Orientadores: Marcos Dias Fontana, Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T08:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Heleno_MauricioAurelioGomes_M.pdf: 2260788 bytes, checksum: bb0c80c20559ca4739a7106cee974804 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Esta tese descreve as atividades bioquímicas, biológicas e farmacológicas do extrato aquoso da glândula de Duvernoy ( GD.) da colubrídea áglifa Dryadophis bifossatus bifossatus (Jararacussú- do-brejo). As glândulas foram obtidas de espécimes adultos de ambos os sexos (sacrificados com pentobarbital sódico, Nembutal®, > 30 mg/kg) e homogenizadas em solução tampão de carbonato de amónio (0,1 M; pH 8,0) mantidas em gelo até a centrifugação (4.000 rpm, 30 min, 4°C) e liofilização do sobrenadante. O extrato da G.D. preparado como descrito acima contém cerca de 82% de proteínas e não possui atividade hialuronidásica, fosfolipásica A2 ou pró- coagulante, mas potencializou o tempo de recalcificação do plasma e demonstrou níveis moderados de atividade fosfodiesterásica (2,12 ± 0,09 u/mg) e proteásíca (4,45 ± 0,1 u/mg) (n=3 para cada ensaio). O extrato (200jig/poço) não aglutinou os eritrócitos humanos tripsinizados e fixados em formaldeído nem causou hemorragia intradérmica em ratos (500|ig/sítio, n=3). Fracionamento do extrato da G.D.(20mg) por gel filtração em Sephacryl S-200 HR (coluna de 1,1 cm x 50 cm) em carbonato de amónio (0,1 M; pH 8,0) e eletroforese em SDS-PAGE revelou a presença de proteínas na faixa de massa molecular de 14 - 60 KDa. O extrato da G.D. inibiu fortemente a transmissão neuromuscular em preparações de aves , mas não de mamíferos. Este bloqueio dose-dependente e irreversível envolveu os receptores pós-sinápticos nicotínicos. Gel filtração em Sephacryl S-200 HR seguida por troca iônica em coluna Resource S (Pharmacia), revelou uma proteína com massa molecular de 14-18 KDa responsável pela atividade neurotóxica do extrato da G.D. sem, contudo, apresentar efeito direto sobre a fibra muscular na preparação biventer cervicis / Abstract: This thesis describes the biochemical, biological and pharmacological activities of an aqueous extract of the Duvernoy's gland (DG) of the aglyphous colubrid Dryadophis bifossatus bifossatus (jararacussu-do-brejo). The glands were removed from adult specimens of both sexes (sacrificed with sodium pentobarbital, Nembutal®, >30 mg/kg) and then homogenized in ammonium carbonate buffer (0.1 M, pH 8.0) on ice prior to centrifugation (4000 rpm, 30 min, 4°C) and lyophilization of the resulting supernatant. DG extract prepared as above contained 82% protein and possessed no hyaluronidase, phospholipase A or pro-coagulant activities but potentiated the plasma recalcifi cation time and showed moderate levels of phosphodiesterase (2.12 ± 0,09 u/mg) and protease (4.45 ± 0.1 u/mg) (n=3 for each assay). The extract (200 mg/well) did not agglutinate human trypsinized, formaldehyde-fixed erythrocytes nor did it cause intradermal hemorrhage in rats (500 mg/site, n=3). Fractionation of the DG extract (20 mg) by gel filtration on Sephacryl S-200 HR (1.1 cm x 50 cm column) in 0.1 M ammonium carbonate buffer (pH 8.0) and electrophoresis in SDS-containing polyacrylamide gels revealed the presence of proteins ranging in molecular mass from 14 kDa-60 kDa. The DG extract potently inhibited neuromuscular transmission in avian, but not mammalian, nerve muscle preparations. This blockade, which was dose- and time-dependent as well as irreversible, involved post-synaptic nicotinic receptors. Sequential gel filtration on Sephacryl S-200 HR followed by ion exchange on a Resource S column (Pharmacia), yielded a protein with a molecular mass of 14-18 kDa that accounted for nearly all of the neurotoxic activity of the DG extract. The extract had no direct effect on biventer cervicis muscle / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-16T01:43:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HeluanySobrinho_NadimFarah_M.pdf: 6197856 bytes, checksum: ad2ebac7b90e14268dbd404f0c07d696 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: A peçonha de B. jararacussu tem sido objeto de estudo desde o início do século. Recentemente foi realizado um estudo sistemático do veneno total e de suas frações. Neste estudo foi identificado, através de cromatografia por gel filtração, o pico de maior massa (o pool IV ou SIII) como o responsável pela atividade do veneno bruto na junção neuromuscular. O presente trabalho refere-se aos efeitos da fração purificada, oriunda da recromatografia do pico principal SIII, isenta de atividades fosfolipásica e hemolítica, sobre a junção neuromuscular. A fração purificada foi chamada de Bothropstoxina (BthTX). Exibe um peso molecular de 13.000. A BthTX foi estudada em duas preparações distintas: De camundongo (frênico diafragma) e de pintainho (biventer cervicis) / Abstract: The effects of Bothropstoxin, a component from Bothrops Jaracussu snake venom on the mouse and chick muscle preparations. Bothropstoxin on the mouse preparations inhibited muscle twitch tension, evoked either directly or indirectly through the motor herve and abolished the compound action potential of the muscle with a similar time course of aetion. The toxin evoked membrane depolarization and that effeet was inhibited in the presence of 10mM Ca2+. On chick muscle, the toxin induced a contracture that reached the maximum amplitude in 44.8 '+ OR -' 15.6 min (n = 6) and was not blocked by d-Tc nor TTX. The time course of the maximum amplitude was shorted in Krebs solutions Ca2+ free (5.5 '+ OR -'1.0 min, n = 4). The contraeture indueed by toxin was completely inhibited in Krebs Ca2+ free plus 1mM EGTA. As it lacks PLA2, protease and hemolytie aetivity, it may belong to the elass of cardiotoxins / Mestrado / Mestre em Odontologia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-17T16:40:15Z No. of bitstreams: 1 2012_RafaelDonadelliMelani_Parcial.pdf: 4654950 bytes, checksum: 7edd9468c1ef1b6ce3657f041425449a (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-24T12:12:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RafaelDonadelliMelani_Parcial.pdf: 4654950 bytes, checksum: 7edd9468c1ef1b6ce3657f041425449a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-24T12:12:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RafaelDonadelliMelani_Parcial.pdf: 4654950 bytes, checksum: 7edd9468c1ef1b6ce3657f041425449a (MD5) / A peçonha de aranhas é um conjunto de diferentes moléculas bioativas usadas para subjugar a presa e como mecanismo de defesa. Essas moléculas atuam de forma variada em diversos sistemas biológicos, porém pouco se sabe sobre as peçonhas de aranhas caranguejeiras do Brasil. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização química e farmacológica de alguns componentes bioativos não peptídicos presentes na peçonha de Lasiodora sp. A peçonha bruta de Lasiodora sp. apresenta efeito inotrópico e cronotrópico negativos em preparação de coração in situde rã e de contração e diminuição da resposta de acetilcolina (Ach) em relação ao controle, em preparação de músculo reto abdominal de rã. O efeito sobre o coração é atribuído ao acúmulo de Ach na peçonha na concentração de 8,75±0,45 µg/mg de peçonha bruta, quantificada analiticamente por LC-MS/MS. A presença de Ach também foi constatada na peçonha de outras aranhas e outros animais peçonhentos como escorpiões e lacraias. O efeito sobre o músculo ocorre nos receptores nicotínicos para Ach e está relacionado à presença de ésteres de colina com núcleos imidazólicos. Os compostos foram identificadosquimicamente através de diferentes revelações após cromatografia de camada delgada e por espectrometria de massa. Este estudo contribui para a compreensão da diversidade e complexidade de moléculas de baixa massa molecular não peptídicas presentes na peçonha da aranha Lasiodora sp., bem como preenche lacunas até então não esclarecidas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The spiders venoms are a diverse set of bioactive molecules used for predation and as a defense mechanism. Although these molecules act on many biological systems by different means, little is known about the tarantula spiders venoms from Brazil. Thus, the objective of this study was to characterize chemically andpharmacologically some of the non-peptide bioactive components present in the venom of Lasiodora sp. The crude venom of Lasiodora sp. presents inotropic and chronotropic negative effects in in situ frog heart preparation. In frog rectus abdominis preparation the crude venom led to contraction and decrease of the action of acetylcholine (Ach). The effect on the heart is attributed to Ach accumulation on the venom at a concentration of 8.75 ± 0.45 µg/mg of crude venom, analytically quantified by LC-MS/MS. The presence of Ach was also found in the venom of other spiders and other venomous animals such as scorpions and centipedes. The effect on the muscle occurs on nicotinic Ach receptors and is related to the presence choline esters with imidazole nuclei. The compounds were chemically identified by various spraying reagents after thin layer chromatography and by mass spectrometry. This study contributes to understand the molecular diversity and complexity of non-peptide compounds with low molecular weight present in the venom of the spider Lasiodora sp. and fills unexplained gaps in the study of tarantula venoms.

