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Expresión de proteína quimiótica de monocitos-3 (MCP-3/CCL7) en fluido gingival crevicular y en lesiones periapicales de dientes con periodontitis apical crónica

Mardones Peñailillo, Jeannette January 2009 (has links)
Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / ntroducción La periodontitis apical crónica (PAC) es una respuesta inmunoinflamatoria causada por la infección bacteriana de la pulpa dental, en la que hay destrucción de los tejidos periapicales. La proteína quimiotáctica de monocitos – 3 (MCP3/CCL7) es una quimioquina que atrae, principalmente, a células del linaje monocito-macrófago, las que son fundamentales durante el desarrollo de la PAC, por lo que podría participar en la patogénesis de las lesiones periapicales (LPAs) y su caracterización en el fluido gingival crevicular (FGC) podría reflejar el estado de salud/enfermedad de los tejidos perirradiculares. El objetivo de este trabajo es comparar la expresión de MCP-3, en FGC de dientes con diagnóstico de PAC y de dientes sanos; y establecer una correlación entre la expresión de MCP-3 en FGC de dientes con PAC y homogeneizados de biopsias de LPAs de dichos dientes. Material y métodos Se seleccionaron 12 pacientes con diagnóstico clínico de PAC e indicación de exodoncia. Se obtuvieron muestras de FGC de dientes con PAC con indicación de exodoncia y libres de enfermedad periodontal, FGC de sus contralaterales sanos y biopsias de las LPAs obtenidas luego de las exodoncias de los dientes con PAC. Para determinar la expresión de MCP-3 se realizó Western blot. La intensidad de las bandas se midió por análisis densitométrico con el programa UN SCAN IT ® 1 Resultados MCP-3 se expresa en FGC de dientes sanos y de dientes con PAC, así también en las LPAs. Los niveles de MCP-3 en FCG de dientes con PAC fueron significativamente mayores que en sanos. Se observó correlación positiva en la expresión de MCP-3 entre FGC de dientes con PAC y homogeneizados de biopsias de LPAs. Conclusiones MCP-3 participaría en la patogénesis de las LPAs, probablemente actuando como quimioatractante de células del linaje monocito-macrófago. La LPA sería la principal fuente de MCP-3. A su vez, nuestros resultados sugieren que el FGC podría ser una herramienta útil en el estudio de la PAC, ya que refleja cambios en su composición de acuerdo al estado de salud/enfermedad de los tejidos periapicales.
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Efecto de Kisspeptina sobre la expresión y actividad de las metaloproteinasas de matriz extracelular 2 y 9 a nivel ovárico en ratas en el periodo de subfertilidad

Las Heras Parraguez, Macarena Andrea January 2016 (has links)
Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / En la actualidad existen mayores posibilidades de desarrollo académico y profesional para las mujeres. Esto, sumado al fácil acceso a métodos para el control de la natalidad, ha llevado a que se postergue la maternidad a edades más tardías. Esta situación se ha convertido en un gran problema para los países por sus consecuencias a nivel económico, social y de salud pública. Por ello, es de suma importancia estudiar los mecanismos involucrados en el proceso de envejecimiento reproductivo. La regulación de la función ovárica se conoce ampliamente desde el punto de vista neuroendocrino, sin embargo, poco se sabe de los mecanismos que la controlan a nivel local. Se cree que un grupo de péptidos, conocidos como kisspeptinas (KISS), cuyos niveles en el ovario varían conforme al progreso del ciclo estral, podrían estar regulando al sistema proteolítico de las metalloproteinasas de matriz extracelular (MMPs) a nivel local, de manera similar a como se ha descrito en otros tejidos. De ser así, KISS podría regular cíclicamente el remodelamiento de la matriz extracelular ovárica controlando los niveles de expresión y/o actividad de las MMPs. Esto cobraría especial importancia en el periodo de subfertilidad, puesto que se ha descrito que los cambios morfológicos asociados al envejecimiento ovárico en la rata van acompañados de un aumento significativo en los niveles de KISS en el ovario. En base a esto, se postuló que “el aumento de kisspeptina endógeno produce la disminución de la expresión del transcrito y/o actividad de las metaloproteinasas de matrizextracelular-2 y -9 en el ovario en el periodo de subfertilidad en ratas”. El objetivo general del trabajo consisitió en caracterizar el patrón de expresión de los mRNAs de Kiss-1, MMP-2 y MMP-9 y los niveles de actividad proteolítica en ovarios de ratas