Busca encontrar las condiciones óptimas de cantidad de enzima, tiempo de digestión y cantidad de muestra para la determinación de triptófano en la harina de pescado. Evalúa su precisión a través de la repetibilidad, exactitud a través de los porcentajes de recuperación y límite de cuantificación. Busca una alternativa en la determinación de triptófano, ya que este aminoácido no puede ser tratado por hidrólisis ácida.

Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition. / Tesis

Se purificó la enzima L-aminoácido oxidasa (LAO) del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox “Jergón” y se determinaron sus propiedades cinéticas. La LAO fue purificada mediante dos pasos cromatográficos, una columna de filtración molecular empleando Sephadex G-75 y otra de intercambio catiónico con CM-Sephadex C-50. La enzima tuvo un peso molecular de 54.6 kDa calculado por PAGE-SDS. Entre los sustratos ensayados a pH 8.5, la LAO presentó mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, estando su actividad máxima en un rango de pH de 6.9 a 9.6. Para cada sustrato se determinaron los valores de pH óptimo obteniéndose 8.1 con L-metionina, 8.9 con L-arginina, y 8.2 con L-fenilalanina. Para estos aminoácidos, se determinaron los parámetros cinéticos de Km, Vmax, Kcat y Kcat/Km a pH 7.5 y 8.5. De acuerdo a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a pH 8.5 (Kcat/km igual a 71.213 x 104 s-1 M-1) y a 7.5 (Kcat/km igual a 40.903 x 104 s-1 M-1). Asimismo se evaluó la inhibición enzimática a pH 8.5 utilizando ácido antranílico, ácido benzoico, ácido salicílico y ácido sulfanílico, determinándose el modelo de inhibición y los valores de Ki. Se encontró que el ácido antranílico tuvo el menor valor de Ki (0.0082 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico fueron inhibidores de tipo mixto. / An L-amino acid oxidase from Bothrops atrox venom was purified and its kinetic properties determinated. Purification procedure was carried out through two chromatography steps: a size exclusion chromatography on Sephadex G-75, followed by an ion exchange chromatography on CM-Sephadex C-50. This enzyme had a molecular weight of 54.6 kDa calculated by SDS-PAGE. Between substrates assayed to pH 8.5, LAO had higher specific activity on L-phenilalanine followed by L-leucine, L-metionine and L-arginine. These were in a range of pH 6.9 to 9.6 being optimum values of 8.1 for L-metionine, 8.9 for L-arginine, and 8.2 for L-fenilalanine. Kinetics parameters (Km, Vmax, Kcat and Kcat/Km) for these L-amino acids were determinated at pH 7.5 and 8.5. According to catalytic efficiency, we found that L-leucine was the best substrate at pH 7.5 (Kcat/km same to 40.903 x 104 s-1 M-1) and 8.5 (Kcat/km same to 71.213 x 104 s-1 M-1). By the way, we evaluated enzyme inhibition at pH 8.5 using anthranilic, benzoic, salicylic and sulphanylic acid, determinating the best model of enzyme inhibition as well as Ki values. The minimal Ki value was for anthranilic acid Ki (0.0082 mM), fitting it to a non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and sulphanylic acid showed mixed-type inhibition.

El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la calidad de la proteína de la harina de lombriz (Eisenia foetida), mediante ensayos biológicos en ratas. Para lo cual se elaboró harina de lombriz y se realizó el análisis proximal de la misma mediante métodos de la AOAC 1990. Se utilizaron 12 ratas albinas raza Holtzman en crecimiento para los ensayos de índice de eficiencia proteinica (PER), razón proteínica neta (NPR), digestibilidad verdadera (DV) y valor biológico verdadero (VBV), y 24 para la utilización proteica neta (NPU). Los resultados de PER, NPR, DV, VBV y NPU fueron comparados con datos de caseína. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba T para muestras emparejadas con un nivel de significancia del 95% - Excel 2000. En la elaboración de la harina de lombriz se obtuvo un rendimiento de 11.5% cuya composición química en base seca fue de: 68.20% de proteína, 7.50% de grasa, 15.82% de carbohidratos y 8.48% de ceniza. En los ensayos biológicos de NPR, DV y VBV se encontró diferencia significativa a favor de la caseína, mientras que en los ensayos biológicos de PER y NPU la diferencia no fue significativa, por lo cual se concluyó que la calidad biológica de la proteína de la harina de lombriz no se iguala a la caseína; pero, supera en calidad a otras proteínas de origen animal como la carne de bovino, sus vísceras, carne de vacuno, sus vísceras y el corazón de pollo, y productos de origen vegetal como el maíz, las lentejas y frijoles.