Orientadores : Julia Prado Franceschi, Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T02:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antunes_Edson_M.pdf: 3494118 bytes, checksum: 1ebbcb2df122ad53f2a2be161669cfae (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: Os venenos brutos de Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus cascavella, Bothrops jararacussu e bothrops alternatus foram investigados quanto à sua atividade leberadora de histamina em lavado peritoneal de ratos. Foi avaliada também a capacidade neutralizante dos soros antiofídicos comerciais sobre a ação liberadora de histamina dos venenos ofídicos. A potência liberadora de histamina foi semelhante para os venenos de C.d.terrificus (DE50 = 1,25 'um¿g/ml), C.d.Cascavella (DE50 = 11,5 'um¿g/ml) e B.jararacussu (DE50 = 1,97 'um¿g/ml) sendo significativamente menos para o veneno de B.alternatus (DE50 = 11,5 'um¿g/ml). A cromatina, componente miotóxico presente no veneno de C.d.terrificus, mostrou apenas uma discreta liberação de histamina (16 vezes menor que a do veneno bruto), com atividade comparável à do veneno de B. altermatus. O efeito liberador de histamina induzido pelos venenos brutos foi neutralizado pelos soros antiofídicos, independente da dose necessária para a neutralização de seu efeito letal. A existência da neutralização cruzada (parcial ou total) indica que os componentes liberadores de histamina presentes em tais venenos são antigênicos em sua natureza e provavelmente semelhantes entre si. O fato de os soros antiofídicos serem incapazes de neutralizar a atividade liberadora de hisamina induzida pela cromatina sugere fortemente que esta toxina de baixo peso molecular se comporta como sendo fracamente antigênica. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The histamine releasing ability of Crotalus durissus terrificus, Crotalus durissus cascavella, Bothrops jararacussu and Bothrops alternatus venoms on rat peritoneal mixed cells was studied, as well the neutralization of this histamine releasing effect by commercial antiophidic sera. The ED50 values for the histamine releasing effect for C. d. terrificus (ED = 1,25 'mu¿g/ml) C.d. cascavella (ED50 = 1,72 'mu¿g/ml) and B. jararacussu (ED50 = 1,97 'mu¿g/ml) was similar and significantly smaller than Ed50 for B. alternatus venom (ED 50 = 11,5 'mu¿g/ml). Crotamine, a miotoxic component of C. d. terrificus venom, showed a histamine releasing activity 16 times smaller than that of the whole venom, comparable to that of B. alternatus venom. The histamine releasing was neutralized by antiphidic sera in doses not related to those used for neutralization of toxic effects. A significant cross neutralization of toxic effects. A significant cross neutralization (partial or total) was observed. It is proposed that the histamine releasing fractions of the four venoms tested are antigenic and probably similar. The antiophidic serum did not neutralize the histamine releasing activity of crotamine suggesting that this low molecular weight toxin behaves as a feeble antigen. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Se aisló parcialmente una hialuronidasa del veneno de Bothrops atrox mediante dos pasos cromatograficos sobre DEAE Sephadex A-50 y Sephadex G-50, utilizando en ambos casos acetato de amonio 0,05M y pH 5,0. La enzima fue purificada 145 veces con un rendimiento de 72 % y por PAGE-SDS se obtuvo una banda proteica con un peso molecular de 110 kDa en condiciones reductoras y no reductoras. Se determinó la estabilidad de la actividad de esta enzima en distintos valores de pH en el tiempo, así como la neutralización de sueros anti-ofídicos de tipo IgG e IgY producidos en el Instituto Nacional de Salud-Perú y en el Laboratorio de Biología Molecular – UNMSM respectivamente. La enzima revelo ser sensible a la temperatura, con un pH óptimo de 6,0 y encontrarse en cantidades bajas en el veneno. La actividad enzimática fue inhibida en mayor proporción por sueros anti-lachesicos que por sueros anti-botropicos, ensayos “in vitro” mostraron que incrementa la difusión del veneno en 50 %. Es inhibida totalmente por suero humano y dexametasona mientras que los ensayos con inhibidores demostraron