, 7 y 8 post inducción de ovulación. Se colectaron muestras sanguíneas para determinar los perfiles de progesterona sérica al inicio del tratamiento y 24 horas post-tratamiento con cloprostenol sódico. Los resultados muestran que no hubo efecto de la PGF2α en animales tratados el día 4 y 5 (p>0.05). Los animales tratados al día 7 y 8 se vieron que responden con una luteólisis efectiva a las 24 horas post-PGF2α, ya que sus niveles de progesterona fueron <1ng/ml. En el día 6 se confirma que hay una luteólisis a las 48 horas post-PGF2α (p<0.05), por la disminución en el tamaño del diámetro del cuerpo lúteo. Por lo tanto se concluye que el cuerpo lúteo en alpacas inducidas a ovulación con plasmas seminal es susceptible a la luteólisis a partir del dia 6 post-estímulo de ovulación.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Considerando el patrón estacional de las yeguas, limitaciones de tiempo por reglamento y disponibilidad limitada de padrillos altamente exigidos; es necesario buscar manejos que disminuyan el número de servicios por yegua para lograr la preñez y hacer más eficiente el proceso. Uno de estos manejos es la inducción de ovulación, con dos protocolos: gonadotrofina coriónica humana (hCG) con actividad luteinizante en yeguas y acetato de deslorelin (AD), un análogo sintético de GnRH. El objetivo del estudio fue comparar efectividad en tiempo de ovulación de ambos protocolos de inducción de ovulación sobre la fertilidad en yeguas FSC, evaluando su respuesta en distintas condiciones. Además, determinar la asociación entre cada inductor y porcentaje de preñez. El análisis fue retrospectivo, analizando fichas reproductivas de las temporadas 2011 a 2013 de un haras de la Región Metropolitana. Se utilizaron fichas de 248 ciclos reproductivos de yeguas entre 3 y 18 años de edad. Se registró diariamente la actividad reproductiva de las yeguas. Se organizó la información en 2 grupos: Grupo hCG (n= 173 yeguas), que recibieron una dosis de 2500 UI hCG, con un folículo >35 mm. Grupo AD, (n= 75 yeguas), que recibieron una dosis de 1,5 mg AD, con un folículo >35 mm. Las yeguas se clasificaron según temporada reproductiva, mes de aplicación, orden de parto, tamaño folicular al aplicar el tratamiento, edad, días abiertos y porcentaje de preñez. Para el análisis estadístico de la comparación de eficiencia en tiempo de ovulación de ambos protocolos, se utilizó un modelo lineal generalizado (p<0,05). Para el análisis del porcentaje de preñez de cada protocolo se usó la prueba de chi cuadrado (p<0,05). Los resultados muestran que no existe diferencia significativa en tiempo de ovulación al comparar ambos protocolos de inducción. Sin embargo, en algunas categorías se encontraron diferencias significativas. Respecto a temporada reproductiva, la 2012 tiene diferencias significativas con 2011 y 2013, respecto al tiempo de ovulación. Los días abiertos presentan diferencia significativa respecto al tiempo de ovulación, que implica que a medida que aumentan los días abiertos disminuye el tiempo de ovulación. En el tamaño folicular, existe diferencia significativa respecto al tiempo de ovulación, y a medida que aumenta el tamaño folicular disminuye el tiempo de ovulación. Existe diferencia 2 significativa en el mes de aplicación, ya que a medida que avanza la temporada reproductiva aumenta el tiempo de ovulación. Por otro lado, no hay diferencias significativas en el tiempo de ovulación según el orden de partos ni la edad de las yeguas. Respecto al porcentaje de preñez, se observa que fue significativamente mayor utilizando AD respecto a hCG. El estudio concluyó que no existe diferencia significativa respecto al tiempo de ovulación según el protocolo utilizado. Pero se observa una diferencia significativa en tiempo de ovulación para las variables temporada reproductiva, mes de aplicación, tamaño folicular y días abiertos. Así, es posible mejorar la aplicación de cualquiera de los protocolos de inducción, sabiendo en qué momento utilizarlo para aumentar su eficiencia, de acuerdo a condiciones específicas (mes de aplicación, tamaño folicular y días abiertos).

