Se aisló parcialmente una hialuronidasa del veneno de Bothrops atrox mediante dos pasos cromatograficos sobre DEAE Sephadex A-50 y Sephadex G-50, utilizando en ambos casos acetato de amonio 0,05M y pH 5,0. La enzima fue purificada 145 veces con un rendimiento de 72 % y por PAGE-SDS se obtuvo una banda proteica con un peso molecular de 110 kDa en condiciones reductoras y no reductoras. Se determinó la estabilidad de la actividad de esta enzima en distintos valores de pH en el tiempo, así como la neutralización de sueros anti-ofídicos de tipo IgG e IgY producidos en el Instituto Nacional de Salud-Perú y en el Laboratorio de Biología Molecular – UNMSM respectivamente. La enzima revelo ser sensible a la temperatura, con un pH óptimo de 6,0 y encontrarse en cantidades bajas en el veneno. La actividad enzimática fue inhibida en mayor proporción por sueros anti-lachesicos que por sueros anti-botropicos, ensayos “in vitro” mostraron que incrementa la difusión del veneno en 50 %. Es inhibida totalmente por suero humano y dexametasona mientras que los ensayos con inhibidores demostraron que los residuos de Tyr y Cys son importantes para la actividad de esta enzima. Palabras clave: Veneno, serpiente, Bothrops atrox, hialuronidasa, glicano hidrolasa. / --- A hialuronidase was partially isolated from the venom of Bothrops atrox using DEAE Sephadex A-50 and Sephadex G-50, in both cases using ammonium acetate 0,05M pH 5,0 as buffer. The enzyme was purified with 145 fold, a yield of 72 % and a molecular weight of 110 kDa with and without 2-Mercaptoetanol by PAGE-SDS. The stability of the hialuronidase activity from the venom of the snake Bothrops atrox was defined at different pH values, as well the effect of anti-snakes serums of the IgG and IgY types produced by the National Institute of Health - Perú and the Laboratory of Molecular Biology-UNMSM respectively using the turbidimetric test Di Ferrante. This enzyme elucidate been sensitive to the temperature, optimum pH 6,0 and found at very low concentrations in the venom. The enzyme activity was inhibited in more proportion by the anti-lachesis-serums rather than anti-botropics-serums, also show to increase the venom diffusion in 50 %, besides of been inhibited totally by human-serum and dexametasona while the inhibitors assays showed that Tyr and Cys are important to the active site. Key words: Venom, snake, Bothrops atrox, hialuronidase, glycano hidrolase.

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100 y otra de intercambio catiónico sobre CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 12,14 veces con una actividad específica de 4,13 U/mg. Esta enzima es una glicoproteína ácida (17 % de carbohidratos asociados), homodimérica de 127,879 daltons de peso molecular, formada por dos subunidades de 63,128 daltons y posee por lo menos un enlace disulfuro intracatenario, que es importante para su actividad. La enzima mostró un pH óptimo de 8,3 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; pierde actividad en presencia de Zn2+ y tolera tamperaturas hasta los 55ºC. Se demostró la pureza y antigenicidad de la enzima mediante inmunodifusión e inmunoelectroforesis, empleando suero antibotrópico polivalente. Así mismo el efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció utilizando la técnica de Grove sobre cultivos de Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae y Escherichia coli observándose que las bacterias Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Además el veneno crudo de B. atrox y LAO presentaron un efecto in vitro contra promastigotes de Leishmania braziliensis braziliensis con una CE50 de 7,82 y 1,33 μg/ml respectivamente y contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi, con una CE50 de 7,95 μg/ml para el veneno crudo y 1,38 μg/ml para la enzima purificada. La enzima L-aminoácido oxidasa no tiene actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos, ni hemolítica sobre eritrocitos humanos lavados. Sin embargo produce edema, habiéndose calculado la DEM en 15,18 μg de proteína. Palabras clave: L-aminoácido oxidasa, serpiente, enzima, Bothrops atrox, veneno. / A L-Aminoacid oxidase enzyme was purified and