que los residuos de Tyr y Cys son importantes para la actividad de esta enzima. Palabras clave: Veneno, serpiente, Bothrops atrox, hialuronidasa, glicano hidrolasa. / --- A hialuronidase was partially isolated from the venom of Bothrops atrox using DEAE Sephadex A-50 and Sephadex G-50, in both cases using ammonium acetate 0,05M pH 5,0 as buffer. The enzyme was purified with 145 fold, a yield of 72 % and a molecular weight of 110 kDa with and without 2-Mercaptoetanol by PAGE-SDS. The stability of the hialuronidase activity from the venom of the snake Bothrops atrox was defined at different pH values, as well the effect of anti-snakes serums of the IgG and IgY types produced by the National Institute of Health - Perú and the Laboratory of Molecular Biology-UNMSM respectively using the turbidimetric test Di Ferrante. This enzyme elucidate been sensitive to the temperature, optimum pH 6,0 and found at very low concentrations in the venom. The enzyme activity was inhibited in more proportion by the anti-lachesis-serums rather than anti-botropics-serums, also show to increase the venom diffusion in 50 %, besides of been inhibited totally by human-serum and dexametasona while the inhibitors assays showed that Tyr and Cys are important to the active site. Key words: Venom, snake, Bothrops atrox, hialuronidase, glycano hidrolase.

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100 y otra de intercambio catiónico sobre CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 12,14 veces con una actividad específica de 4,13 U/mg. Esta enzima es una glicoproteína ácida (17 % de carbohidratos asociados), homodimérica de 127,879 daltons de peso molecular, formada por dos subunidades de 63,128 daltons y posee por lo menos un enlace disulfuro intracatenario, que es importante para su actividad. La enzima mostró un pH óptimo de 8,3 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; pierde actividad en presencia de Zn2+ y tolera tamperaturas hasta los 55ºC. Se demostró la pureza y antigenicidad de la enzima mediante inmunodifusión e inmunoelectroforesis, empleando suero antibotrópico polivalente. Así mismo el efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció utilizando la técnica de Grove sobre cultivos de Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae y Escherichia coli observándose que las bacterias Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Además el veneno crudo de B. atrox y LAO presentaron un efecto in vitro contra promastigotes de Leishmania braziliensis braziliensis con una CE50 de 7,82 y 1,33 μg/ml respectivamente y contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi, con una CE50 de 7,95 μg/ml para el veneno crudo y 1,38 μg/ml para la enzima purificada. La enzima L-aminoácido oxidasa no tiene actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos, ni hemolítica sobre eritrocitos humanos lavados. Sin embargo produce edema, habiéndose calculado la DEM en 15,18 μg de proteína. Palabras clave: L-aminoácido oxidasa, serpiente, enzima, Bothrops atrox, veneno. / A L-Aminoacid oxidase enzyme was purified and characterized from Bothrops atrox snake venom by two steps. It used a Sephadex G-100 column and ion exchange on CM-Sephadex C-50 at pH 6. The purification grade was 12,14 folds with a specific activity of 4,13 U/mg. This enzyme with a molecular weight of 127,879 daltons as determined by gel filtration is a noncovalent dimmer consisting of two subunits with a molecular weight each of 63,128 daltons as determined by SDS-PAGE, with at least one intrachain disulfide bond that is important for its activity. The enzyme exhibited a optimun pH of 8,3 using L- leucine as substrate. It is an acid glicoprotein containing 17% carbohydrate, being thermoestable till 55 ºC, labil to alkaline pH and susceptible to presence of Zn 2+. The antigenicity and homogeneity of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis using polivalent antibothropic antivenom. Beside antibacterial effect of whole venom as well as purified enzyme was demonstrated by Grove’s method on Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae and Escherichia coli grown cultures, being Gram positive bacterials, more susceptible than Gram-negative bacterials. Moreover B. atrox crude venom and its purified enzyme LAO, presented an in vitro effect against Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes with an EC50 of 7,82 and 1,33 μg/ml respectively, and Trypanosoma cruzi epimastigotes with an EC50 of 7,95 ug/ml for whole venom and 1,38 μg/ml for purified enzyme. LAO does not have haemorragic nor hemolytic activities on mouse skin (20-22 g body weight) and human red blood cells respectively. However LAO produces edema with a DEM of 15,18 μg of protein. Key words: L-amino acid oxidase, snake, enzyme, Bothrops atrox, venom / Tesis