Se ha purificado y caracterizado la L-Aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops pictus “Jergón de costa” (BpicLAAO), mediante cromatografía de filtración molecular sobre Sephadex G-100, seguida de una cromatografía de intercambio catiónico sobre CM Sephadex C-50, ambas equilibradas con buffer acetato de amonio 0,05M pH 6. El grado de purificación fue de 22,02 veces con una actividad específica de 4,25 U/mg. La pureza de la proteína fue evaluada por HPLC en fase reversa y mediante PAGE-SDS. Es una proteína ácida conteniendo 18,7 % de carbohidratos asociados, con un peso molecular de 132,27 kDa, por cromatografía de filtración y de 65,2 y 58,6 kDa por PAGESDS bajo condiciones reductoras y no reductoras respectivamente, evidenciando que se trata de una enzima homodimérica con al menos un puente disulfuro intracatenario, el cual es importante para su actividad. El peso de la enzima disminuyó a 47 kDa después del tratamiento con PNGasa F. La enzima mostró un pH óptimo de 8,5 usando L-leucina como substrato, es inestable en el rango de pH alcalino a partir de 9,0; tolera hasta los 55 ºC. La actividad enzimática disminuyó considerablemente en presencia de Zn2+, glutatión y 2-mercaptoetanol, lo que sugiere la presencia de por lo menos un puente disulfuro intracatenario para su actividad. BpicLAAO presenta actividad hemorrágica sobre piel de ratones albinos siendo la dosis hemorrágica mínima de 2,79 μg de proteína, produce edema, habiéndose calculado la dosis edemática mínima en 7,80 μg de proteína; también inhibe la agregación plaquetaria inducida por ADP de una manera dosis dependiente. El efecto antibacteriano tanto del veneno crudo como de la enzima purificada se evidenció sobre cultivos de bacterias Gram positivas y Gram negativas, observándose que las Gram positivas son más susceptibles que las Gram negativas. Se demostró la antigenicidad de la enzima por inmunodifusión e inmunoelectroforesis, usando suero antibotrópico polivalente. Asímismo mediante el análisis molecular a partir de las secuencias de cDNA de LAAO de B. pictus se obtuvo una secuencia de 1494 pb que codifica un péptido señal y una proteína madura de 487 residuos aminoacìdicos. BpicLAAO, muestra homología con otras enzimas similares de venenos de serpientes habiéndose identificado los aminoácidos correspondientes a los dominios de unión al FAD, de unión al substrato y el dominio helicoidal. Encontrándose además dos motivos para N-glicosilación. Palabras clave: enzima, flavoproteína, N-glicosilación, secuencia nucleotídica, serpiente, veneno. / Tesis

El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la calidad de la proteína de la harina de lombriz (Eisenia foetida), mediante ensayos biológicos en ratas. Para lo cual se elaboró harina de lombriz y se realizó el análisis proximal de la misma mediante métodos de la AOAC 1990. Se utilizaron 12 ratas albinas raza Holtzman en crecimiento para los ensayos de índice de eficiencia proteinica (PER), razón proteínica neta (NPR), digestibilidad verdadera (DV) y valor biológico verdadero (VBV), y 24 para la utilización proteica neta (NPU). Los resultados de PER, NPR, DV, VBV y NPU fueron comparados con datos de caseína. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba T para muestras emparejadas con un nivel de significancia del 95% - Excel 2000. En la elaboración de la harina de lombriz se obtuvo un rendimiento de 11.5% cuya composición química en base seca fue de: 68.20% de proteína, 7.50% de grasa, 15.82% de carbohidratos y 8.48% de ceniza. En los ensayos biológicos de NPR, DV y VBV se encontró diferencia significativa a favor de la caseína, mientras que en los ensayos biológicos de PER y NPU la diferencia no fue significativa, por lo cual se concluyó que la calidad biológica de la proteína de la harina de lombriz no se iguala a la caseína; pero, supera en calidad a otras proteínas de origen animal como la carne de bovino, sus vísceras, carne de vacuno, sus vísceras y el corazón de pollo, y productos de origen vegetal como el maíz, las lentejas y frijoles.