characterized from Bothrops atrox snake venom by two steps. It used a Sephadex G-100 column and ion exchange on CM-Sephadex C-50 at pH 6. The purification grade was 12,14 folds with a specific activity of 4,13 U/mg. This enzyme with a molecular weight of 127,879 daltons as determined by gel filtration is a noncovalent dimmer consisting of two subunits with a molecular weight each of 63,128 daltons as determined by SDS-PAGE, with at least one intrachain disulfide bond that is important for its activity. The enzyme exhibited a optimun pH of 8,3 using L- leucine as substrate. It is an acid glicoprotein containing 17% carbohydrate, being thermoestable till 55 ºC, labil to alkaline pH and susceptible to presence of Zn 2+. The antigenicity and homogeneity of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis using polivalent antibothropic antivenom. Beside antibacterial effect of whole venom as well as purified enzyme was demonstrated by Grove’s method on Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae and Escherichia coli grown cultures, being Gram positive bacterials, more susceptible than Gram-negative bacterials. Moreover B. atrox crude venom and its purified enzyme LAO, presented an in vitro effect against Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes with an EC50 of 7,82 and 1,33 μg/ml respectively, and Trypanosoma cruzi epimastigotes with an EC50 of 7,95 ug/ml for whole venom and 1,38 μg/ml for purified enzyme. LAO does not have haemorragic nor hemolytic activities on mouse skin (20-22 g body weight) and human red blood cells respectively. However LAO produces edema with a DEM of 15,18 μg of protein. Key words: L-amino acid oxidase, snake, enzyme, Bothrops atrox, venom / Tesis

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops atrox, empleando dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100 y otra de intercambio catiónico sobre CM-Sephadex C-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 12,14 veces con una actividad específica de 4,13 U/mg. Esta enzima es una glicoproteína ácida (17 % de carbohidratos asociados), homodimérica de 127,879 daltons de peso molecular, formada por dos subunidades de 63,128 daltons y posee por lo menos un enlace disulfuro intracatenario, que es importante para su actividad. La enzima mostró un pH óptimo de 8,3 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; pierde actividad en presencia de Zn2+ y tolera tamperaturas hasta los 55ºC. Se demostró la pureza y antigenicidad de la enzima mediante inmunodifusión e inmunoelectroforesis, empleando suero antibotrópico polivalente. Así mismo el efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció utilizando la técnica de Grove sobre cultivos de Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae y Escherichia coli observándose que las bacterias Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Además el veneno crudo de B. atrox y LAO presentaron un efecto in vitro contra promastigotes de Leishmania braziliensis braziliensis con una CE50 de 7,82 y 1,33 μg/ml respectivamente y contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi, con una CE50 de 7,95 μg/ml para el veneno crudo y 1,38 μg/ml para la enzima purificada. La enzima L-aminoácido oxidasa no tiene actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos, ni hemolítica sobre eritrocitos humanos lavados. Sin embargo produce edema, habiéndose calculado la DEM en 15,18 μg de proteína. Palabras clave: L-aminoácido oxidasa, serpiente, enzima, Bothrops atrox, veneno / A L-Aminoacid oxidase enzyme was purified and characterized from Bothrops atrox snake venom by two steps. It used a Sephadex G-100 column and ion exchange on CM-Sephadex C-50 at pH 6. The purification grade was 12,14 folds with a specific activity of 4,13 U/mg. This enzyme with a molecular weight of 127,879 daltons as determined by gel filtration is a noncovalent dimmer consisting of two subunits with a molecular weight each of 63,128 daltons as determined by SDS-PAGE, with at least one intrachain disulfide bond that is important for its activity. The enzyme exhibited a optimun pH of 8,3 using L- leucine as substrate. It is an acid glicoprotein containing 17% carbohydrate, being