El presente estudio fue realizado para determinar la tasa de concepción de alpacas inseminadas con semen fresco e inducidas a ovulación con plasma seminal o un análogo de GnRH (Acetato de buserelina). El estudio se realizó entre los meses de enero a abril del 2009. En un primer experimento, se seleccionaron 64 alpacas hembras con cría al pie, en base al criterio de la presencia de un folículo dominante ≥ de 7 mm detectado por ecografía transrectal. Los animales seleccionados fueron alimentados con pastura natural y recibieron las mismas condiciones de manejo; siendo distribuidas al azar a uno de los 2 tratamientos: G1 (n=32) administración intramuscular de 2 ml de plasma seminal y G2 (n=32) administración intramuscular de 1 ml de un análogo de GnRH (0.0042 mg de acetato de buserelina). Después de 27 horas de la aplicación de los tratamientos, se realizó la inseminación artificial a dosis de 1 ml de semen fresco diluido con una concentración espermática promedio de 130 x 106 / ml y una motilidad espermática ≥ 65%. Las alpacas fueron evaluadas mediante ecografía transrectal el día 2 post tratamiento para determinar la tasa de ovulación y el día 25 para determinar gestación. En el segundo experimento, fueron seleccionadas 10 alpacas con folículos ≥ 7 mm, a las cuales se les administró vía IM 2 ml de plasma seminal (n=5) o 1 ml de un análogo de GnRH (n=5). Al octavo día post aplicación se realizaron ecografías para medir el diámetro del cuerpo lúteo. Los resultados del experimento 1 indican una tasa de ovulación de 100 % para el grupo de plasma seminal y 90.6 % para el grupo de GnRH y tasa de gestación al día 25 del 75 y 53.1 % para los grupos G1 y G2, respectivamente (p<0.05). En el experimento 2, el tamaño del cuerpo lúteo de alpacas inducidas a ovulación con plasma seminal fue de 15.2 ± 1.1 mm y con GnRH fue de 12.6 ± 2.1 mm. Los resultados del estudio sugieren que la administración de plasma seminal en alpacas induce un 100 % de ovulación en alpacas y mejoran la tasa de concepción de los animales inseminados, por un mejor efecto luteotrópico en la formación del cuerpo lúteo. -- Palabras claves: Alpacas, plasma seminal, ovulación inducida, inseminación artificial, gestación. / -- This study was carried out to evaluate the pregnancy rate in alpacas inseminated with fresh semen and that were induced to ovulation with seminal plasma or a GnRH analogue (Acetate of buserelin). The study was developed from January to April in 2009. In experiment, sixty four alpacas with breeding were selected based on the criterion of the presence of follicle ≥ 7 mm by ultrasound. Animals were fed with natural pasture and they received the same handling conditions, they were distributed at random one of the two treatments: G1 (n=32) 2 ml of seminal plasma by intramuscular injection or G2 (n=32) 1 ml of GnRH (0.0042 Acetate of buserelin). After 27 hours of application of treatments, artificial insemination was performed at a dose of 1 ml of fresh dilutedsemen with a mean sperm concentration of 130 x 106 / ml and sperm motility ≥ 65%. Alpacas were evaluated by ultrasound at Day 2 post treatment to determinate rate ovulation and at Day 25 were evaluated to diagnose pregnancy. In experiment 2, were selected 10 alpacas with follicles ≥ 7 mm, which were administered intramuscularly 2 ml of seminal plasma (n=5) or 1 ml of a GnRH analogue (n=5). At 8 day post application, ultrasounds were performed to measure the diameter of the corpus luteum. Results of experiment 1 point out a rate ovulation of 100% for the seminal plasma group and 90.6% for the GnRH and pregnancy rate at day 25 were 75.0% and 53.1% for groups G1 y G2, respectively (p<0.05). In experiment 2, the size of the corpus luteum in alpacas induced to ovulation with seminal plasma 15.2 ± 1.1 mm and GnRH was 12.6 ± 2.1 mm. Results of present study suggest that administration of seminal plasma induce 100 % ovulation in alpacas and improve a pregnancy rate in inseminated animals for a better luteotropic effect in the formation of corpus luteum. -- Key words: Alpacas, seminal plasma, ovulation induced, artificial insemination, pregnancy.