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100 y otra de intercambio catiónico sobre CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 12,14 veces con una actividad específica de 4,13 U/mg. Esta enzima es una glicoproteína ácida (17 % de carbohidratos asociados), homodimérica de 127,879 daltons de peso molecular, formada por dos subunidades de 63,128 daltons y posee por lo menos un enlace disulfuro intracatenario, que es importante para su actividad. La enzima mostró un pH óptimo de 8,3 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; pierde actividad en presencia de Zn2+ y tolera tamperaturas hasta los 55ºC. Se demostró la pureza y antigenicidad de la enzima mediante inmunodifusión e inmunoelectroforesis, empleando suero antibotrópico polivalente. Así mismo el efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció utilizando la técnica de Grove sobre cultivos de Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae y Escherichia coli observándose que las bacterias Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Además el veneno crudo de B. atrox y LAO presentaron un efecto in vitro contra promastigotes de Leishmania braziliensis braziliensis con una CE50 de 7,82 y 1,33 μg/ml respectivamente y contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi, con una CE50 de 7,95 μg/ml para el veneno crudo y 1,38 μg/ml para la enzima purificada. La enzima L-aminoácido oxidasa no tiene actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos, ni hemolítica sobre eritrocitos humanos lavados. Sin embargo produce edema, habiéndose calculado la DEM en 15,18 μg de proteína. Palabras clave: L-aminoácido oxidasa, serpiente, enzima, Bothrops atrox, veneno / A L-Aminoacid oxidase enzyme was purified and characterized from Bothrops atrox snake venom by two steps. It used a Sephadex G-100 column and ion exchange on CM-Sephadex C-50 at pH 6. The purification grade was 12,14 folds with a specific activity of 4,13 U/mg. This enzyme with a molecular weight of 127,879 daltons as determined by gel filtration is a noncovalent dimmer consisting of two subunits with a molecular weight each of 63,128 daltons as determined by SDS-PAGE, with at least one intrachain disulfide bond that is important for its activity. The enzyme exhibited a optimun pH of 8,3 using L- leucine as substrate. It is an acid glicoprotein containing 17% carbohydrate, being thermoestable till 55 ºC, labil to alkaline pH and susceptible to presence of Zn 2+. The antigenicity and homogeneity of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis using polivalent antibothropic antivenom. Beside antibacterial effect of whole venom as well as purified enzyme was demonstrated by Grove’s method on Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae and Escherichia coli grown cultures, being Gram positive bacterials, more susceptible than Gram-negative bacterials. Moreover B. atrox crude venom and its purified enzyme LAO, presented an in vitro effect against Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes with an EC50 of 7,82 and 1,33 μg/ml respectively, and Trypanosoma cruzi epimastigotes with an EC50 of 7,95 ug/ml for whole venom and 1,38 μg/ml for purified enzyme. LAO does not have haemorragic nor hemolytic activities on mouse skin (20-22 g body weight) and human red blood cells respectively. However LAO produces edema with a DEM of 15,18 μg of protein. Key words: L-amino acid oxidase, snake, enzyme, Bothrops atrox, venom

Memoria de título (Méd. Veterinario).-- Universidad de Concepción, 2006. / Contiene resumen en español e inglés. Bibliografía: h. 22-27.