thermoestable till 55 ºC, labil to alkaline pH and susceptible to presence of Zn 2+. The antigenicity and homogeneity of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis using polivalent antibothropic antivenom. Beside antibacterial effect of whole venom as well as purified enzyme was demonstrated by Grove’s method on Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Vibrio cholerae and Escherichia coli grown cultures, being Gram positive bacterials, more susceptible than Gram-negative bacterials. Moreover B. atrox crude venom and its purified enzyme LAO, presented an in vitro effect against Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes with an EC50 of 7,82 and 1,33 μg/ml respectively, and Trypanosoma cruzi epimastigotes with an EC50 of 7,95 ug/ml for whole venom and 1,38 μg/ml for purified enzyme. LAO does not have haemorragic nor hemolytic activities on mouse skin (20-22 g body weight) and human red blood cells respectively. However LAO produces edema with a DEM of 15,18 μg of protein. Key words: L-amino acid oxidase, snake, enzyme, Bothrops atrox, venom

Bothrops barnetti es una serpiente venenosa que habita las regiones de costa sierra y selva de la zona norte de Perú. La enzima similar a trombina de esta especie, denominada barnetobina, fue estudiada a partir de la purificación de los ácidos nucleicos así como de la proteína misma para determinar sus características moleculares y funcionales. La secuencia del cDNA de la barnetobina de 750 pb codifica 233 residuos aminoacídicos, los cuales conservan dominios comunes con las serinoproteasas. La barnetobina muestra homología con otras enzimas similares a trombina de veneno de serpientes donde fueron identificados los aminoácidos correspondientes al sitio catalítico y también los subsitios de unión a sustrato S1, S2 y S3. Además, se encontró tres motivos para N-glicosilación. La enzima nativa purificada es una glicoproteína monomérica que bajo condiciones reductoras y no reductoras presenta las dimensiones de 52 kDa y 48 kDa respectivamente, las cuales decrecen a 27 kDa después de la deglicosilación con PNGasa F. La barnetobina mostró actividad catalítica sobre fibrinógeno bovino, plasma y fibrinógeno humano, BApNA, TAME, BAEE y Chromozym TH; asimismo, produjo desfibrinación cuando fue suministrada a ratones por vía subcaudal. La proteasa logró liberar rápidamente el fibrinopéptido A del fibrinógeno humano. La actividad coagulante específica de la enzima fue equivalente a 251,7 NIH U/mg de trombina sobre fibrinógeno bovino. Las actividades amidásica y coagulante fueron inhibidas por el PMSF, el inhibidor de tripsina de soya y el DTT; en contraste, el 2β- mercaptoetanol, TLCK, EDTA y la heparina tuvieron poco o ningún efecto sobre la actividad amidásica. En este estudio se demostró la importancia de los carbohidratos N-ligados sobre la actividad similar a trombina de la barnetobina, la cual perdió su actividad biológica y enzimática cuando los carbohidratos fueron removidos. Se concluye que la barnetobina es una serinoproteasa coagulante del fibrinógeno cuyos azúcares asociados estarían involucrados en la estabilidad enzimática y la unión a sus sustratos. / Tesis

Se ha aislado una enzima similar a trombina del veneno de la serpiente peruana Bothrops barnetti mediante dos pasos cromatográficos sobre CM Sephadex C-50 y Sephadex G-100, en ambos casos utilizando Acetato de Amonio 0,05 M a pH 5,0. La enzima fue purificada 45 veces con un rendimiento de 14% y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteíca de 52 kDa en condiciones reductoras con 2β-Mercaptoetanol y de 48 kDa en condiciones no reductoras, determinándose que la enzima es de una sola cadena polipeptidica con al menos un enlace disulfuro. El tratamiento con N- glicosidasa (PNGasa F) determinó que es una glicoproteína con un 45% de contenido total de carbohidratos. La enzima mostró tener actividad coagulante sobre plasma citratado y fibrinógeno y actividad amidásica sobre BApNA y Chromozym TH, La potencia coagulante sobre fibrinógeno bovino fue equivalente a 131 unidades NIH de trombina/mg. La enzima es inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya calificándola