El efecto de sincronización de la onda folicular empleando GnRH y LH sobre la tasa de preñez fue estudiado en 60 alpacas hembras adultas, y 60 llamas hembras adultas. Las hembras con folículos ≥ 7mm detectadas por ultrasonografía, fueron distribuidas al azar en tres grupos experimentales de 20 animales cada uno: grupo Control (1 ml de solución salina, IM); grupo GnRH (0.004 mg de acetato de buserelina, IM) y grupo LH (5 mg de LH, IM). La respuesta ovárica a los tratamientos se evaluó mediante ultrasonografía transrectal para determinar el intervalo en días, desde los tratamientos a la emergencia de la nueva onda folicular y el día en que el nuevo folículo dominante alcanzó ≥ 7mm de diámetro. El intervalo desde los tratamientos a la emergencia de la onda folicular fue similar (p mayor 0.05) en los grupos Control (4.5 ± 1.2 días y 4.7 ± 1.2 días), GnRH (4.3 ± 1.4 días y 4.6 ± 1.2 días) y LH (4.5 ± 1.2 días y 4.0 ± 1.2 días), para alpacas y llamas respectivamente. El intervalo desde el tratamiento hasta el día en qué el nuevo folículo dominante alcanzó ≥7 mm, no difirió en los grupos de alpacas Control (8.4 ± 1.9 días), GnRH (9.0 ± 1.6 días) y LH (7.9 ± 2.0 días) (p mayor 0.05). Entretanto en llamas, el intervalo desde los tratamientos a la presencia del nuevo folículo dominante en los grupos GnRH (7.9 ± 1.6 días) y LH (6.7 ± 1.6 días) fueron diferentes con el grupo Control (9.6 ± 1.0 días) (p menor 0.05). El tamaño folicular en alpacas, un día antes del empadre fue menor en los grupos GnRH (6.8 ± 1.4 mm) y Control (7.2 ± 1.3 mm) comparado con el grupo LH (8.9 ± 1.9 mm) (p menor 0.05). Adicionalmente en llamas, el tamaño folicular, un día antes del empadre fue diferente (p menor0.05) entre los grupos Control (6.4 ± 1.3 mm), GnRH (8.5 ± 0.6 mm) y LH (10.4 ± 3.6 mm). El empadre se realizó 12 días después de los tratamientos. Los animales fueron evaluados por ultrasonografía para determinar la tasa de ovulación el día 2 después del empadre y la tasa de preñez el día 35 después del empadre. La tasa de ovulación post empadre fue similar en los grupos control (85.7% y 64.7%), GnRH (94.4% y 88.9%) y LH (85.7% y 77.8%), para alpacas y llamas, respectivamente. La tasa de preñez en el día 35 después del empadre fue similar para todos los grupos (p> 0.05), Control (78.6% y 47.1%), GnRH (77.8% y 66.7%) y LH (64.3% y 72.2%) para alpacas y llamas, respectivamente. En conclusión, la sincronización con GnRH o LH no influyó en el intervalo desde los tratamientos a la emergencia de la nueva onda folicular, tasa de ovulación post empadre, ni la tasa de preñez en alpacas y llamas. / The effect of follicular wave synchronization using GnRH and LH on pregnancy rate was studied in 60 adult female alpacas, and 60 adult female llamas. Females with follicles ≥ 7mm detected by ultrasonography were randomly allocated in three experimental groups of 20 animals each one: Control group (1 ml saline solution, IM), GnRH group (0.004 mg of buserelin acetate, IM) and LH group (5 mg of LH, IM). The ovarian response to treatments was evaluated by transrectal ultrasonography to determine the interval in days from treatments to new follicular wave emergency and to the day which the new dominant follicle reached ≥ 7mm in diameter. The intervals from the treatments to follicular emergency were similar (p> 0.05) in Control (4.5 ± 1.2 days and 4.7 ± 1.2 days); GnRH (4.3 ± 1.4 days and 4.6 ± 1.2 days) and LH groups (4.5 ± 1.2 days and 4.0 ± 1.2 days), for alpacas and llamas respectively. The interval from the treatment to the day on which the new dominant follicle reached ≥ 7 mm in alpacas did not differ in Control (8.4 ± 1.9 days), GnRH (9.0 ± 1.6 days) and LH (7.9 ± 2.0 days) groups (p> 0.05). Meanwhile in llamas, the interval from the treatment to the presence of the new dominant follicle in GnRH (7.9 ± 1.6 days), and LH (6.7 ± 1.6 days) groups were different in comparison to Control group (9.6 ± 1.0 days) (p less 0.05). Follicular sizes in alpacas a day before mating were smaller in GnRH (6.8±1.4 mm) and Control (7.2 ± 1.3 mm) groups in comparison