fértiles y subfértiles en diferentes etapas del ciclo estral, y estudiar el efecto de la adición del péptido KP-10 y del bloqueo de su receptor con el antagonista p234 sobre la expresión y actividad de estas MMPs. Para llevar a cabo este objetivo, se obtuvieron ovarios en distintas fases del ciclo estral y, a partir de ellos, se estudiaron los niveles de mRNA de Kiss-1, MMP-2 y MMP-9 mediante RT-qPCR, y los niveles de actividad gelatinásica mediante zimografía. Además, se realizaron incubaciones in vitro de ovarios de ratas de 6, 8 y 10 meses de edad en presencia del péptido KP-10 y de KP-10 + p234 y, a partir de éstos, se estudiaron los niveles de mRNA de MMP-2 y MMP-9 y los niveles de actividad gelatinásica. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron que los niveles de mRNA de las gelatinasas varían de forma opuesta en el ciclo estral, lo que coincide con el rol fisiológico que se ha descrito para cada una de ellas en procesos como ovulación y formación del cuerpo lúteo. Además, se encontró que los niveles del mRNA de MMP-2 disminuyen de forma significativa en el ovario en el periodo de subfertilidad, probablemente como resultado de la disminución en el número de folículos antrales y cuerpos lúteos que se ha descrito a los 10 meses de edad en la rata. Por último, se encontró que los resultados no avalan la hipótesis planteada puesto que el tratamiento de los ovarios con el péptido KP-10 o con KP-10 + p234 no tuvo efecto sobre la expresión de los mRNAs de MMP-2 y MMP-9 en el periodo fértil ni en el subfértil. En el caso de MMP-2, tampoco se observó efecto a nivel de actividad. / There are currently greater possibilities of academic and professional development for women. This, coupled with ease of access to birth control methods, has led women to postpone motherhood to later ages. This situation has become a major problem for countries due to its economic, social, and public health consequences. Therefore, it is important to study the mechanisms involved in the process of reproductive aging. While the regulation of the ovarian function is widely known from the neuroendocrine point of view, little is known about the mechanisms that control it locally. It is believed that a group of peptides, known as kisspeptins (KISS), whose levels vary according to the progress of the estrous cycle, could be regulating the extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) proteolytic system locally, similarly to what has been described in other tissues. If so, KISS could be cyclically regulating the ovarian extracellular matrix remodeling by controlling the MMP expression levels and/or activity. This would be especially important in the subfertility period, since it has been described that the morphological changes associated with the ovarian aging in the rat are accompanied with a significative increase in the ovarian KISS levels. Based on this, it was postulated that “the endogenous kisspeptin increase causes a decrease in the transcript expression and/or extracellular matrix metalloproteinases -2 and -9 activity in the ovary on the subfertility period in rats”. The main objective was to characterize the Kiss-1, MMP-2 and MMP-9 expression pattern and the gelatinolitic activity levels in ovaries of fertile and subfertile rats at different stages of the estrous cycle, and to study the effect of an addition of KP-10 peptide and the blocking of its receptor with p234 antagonist over the expression and activity of these MMPs. To carry out this objective, ovaries were obtained in different stages of the estrous cycle and, from them, the Kiss-1, MMP-2 and MMP-9 mRNA`s levels were studied by RT-qPCR, and the gelatinolytic activity levels by zymography. In addition, in vitro incubations of rat ovaries were performed with KP-10 peptide or with KP-10 peptide + p234 and, from these, the mRNA`s levels of MMP-2 and MMP-9 and the gelatinolytic activity levels were studied. The results obtained in this work showed that the gelatinases mRNA levels vary in an opposite way in the estrous cycle, which coincides with the physiological role that has been described for each of them in processes such as ovulation and formation of the corpus luteum. In addition, MMP-2 mRNA levels were found to decrease significantly in the ovary in the subfertile period, probably as a result of the decrease in the number of antral follicles and corpus luteum that has been described at 10 months old in the rat. Finally, it was found that the results do not support the postulated hypothesis since the treatment of the ovaries with the KP-10 peptide or with KP-10 + p234 had no effect on the MMP-2 and MMP-9 mRNA`s expression levels in the fertile or subfertile period. In the case of MMP-2 there was no effect in the activity levels