como una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,0 y es estable hasta los 40 ºC. Se demostró mediante inmunoelectroforesis e inmunodifusión la antigenicidad de la enzima frente al suero antibotrópico polivalente sobre plasma citratado (DE: 250 µl de antiveneno/ mg de enzima). Palabras clave: Veneno, serpiente, enzima similar a trombina, Bothrops barnetti, coagulante. / --- A thrombin- like enzyme was purified from Bothrops barnetti peruvian snake venom using CM Sephadex C-50 followed by Sephadex G-100, in both two cases with 0,05 M Amonium Acetate buffer pH 5,0. The enzyme was purified 45 fold with 14% of yield and the PAGE-SDS showed only protein band of 52 kDa under reducing condition with 2β-Mercaptoetanol and 48 kDa under non reducing condition indicating that the enzyme has a single polypeptide chain with disulfide bond. The PNGase treatment showed that it is a basic glycoprotein containing 45% total carbohydrates. The enzyme has coagulant activity on fibrinogen and citrated plasma and amidolytic activity on BApNA and Chromozym TH. The coagulant potency was equivalent to 131 NIH thrombin Units/ mg. In addition the enzyme is inhibited by PMSF and soybean trypsin inhibitor suggesting that is a serine proteinase. The enzyme had optimal amidolytic activity pH was 8,0 and is stable until 40 ºC. The antigenicity and neutralization of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis with the polyvalent antibothropic serum on citrated plasma (ED: 250 µl of antivenom/ mg of enzyme). Key words: Venom, snake, enzyme, thrombin like, Bothrops barnetti, coagulant.

Se han determinado las principales propiedades bioquímicas e inmunológicas de la enzima similar a trombina (EST) de la serpiente peruana Bothrops atrox (“jergón”). Para este fin, la enzima fue purificada hasta la homogeneidad utilizando tres pasos cromatrográficos en Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 y Agarosa-PAB. Asimismo, se determinó el peso molecular por PAGE-SDS y el porcentaje de carbohidratos asociados mediante hidrólisis y análisis de hexosas, hexosaminas y ácido siálico. Luego se ensayaron las actividades fibrinocoagulante, amidolítica y esterásica, sobre fibrinógeno bovino, BApNA y BAEE, respectivamente, así como la hidrólisis sobre los sustratos cromogénicos S-2238, S-2251 y S-2266 y finalmente se realizó la identificación de la enzima aislada mediante la técnica de peptide mass fingerprinting. Para el análisis inmunoquímico, se inmunizaron conejos albinos con 150 µg de la enzima purificada a fin de obtener un suero hiperinmune anti-EST de B. atrox. Posteriormente se analizaron los patrones de reactividad inmunológica del suero contra la enzima purificada y los venenos de Bothrops atrox, Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus mediante la técnica de ELISA. Como resultado del análisis bioquímico se determinó que la enzima constituye el 1.7% del veneno completo, siendo purificada 25.5 veces y con un rendimiento del 43.3% utilizando BApNA como sustrato. La enzima presenta un peso molecular de 29.6 kDa, del cual el 14.2% lo constituyen los carbohidratos asociados, asimismo la EST de B. atrox produjo coagulación del fibrinógeno bovino y presentó actividad sobre BAEE, BApNA, S-2238 y S-2266, siendo incapaz de hidrolizar el sustrato S-2251. El análisis mediante espectrometría de masas de los péptidos obtenidos por la hidrólisis de la EST de B. atrox permitieron relacionarla con la proteína venombina A, presentando una homología en secuencia del 75% con esta proteína. Al finalizar el protocolo de inmunización se obtuvo un suero hiperinmune anti-EST de B. atrox con un título de 64000, siendo evidencia del potencial inmunogénico de esta proteína. Por otro lado, los anticuerpos producidos reaccionaron de forma cruzada con los venenos completos de B. atrox (9.9%) y B. brazili (9.6%) y en menor intensidad con los de L. muta y C. durissus, con valores de 5.1% y 4.8%, respectivamente. / We have determinated the main biochemical and immunological properties of a thrombin-like enzyme (TLE) isolated from Bothrops atrox Peruvian snake venom (“jergón”). In this concern, TLE was purified until homogeneity using three