to LH group (8.9 ± 1.9 mm) (p less 0.05). Additionally, in llamas follicular size a day before mating was different (p less 0.05) among Control (6.4 ± 1.3 mm), GnRH (8.5 ± 0.6 mm) and LH (10.4 ± 3.6 mm) groups. Mating was permitted 12 days after treatments. Animals were evaluated by ultrasonography to determine ovulation rate on day 2 after mating and pregnancy rate on day 35 after mating. After mating, ovulation rate were similar in Control (85.7% and 64.7%), GnRH (94.4% and 88.9%) and LH (85.7% and 77.8%) groups, for alpacas and llamas, respectively. Pregnancy rate on day 35 after mating were similar for all groups (p> 0.05), Control (78.6% and 47.1%), GnRH (77.8% and 66.7%), and LH (64.3% and 72.2%) for alpacas and llamas, respectively. In conclusion, synchronization with GnRH or LH did not affect on the intervals from treatments to emergency of new follicular wave, ovulation rate post mating, nor pregnancy rate in alpacas and llamas.

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de los estadíos de desarrollo folicular: crecimiento, estático y regresión del folículo dominante al momento de la cópula, sobre la ovulación y sobrevivencia embrionaria en alpacas. Se utilizaron 116 alpacas con descanso post parto ³ 15 días, a las que se realizó evaluaciones con un ecógrafo Aloka SSD 500 y transductor lineal 7.5 MHz, para distribuirlas al azar a uno de los 4 grupos siguientes: G1 (folículo dominante en estadío de crecimiento, diámetro 6 mm), G2 (folículo dominante en estadío de crecimiento, diámetro ³ 7 £ 12 mm), G3 (folículo dominante en estadío estático, diámetro ³ 7 mm) y G4 (folículo dominante en estadío de regresión, diámetro ³7 mm). Posteriormente, fueron sometidas a empadre controlado dirigido, a excepción de 5 alpacas del grupo G1 que rechazaron al macho. El día del empadre fue considerado el día 0 y las evaluaciones ecográficas posteriores se realizaron en los días 2 (ocurrencia de ovulación), 9 (presencia y tamaño del cuerpo lúteo), 20, 25, 30 y 35 (presencia de vesícula embrionaria y/o embrión). En los días 0 y 15 post cópula se realizó la prueba de receptividad sexual. El 97,3% de los alpacas que fueron empadradas (n=111) presentaron ovulación al día 2 post cópula, sin diferencia significativa (p<0.05) entre los 4 grupos (G1=95.45%, G2=96.67%, G3=100% y G4=96.56%). La tasa de sobrevivencia embrionaria no presentó diferencia significativa entre grupos, pero hubo una tendencia a una mayor tasa de sobrevivencia para el grupo G2 (65,52%) en comparación con los grupos G1(52,38 %), G3(53,33 %) y G4(42,86 %) al día 35 post cópula. En el día 9 post cópula, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño promedio del cuerpo lúteo entre los grupos (G1= 10.28 ± 1.74mm, G 2 =11.72 ± 1.73mm, G3= 11.07 ± 1.96mm, G4 = 11.11 ± 2.23mm). Estos resultados indicarían que el estadío del desarrollo folicular al momento de la monta no tendría efecto significativo sobre la tasa de ovulación y sobrevivencia embrionaria en alpacas. / The objective of this study was to evaluate the effects of growth, static and regression stages of the dominant follicle during mating, on the ovulation and the embryonic survival in alpacas. 116 female alpacas with a post-partum resting period ³ 15 days were used. The alpacas were evaluated with an ultrasound scanner Aloka SSD 500 with a 7.5 MHz transrectal transducer in order to distribute them randomly in one of the following 4 groups: G1 (dominant follicle in growth stage, diameter of 6 mm), G2 (dominant follicle in growth stage, diameter ³ 7 £ 12 mm), G3 (dominant follicle in static stage, diameter ³ 7 mm) and G4 (dominant follicle in regression stage, diameter ³ 7 mm). Subsequently, all the alpacas were mated with a male, except 5 alpacas of group G1 that rejected the male. The mating day was considered day 0, thus the subsequent ultrasound evaluations were carried out on days 2 (ocurrence of ovulation), 9 (presence and size of the corpus luteum); 20, 25, 30 and 35 (presence of the embryonic vesicle and/or the embryo). On days 0 and 15, the sexual receptiveness test was performed. 