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Purificación y caracterización de una metaloproteasa hemorrágica del veneno de la serpiente del Perú Bothrops pictus (Tschudi, 1845) "Jergón de la Costa"

Bellido More, Candy Christie January 2014 (has links)
Los venenos de serpientes del género Bothrops tienen como característica la presencia de enzimas proteolíticas, cuya acción biológica es muy variada y que contribuye con la aparición de hemorragias, desórdenes en la coagulación y necrosis. El objetivo de este trabajo fue purificar y caracterizar una de las enzimas proteolíticas presentes en el veneno de la serpiente peruana Bothrops pictus (Serpentario “Oswaldo Meneses”-UNMSM). El veneno fue resuspendido en buffer Acetato de amonio 0,1 M pH 5 y se purificó mediante dos pasos cromatográficos sobre Sephadex G-75 y DEAE Sephadex A-50. La enzima fue purificada 1,73 veces con un rendimiento del 1,2% y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteíca de 62 kDa en condiciones no reductoras. Asimismo, con el mismo peso molecular se observó una banda de digestión sobre los geles de poliacrilamida con gelatina. En relación a la actividad biológica, se determinó que la dosis hemorrágica mínima (DHM) para la enzima purificada fue de 0,226 μg, es decir con un aumento de 2,4 veces la actividad hemorrágica del veneno crudo. La enzima fue termoestable hasta los 55 ºC y presentó un pH óptimo de 7,5. Además, se mostró que la enzima fue fuertemente inhibida por EDTA, 2-mercaptoetanol y DTT siendo dependiente de los iones zinc y magnesio. La enzima fue totalmente neutralizada por el suero botrópico polivalente (INS–Perú) y mostró antigenicidad mediante el ensayo de inmunodifusión. / Tesis
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Infección ex vivo de vellosidades coriónicas humanas con Trypanosoma cruzi: acción de las enzimas proteolíticas cruzipaína y metaloproteinasas 2 y 9

Castillo Rivas, Christian January 2011 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas congénita es causada por el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi que alcanza al feto atravesando la barrera placentaria. Durante la invasión tisular T. cruzi induce destrucción de la matriz extracelular (MEC) mediante secreción de proteasas como Cruzipaína (Cz) e inducción de la expresión y activación de proteasas propias del tejido como las metaloproteinasas de la matriz (MMPs). La posible participación de estas proteasas en placenta humana durante la transmisión congénita no ha sido estudiada. Se analizó la expresión y actividad de las MMP 2 y 9 durante la infección ex vivo de vellosidades coriónicas placentarias humanas con el parásito. Se determinó la participación de estas MMPs y de Cz en la degradación de moléculas glicosiladas y del colágeno tipo I del tejido conectivo fetal. Adicionalmente se evaluó el efecto de inhibidores para ambos tipos de proteasas tanto sobre los efectos tisulares de la invasión parasitaria como sobre su infectividad. Se obtuvieron tripomastigotes de la cepa Dm28c a partir de células Vero infectadas y placentas de término de madres sanas. Se incubaron trozos de tejido placentario (0,5 cm3) durante 24 horas en presencia y ausencia de 105 y 106 tripomastigotes y en presencia y ausencia de inhibidores para Cz (E-64) y para MMP (doxiciclina). La infección placentaria se comprobó mediante detección del parásito por PCR. Las MMP se analizaron mediante Western Blot, Inmunohistoquímica y Zimografía. Las modificaciones estructurales de colágeno I se determinaron histoquímicamente mediante la tinción de picro rojo sirio y las alteraciones de moléculas glicosiladas mediante tinción de ácido periódico de Schiff. La expresión y activación de las MMPs depende de la cantidad de parásitos usados. La inhibición de la actividad proteolítica de Cz y las MMP previene la destrucción de colágeno tipo I y alteraciones de moléculas glicosiladas inducida por T. cruzi. La inhibición de la actividad de las proteasas no previene la infección ex vivo del parásito. Se concluye que tanto proteasas parasitarias así como propias del tejido a infectar constituyen parte de los mecanismos de infección tisular de T. cruzi / Proyectos Bicentenario Anillo 112 y FONDECYT 11080166
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Efecto de TNF-α sobre el Sistema de las Metaloproteinasas de la Matriz en Endometrio Eutópico de Endometriosis