chromatographical steps on Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 and Agarose-PAB. Furthermore, molecular weight was determinate by PAGE-SDS and associated carbohydrates by hydrolysis and analysis of hexoses, hexosamines and sialic acid. Then, fibrinocoagulant, amidolytic and sterasic activities were measured on bovine fibrinogen, BApNA and BAEE, respectively, hydrolysis on S-2238, S-2251 and S-2266 chromogenic substrates, and finally molecular identity of this enzyme was determinated by peptide mass fingerprinting technique. For the immunochemical analyses, white rabbits were immunized with 150 µg of EST and a hyperimmune serum anti-TLE was obtained. Patterns of immunological reactivity were determined between this serum against TLE and venoms of Bothrops atrox, Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus using ELISA technique. As a result of biochemical analysis, we determined that this enzyme represents 1.7% of total venom and was 25.5-fold purified with a 43.3% yield, using BApNA as substrate. This enzyme had 29.6 kDa, where 14.2% was associated carbohydrates. The TLE of B. atrox produced coagulation of bovine fibrinogen and had enzymatic activity on BAEE, BApNA, S-2238 and S-2266, being unable to act on S-2251. Mass spectrometry analysis of hydrolyzed EST of B. atrox results on a 75% sequence homology with venombin A protein. At the final of immunization protocol, we obtained an anti-TLE hyperimmune serum with a title of 64000, which showed the potential immunogenicity of this protein. On the other hand, raised antibodies cross-reacted with total venoms of B. atrox (9.9%) y B. brazili (9.6%) and with less intensity with those from L. muta and C. durissus (5.1% and 4.8%, respectively).

Los venenos de serpientes del género Bothrops tienen como característica la presencia de enzimas proteolíticas, cuya acción biológica es muy variada y que contribuye con la aparición de hemorragias, desórdenes en la coagulación y necrosis. El objetivo de este trabajo fue purificar y caracterizar una de las enzimas proteolíticas presentes en el veneno de la serpiente peruana Bothrops pictus (Serpentario “Oswaldo Meneses”-UNMSM). El veneno fue resuspendido en buffer Acetato de amonio 0,1 M pH 5 y se purificó mediante dos pasos cromatográficos sobre Sephadex G-75 y DEAE Sephadex A-50. La enzima fue purificada 1,73 veces con un rendimiento del 1,2% y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteíca de 62 kDa en condiciones no reductoras. Asimismo, con el mismo peso molecular se observó una banda de digestión sobre los geles de poliacrilamida con gelatina. En relación a la actividad biológica, se determinó que la dosis hemorrágica mínima (DHM) para la enzima purificada fue de 0,226 μg, es decir con un aumento de 2,4 veces la actividad hemorrágica del veneno crudo. La enzima fue termoestable hasta los 55 ºC y presentó un pH óptimo de 7,5. Además, se mostró que la enzima fue fuertemente inhibida por EDTA, 2-mercaptoetanol y DTT siendo dependiente de los iones zinc y magnesio. La enzima fue totalmente neutralizada por el suero botrópico polivalente (INS–Perú) y mostró antigenicidad mediante el ensayo de inmunodifusión. / Tesis

En el presente estudio se han evaluado algunas características bioquímicas y biológicas de una hialuronidasa previamente encontrada en el veneno de Lachesis muta, para lo cual fue necesario optimizar el método de purificación. Usando 50 mg de veneno disueltos en búfer acetato de amonio 0,05 M pH 5,0, la hialuronidasa fue separada empleando una cromatografía en Sephadex G-100 seguida de una columna de intercambio catiónico en CM Sephadex C-50, utilizando el mismo bufer como eluyente. En este sistema, la enzima se recuperó usando una gradiente de NaCl de 0 a 0,7 M, con un rendimiento de 39.02% y una purificación de 51,4 veces. El análisis de pureza por PAGE-SDS reveló una sola banda proteica con peso molecular de 65 kDa. La enzima mostró un pH óptimo de 5,0, un Km de 34,4 µg de ácido hialurónico/ml y un Vmax de 40,9 µg de ácido hialurónico hidrolizado/minuto/mg. Así mismo, la hialuronidasa demostró una dependencia absoluta por los iones Cl- y Br-. En cuanto a la actividad biológica, los ensayos realizados en placas de agar- sangre mostraron que la enzima actúa como un factor difusor que permite la hemólisis por acción de la fosfolipasa del propio veneno. Así también, se ha observado que la inyección por vía subcutánea de la enzima purificada en ratones, no causó ningún efecto hasta las 6 horas usando cantidades de 0,4 hasta 1,6 mg. / --- In the present research some biochemical and biological characteristics of a hyaluronidase from the venom of Lachesis muta snake were evaluated. In this way the method for purification of this enzyme was improved. 