97.3% of alpacas that were mated (n=111) presented ovulation, but no significant differences (p<0.05) among the study groups (G1=95.45%, G2=96.67%, G3=100% and G4=96.56%) were observed. The embryonic survival rate was also not significantly different among the groups, but there was a tendency to a greater rate of survival for the group G2 (65.52%) in comparison with groups G1 (52.38%), G3 (53.33%) and G4 (42.86%) on day 35 after mating. On day 9, no significant difference in the average size of the corpus luteum was observed among the groups (G1 = 10.28 ± 1.74mm, G 2 =11.72 ± 1.73mm, G3 = 11.07 ± 1.96mm, G4 = 11.11 ± 2.23mm). These results suggest that the stage of the follicular development during mating does not have a significant effect on the rate of ovulation and embryonic survival in alpacas.

El presente estudio se realizó para evaluar el efecto de cuatro suplementos de macromoléculas sobre la tasa de maduración nuclear, así como también determinar la tasa división de ovocitos y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas (7 días), respectivamente. Los ovarios fueron obtenidos de animales sacrificados, transportándose al laboratorio en un termo conteniendo solución salina al 0.09%, suplementada con antibiótico-antimicótico a 37 °C. Los CCO´s se obtuvieron de la aspiración de folículos de entre 2-6mm; luego de ser observados en un estéreomicroscopio, 692 ovocitos con dos o más capas de células fueron calificados como aptos para ser madurados en medio TCM-99 enriquecido con suplemento de macromolécula: PVP o PVA o BSA o SFB según sea el tratamiento; cultivados a 39°C bajo una atmósfera de 5% de CO2. Cumplido el tiempo de maduración (24 horas), los ovocitos fueron removidos del medio y lavados con PBS suplementado con SFB y 1 mg/ml de hialuronidasa, para ser fijados en una solución de etanol: ácido acético (3:1). Para la evaluación de la maduración nuclear, se colocaron los ovocitos en una lámina portaobjeto y teñidos con 1% de orceína; las mismas fueron observadas bajo un microscopio para ser evaluadas y clasificadas como Vesícula Germinal (VG), Metafase I (MI), Anafase-Telofase, Metafase II (MII) y degenerados. Para la fecundación se usaron 1680 ovocitos, madurados bajo las mismas condiciones y fecundados con espermatozoides obtenidos de pajillas. Para la obtención de los espermatozoides motiles se centrifugo a 300 gravedades durante 10 minutos bajo una gradiente de Percoll (45/90); el sobrenadante fue retirado y el pellet obtenido retirado para ser reconstituido con TL-STOCK. Los ovocitos maduros y espermatozoides fueron co-cultivados durante 18 horas a 39°C con 5% de CO2 en medio de cultivo KSOM-AA; luego de 48 horas las células cocultivadas fueron trasladadas al medio de cultivo SOF. En el experimento 1, en los ovocitos que alcanzaron la maduración nuclear (Metafase II) se encontró diferencia significativa solo entre los suplementos de macromolécula PVA y SFB con 19.3 + 1.8 y 16.3 + 0.8, respectivamente; mientras que en los grupos PVP, PVA, BSA y PVP, BSA, SFB, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. En el experimento 2, la tasa de división y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. Estos resultados indican que los suplementos de macromoléculas proporcionan condiciones y requerimientos importantes para la progresión desde estadios de metafase I a metafase II. Palabras claves: Maduración In vitro, ovocitos bovinos, fecundación In vitro. / --- The present study was made to evaluate the effect of four macromolecule supplements on the rate of nuclear maturation, as well as to determine the rate division of oocytes and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours (7 days), respectively. The ovaries were obtained from sacrificed animals, being transported to the laboratory in a thermos flask containing saline solution to the 0,09%, with antibioticantimycotic at 37 °C. The CCO´s was obtained from the aspiration of follicles of between 2-6mm; after being observed in stereomicroscope, 692 oocytes with two or more layers of cells were described