Galleguillos Díaz, Carolina Pía January 2007 (has links)
La endometriosis es una patología caracterizada por la presencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina que afecta alrededor del 10% de la población femenina en edad reproductiva, pero su etiología y patogénesis aún son poco claras. La presencia aumentada de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-á) en el fluido peritoneal puede potenciar la capacidad invasiva de este tejido endometrial ectópico mediante la alteración del sistema de las metaloproteinasas (MMPs). Tanto el endometrio ectópico como el endometrio eutópico de estas pacientes son diferentes al de mujeres sin endometriosis. Sin embargo, poco se sabe del comportamiento de las MMPs y menos de su regulación en el endometrio eutópico de estas pacientes. Proponemos que en el endometrio eutópico de pacientes con endometriosis ya existe una expresión alterada del sistema de las MMPs que afecta su funcionalidad y favorece la capacidad invasiva del tejido endometrial, donde TNF-á es una de las citoquinas involucrada en su regulación. Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar la expresión de MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-26, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4 y el efecto de TNF-á en tejido endometrial eutópico de mujeres con endometriosis y compararlo con endometrio normal (control) en modelos ex vivo a través del ciclo menstrual y en cultivos celulares endometriales. Los resultados en el endometrio de pacientes con endometriosis, respecto al endometrio control, muestran un aumento de MMP-7 en fase proliferativa (mRNA: 56% y proteína: 57%) y una disminución de MMP-9 en fase secretora media (proteína: 58%), de MMP-26 en fase secretora inicial (mRNA: 60%), de TIMP-2 en fases proliferativa (mRNA: 45% y proteína: 50%) y secretora inicial (mRNA: 64%) y de TIMP-4 en fase secretora tardía (mRNA: 98%); MMP-2 y TIMP-3 fueron similares al control. En cultivos celulares de ambos grupos de endometrios: TNF-á (10 ng/mL, 24 horas) aumentó la secreción de MMP-2 (parcialmente inhibido por Bay 11-7085, inhibidor de la vía de NFêB), el mRNA y la secreción de MMP-9 (independiente de NFκB) y el mRNA de MMP-7 (independiente de NFκB) y disminuyó el mRNA y proteína de TIMP-4 (efectos inhibidos por Bay). En endometrio eutópico de pacientes con endometriosis, la expresión o secreción de las MMPs está aumentada y la de los TIMPs reducida, efectos incrementados por TNF-á, lo que puede estar afectando su funcionalidad y promoviendo su actividad proteolítica permitiendo una capacidad mayor para invadir sitios ectópicos
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Comparación de la cantidad de TIMP-1 en líquido sinovial de la articulación metacarpofalángica normal y alterada de equinos

Jiles Meza, Jorge Luis January 2006 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad degenerativa articular (EDA) u osteoartritis (OA) afecta el rendimiento de los equinos con las consecuentes pérdidas económicas. El trauma articular puede provocar la liberación de mediadores químicos que incluyen citoquinas y enzimas denominadas metaloproteinasas (MMPs), que pueden degradar la matriz extracelular (MEC), componente importante del cartílago articular. Un mecanismo de regulación en la degradación de la MEC lo constituye la acción de los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMPs), que son inhibidores naturales de las MMPs encontrados en varios tejidos y fluidos corporales. El balance que existe entre MMPs y TIMPs está involucrado en eventos normales y patológicos entre los cuales se encuentran la cicatrización, la remodelación de tejidos, la angiogénesis, tumorogénesis y metástasis. En éste estudio se analizaron muestras de líquido sinovial equino (LS) para comparar la cantidad de TIMP-1 de las articulaciones metacarpofalángicas normales y alteradas. Se trabajó con cuatro grupos de LS clasificados según las características del cartílago articular (CA) y de la membrana sinovial (MS). En el primer grupo se consideraron las muestras de LS cuya articulación presentaba el CA y la MS normales (NN), en el segundo grupo el CA normal y la MS alterada (NA), en el tercer grupo el CA alterado y la MS normal (AN) y en el último grupo el CA y la MS alterados (AA). Se encontró que los niveles de TIMP-1 fueron significativamente más altos en los LS provenientes de las articulaciones de equinos normales, tanto en membrana sinovial como en cartílago articular (NN), que en aquellos que al menos presentaban una alteración (AN, NA y AA).