Bothrops barnetti es una serpiente venenosa que habita las regiones de costa sierra y selva de la zona norte de Perú. La enzima similar a trombina de esta especie, denominada barnetobina, fue estudiada a partir de la purificación de los ácidos nucleicos así como de la proteína misma para determinar sus características moleculares y funcionales. La secuencia del cDNA de la barnetobina de 750 pb codifica 233 residuos aminoacídicos, los cuales conservan dominios comunes con las serinoproteasas. La barnetobina muestra homología con otras enzimas similares a trombina de veneno de serpientes donde fueron identificados los aminoácidos correspondientes al sitio catalítico y también los subsitios de unión a sustrato S1, S2 y S3. Además, se encontró tres motivos para N-glicosilación. La enzima nativa purificada es una glicoproteína monomérica que bajo condiciones reductoras y no reductoras presenta las dimensiones de 52 kDa y 48 kDa respectivamente, las cuales decrecen a 27 kDa después de la deglicosilación con PNGasa F. La barnetobina mostró actividad catalítica sobre fibrinógeno bovino, plasma y fibrinógeno humano, BApNA, TAME, BAEE y Chromozym TH; asimismo, produjo desfibrinación cuando fue suministrada a ratones por vía subcaudal. La proteasa logró liberar rápidamente el fibrinopéptido A del fibrinógeno humano. La actividad coagulante específica de la enzima fue equivalente a 251,7 NIH U/mg de trombina sobre fibrinógeno bovino. Las actividades amidásica y coagulante fueron inhibidas por el PMSF, el inhibidor de tripsina de soya y el DTT; en contraste, el 2β- mercaptoetanol, TLCK, EDTA y la heparina tuvieron poco o ningún efecto sobre la actividad amidásica. En este estudio se demostró la importancia de los carbohidratos N-ligados sobre la actividad similar a trombina de la barnetobina, la cual perdió su actividad biológica y enzimática cuando los carbohidratos fueron removidos. Se concluye que la barnetobina es una serinoproteasa coagulante del fibrinógeno cuyos azúcares asociados estarían involucrados en la estabilidad enzimática y la unión a sus sustratos. / Tesis

Se ha aislado una enzima similar a trombina del veneno de la serpiente peruana Bothrops barnetti mediante dos pasos cromatográficos sobre CM Sephadex C-50 y Sephadex G-100, en ambos casos utilizando Acetato de Amonio 0,05 M a pH 5,0. La enzima fue purificada 45 veces con un rendimiento de 14% y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteíca de 52 kDa en condiciones reductoras con 2β-Mercaptoetanol y de 48 kDa en condiciones no reductoras, determinándose que la enzima es de una sola cadena polipeptidica con al menos un enlace disulfuro. El tratamiento con N- glicosidasa (PNGasa F) determinó que es una glicoproteína con un 45% de contenido total de carbohidratos. La enzima mostró tener actividad coagulante sobre plasma citratado y fibrinógeno y actividad amidásica sobre BApNA y Chromozym TH, La potencia coagulante sobre fibrinógeno bovino fue equivalente a 131 unidades NIH de trombina/mg. La enzima es inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya calificándola como una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,0 y es estable hasta los 40 ºC. Se demostró mediante inmunoelectroforesis e inmunodifusión la antigenicidad de la enzima frente al suero antibotrópico polivalente sobre plasma citratado (DE: 250 µl de antiveneno/ mg de enzima). Palabras clave: Veneno, serpiente, enzima similar a trombina, Bothrops barnetti, coagulante. / --- A thrombin- like enzyme was purified from Bothrops barnetti peruvian snake venom using CM Sephadex C-50 followed by Sephadex G-100, in both two cases with 0,05 M Amonium Acetate buffer pH 5,0. The enzyme was purified 45 fold with 14% of yield and the PAGE-SDS showed only protein band of 52 kDa under reducing condition with 2β-Mercaptoetanol and 48 kDa under non reducing condition indicating that the enzyme has a single polypeptide chain with disulfide bond. The PNGase treatment showed that it is a basic glycoprotein containing 45% total carbohydrates. The enzyme has coagulant activity on fibrinogen and citrated plasma and amidolytic activity on BApNA and Chromozym TH. The coagulant potency was equivalent to 131 NIH thrombin Units/ mg. In addition the enzyme is inhibited by PMSF and soybean trypsin inhibitor suggesting that is a serine proteinase. The enzyme had optimal amidolytic activity pH was 8,0 and is stable until 40 ºC. The antigenicity and neutralization of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis with the polyvalent antibothropic serum on citrated plasma (ED: 250 µl of antivenom/ mg of enzyme). Key words: Venom, snake, enzyme, thrombin like, Bothrops barnetti, coagulant.