50 mg of whole venom was disolved in 0.05 M amoniun acetate buffer pH 5.0 and applied to Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by CM Sephadex C-50 exchange chromatography using the same buffer. In the last system, the enzyme was recovered after a gradient of NaCl from 0 to 0,7 M with 51,4 folds and 39,02% of yield. The hyaluronidase was achieved as homogeneus band of protein by PAGE-SDS with 65 kDa of molecular weigth. The enzyme registered 5,0 as optimus pH, Km: 34,4 µg of hyaluronic acid/ml and Vmax: 40.9 µg hidrolizade hyaluronic acid/minute/mg. The enzyme showed a total dependence for Cl- and Br- ions. The biological activity assays using agar-blood plates showed the hyaluronidase was a spreading factor, because of hemolisis by phospholipase A2 ocurred using the total venom. In addition, any biological effect was observed after inoculation of 0,4 to 1,6 mg of the hyaluronidase on mice. / Tesis

Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition. / Tesis

Se ha aislado una enzima similar a trombina del veneno de la serpiente peruana Bothrops barnetti mediante dos pasos cromatográficos sobre CM Sephadex C-50 y Sephadex G-100, en ambos casos utilizando Acetato de Amonio 0,05 M a pH 5,0. La enzima fue purificada 45 veces con un rendimiento de 14% y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteíca de 52 kDa en condiciones reductoras con 2β-Mercaptoetanol y de 48 kDa en condiciones no reductoras, determinándose que la enzima es de una sola cadena polipeptidica con al menos un enlace disulfuro. El tratamiento con N- glicosidasa (PNGasa F) determinó que es una glicoproteína con un 45% de contenido total de carbohidratos. La enzima mostró tener actividad coagulante sobre plasma citratado y fibrinógeno y actividad amidásica sobre BApNA y Chromozym TH, La potencia coagulante sobre fibrinógeno bovino fue equivalente a 131 unidades NIH de trombina/mg. La enzima es inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya calificándola como una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,0 y es estable hasta los 40 ºC. Se demostró mediante inmunoelectroforesis e inmunodifusión la antigenicidad de la enzima frente al suero antibotrópico polivalente sobre plasma citratado (DE: 250 µl de antiveneno/ mg de enzima). Palabras clave: Veneno, serpiente, enzima similar a trombina, Bothrops barnetti, coagulante. / A thrombin- like enzyme was purified from Bothrops barnetti peruvian snake venom using CM Sephadex C-50 followed by Sephadex G-100, in both two cases with 0,05 M Amonium Acetate buffer pH 5,0. The enzyme was purified 45 fold with 14% of yield and the PAGE-SDS showed only protein band of 52 kDa under reducing condition with 2β-Mercaptoetanol and 48 kDa under non reducing condition indicating that the enzyme has a single polypeptide chain with disulfide bond. The PNGase treatment showed that it is a basic glycoprotein containing 45% total carbohydrates. The enzyme has coagulant activity on fibrinogen and citrated plasma and amidolytic activity on BApNA and Chromozym TH. The coagulant potency was equivalent to 131 NIH thrombin Units/ mg. In addition the enzyme is inhibited by PMSF and soybean trypsin inhibitor suggesting that is a serine proteinase. The enzyme had optimal amidolytic activity pH was 8,0 and is stable until 40 ºC. The antigenicity and neutralization of enzyme was demonstrated by inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis with the polyvalent antibothropic serum on citrated plasma (ED: 250 µl of antivenom/ mg of enzyme). Key words: Venom, snake, enzyme, thrombin like, Bothrops barnetti, coagulant.