like apt being in the middle matured TCM-99 enriched with macro-molecule supplement: PVP or PVA or BSA or SFB according to are the treatment; cultivated at 39°C under an atmosphere of 5% of CO2. Turned the time of maturation (24 hours), the oocytes were removed of means and washings with PBS supplemented with SFB and 1 mg/ml of hyaluronidase, to be fixed to an ethanol solution: acetic acid (3: 1). For the evaluation of the nuclear maturation, the oocytes on the slide and dyeings with 1% of orceína were placed; the same ones were observed under a microscope to be evaluated and to be classified like germinal vesicle (VG), metaphase I (MI), anaphase-telophase, metaphase II (MII) and degenerated. For the fertilization 1680 oocytes, matured under the same conditions and fertilized were used with obtained spermatozoa of tubules contained it.. For the obtaining of the motile spermatozoa by centrifuge myself to 300 gravities during 10 minutes under a gradient of Percoll (45/90); the supernatant was retired and pellet obtained retired to be reconstituted with TL-STOCK. The mature oocytes and spermatozoa Co-were cultivated during 18 hours to 39°C with 5% of CO2 in the middle of culture KSOM-AA; after 48 hours the Co-cultivated cells were transferred to means of culture SOF. In experiment 1, in the oocytes that reached the nuclear maturation (Metaphase II) was single significant difference between the macromolecule supplements PVA and SFB with 19.3 + 1.8 and 16.3 + 0.8, respectively; whereas in groups PVP, PVA, BSA and PVP, BSA, SFB, respectively was not significant statistical difference. In experiment 2, the rate of division and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours, respectively was not significant statistical difference. These results indicate that the macromolecule supplements they provide conditions and important requirements for the progression from stages of metaphase I to metaphase II. Key words: In vitro Maturation, oocytes bovine, In vitro fertilization.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El valor económico de la monta de potros de calidad para la hípica es muy alto y, mientras de mayor valor sea el semental, habrá más interés en que éste cubra el máximo número posible de yeguas. Es por esto que se hace fundamental aumentar la eficiencia de los apareamientos. Predecir el momento de la ovulación incrementa la probabilidad de lograr la concepción con una monta. La maduración folicular va acompañada de un incremento en el flujo sanguíneo (FS) ovárico perifolicular. Trabajos recientes demuestran que, si bien el folículo tiene un aumento diario de FS, pocas horas antes de la ovulación se detecta una brusca caída de la perfusión folicular. Estos fenómenos de cambio del FS en el ovario pueden ser observados mediante el eco Doppler y cuantificados por la velocimetría Doppler. Este estudio tuvo como finalidad determinar con mayor precisión el momento de la ovulación mediante los cambios de FS que experimenta el folículo preovulatorio a través del Doppler color. Los resultados muestran que el folículo, una vez que se vuelve dominante, aumenta su FS, lo que se ve reflejado en que la resistencia vascular que va disminuyendo desde el día -4 hasta el día -2. El día antes de la ovulación esta tendencia se invierte y en la mayoría de las yeguas se observó un alza en los índices de resistencia y pulsatilidad. Todas las yeguas que mostraron un alza brusca del índice de resistencia ovularon en menos de 24 h

Caracteriza y determina el número de folículos emergentes en cada onda folicular en alpacas. El estudio fue realizado durante el primer trimestre del 2016 en el Centro de Investigación y Producción Chuquibambilla de la Universidad Nacional del Altiplano en la región Puno. Se emplearon 34 alpacas suri hembras adultas, vacías, sin cría al pie, sin antecedentes de anormalidades reproductivas y con presencia de un folículo dominante ≥ 7 mm, para ser inducidas a ovulación mediante la aplicación intramuscular de 4.2 µg de acetato de buserelina (día 0). Dos días después del estímulo hormonal, se registró el desarrollo folicular individual a partir del número total de folículos antrales ≥ 3 mm en ambos ovarios mediante un seguimiento ecográfico transrectal interdiario de hasta 60 días. El total de animales en investigación tuvieron acceso a pastizales naturales y estuvieron sujetos a similares condiciones de manejo. Se determinó que la emergencia folicular se produjo el día 4.5 ± 1.4 (rango 2-8). El número de folículos antrales (NFA) ≥ 3 mm calculado durante la emergencia folicular fue en promedio 2.8 ± 1.3 (rango 1-8). Los resultados muestran que a pesar de haber una notable similitud (P>0.05) en el NFA ≥ 3 mm durante emergencias sucesivas, existe una diferencia significativa en el número de folículos emergentes entre animales distintos (P <0.05). La repetibilidad del NFA ≥ 3 mm calculada durante la emergencia folicular fue de 0.72. El intervalo interonda promedió los 16.9 ± 3.9 días, se definió como un carácter variable entre animales y presentó una repetibilidad de 0.23. Se concluye que el número de folículos emergentes ≥ 3 mm en alpacas representa una característica variable entre individuos distintos, pero altamente repetible dentro de un mismo animal; siendo además el intervalo interonda un carácter no repetible en alpacas. / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

El documento digital no refiere asesor / Evalúa el efecto del tiempo de incubación sobre la maduración nuclear y determinar la tasa de división de ovocitos madurados y fecundados a las 72 horas post fecundación. Complejos Cumulos–Ovocitos (CCOs) fueron obtenidos de ovarios procedentes de animales sacrificados y transportados al laboratorio en un termo conteniendo solución salina 0.9% suplementada con antibiótico antimicótico a 35°C. CCOs fueron aspirados de folículos = 6mm. Previo a la evaluación en un estéreomicroscopio, 502 ovocitos fueron distribuidos en los 4 tiempos de Maduración: 30, 34, 38 y 42 horas, 533 ovocitos fueron cultivados y fecundados después de ser madurados a las 30, 34, 38 y 42 horas. CCOs con dos o más capas de células fueron madurados en medio TCM-199 suplementado con 10% SFB, 0.5µg/mL de FSH, 10µg/mL de hCG, 0.2mM de Piruvato de sodio, 50µg/mL de gentamicina y 1µg/mL de estradiol, colocado en aceite mineral y cultivados a 39ºC bajo una atmosfera de 5 % de CO2 y alta humedad. Después del tiempo de maduración, los ovocitos fueron removidos del medio y lavados con PBS suplementado con 10% de SFB y 1mg/ml de hialuronidasa y fijados en una solución de etanol: acido acético (3:1). Ovocitos fueron colocados en una lámina y teñidos con 1% de orceína. Las láminas fueron examinadas bajo un microscopio de contraste de fases a 400X para evaluar el estado de maduración nuclear y clasificarlos como Metafase I (MI), Vesícula Germinal (VG), Anafase – telofase, Metafase II (MII) y degenerados. Para la fecundación, ovocitos fueron madurados bajo las mismas condiciones y fecundados con espermatozoides obtenidos de testículos procedentes de centros de sacrificio. Espermatozoides motiles fueron obtenidos por centrifugación a 700g bajo una gradiente de Percoll discontinua (22.5:45%) por 25 minutos. El sobrenadante fue removido y el pellet reconstituido con TLStock. Espermatozoides y ovocitos madurados fueron co-cultivados por 18 – 20 horas a 39ºC con 5% de CO2 en medio de cultivo KSOM suplementado con 10% de SF, 2mM de piruvato de sodio y 50µg/mL gentamicina y evaluados a las 72 horas. En el experimento 1, la proporción de ovocitos que alcanzaron el estadío de M-II fueron 26.3; 53.6; 62.6 y 74.4 % para las 30, 34, 38 y 42 horas de cultivo respectivamente, con diferencia estadística entre los G-I y II respecto al GIII y C-IV (p<0.05). En el experimento 2, las tasas de división fueron 9.5; 7.7; 15.4 y 19.2 para 30, 34, 38 y 42 horas de maduración después de 72 horas de cultivo. Estos resultados indican que es necesario de 38 a más horas de maduración In vitro de ovocitos de alpaca. Los resultados indican que se requiere de 38 a más horas para la maduración y fecundación In vitro de ovocitos de alpaca. / Tesis