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El papel del parvovirus B19, de los virus herpes y de la metaloproteinasa-2 y 9 en la etiopatogenia de la arteritis de células gigantes

Rodríguez Pla, Alicia 14 March 2003 (has links)
La etiología de la arteritis de células gigantes (ACG) es desconocida y sus aspectos etiopatogénicos están poco estudiados.Objetivos. 1. Estudiar la presencia de parvovirus B19 y los virus herpes en las arterias temporales positivas y negativas para la ACG. 2. Estudiar la asociación entre la expresión de metaloproteinasa-2 (MMP-2) y 9 (MMP-9) y el resultado de la biopsia de la arteria temporal (BAT), qué células las expresan y su localización. 3. Analizar si la presencia de estas MMP o los virus se relaciona con las alteraciones histológicas y con las variables clínico-epidemiológicas de los pacientes. 4. Conocer cuáles son los factores predictores del resultado de la BAT. Material y métodos. Se incluyeron todas las BAT valorables realizadas de forma consecutiva en el Hospital Universitari Vall d'Hebron por sospecha clínica de ACG entre Enero de 1997 y Marzo del 2002. Como criterios anatomopatológicos se utilizaron los del ACR. La presencia de ADN vírico se determinó mediante reacción en cadena de la polimerasa. Se realizaron nuevas tinciones de hematoxilina-eosina, de fibras elásticas y tricrómicro de Masson. Los macrófagos CD68, la MMP-2 y la MMP-9 se detectaron mediante inmunohistoquímica. De las historias clínicas se obtuvieron datos clínicos y epidemiológicos. Para el ajuste multivariable se utilizó la regresión logística múltiple.Resultados. En el período en estudio se encontraron 147 BAT válidas, 50 (35%) positivas para ACG y 97 (66%) negativas. Se recuperó la historia clínica de 125 pacientes, 46 (36,8%) con BAT (+) y 79 (63,2%) BAT (-). No se encontró presencia de ADN de los virus estudiados en ninguna de las BAT. La MMP-9 se expresaba con más frecuencia en BAT positivas que negativas para ACG (OR=2,93 p=0,005). Para la MMP-2 la diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,08). Ambas MMP se expresaban en macrófagos de la íntima y de la media cercanos a la lámina elástica interna, en células gigantes y en células con apariencia de músculo liso de la media y de la íntima. Le expresión de MMP-2 se relacionó de forma inversa con la afectación exclusiva de la adventicia (p=0,047) y de forma positiva con la fiebre (p=0,025). La MMP-9 se relacionó de forma positiva con: hiperplasia intimal (0,037), degeneración lámina elástica (0,0001), disminución de la luz (0,008), hipercolesterolemia (0,032), hiperestesia craneal (0,009). Ajustando por variables que podrían influir en el resultado de la biopsia, (edad, género, tiempo de evolución de los síntomas hasta la BAT, tratamiento previo con glucocorticoides y año de realización de la biopsia), se mantuvieron los resultados entre la expresión de MMP-2 y MMP-9. El engrosamiento de la arteria temporal, la disminución de su pulso y la pérdida de peso se asociaron de forma independiente con el resultado de la biopsia, ajustando por edad, género, días de evolución, tratamiento previo, año de realización, cefalea, hiperestesia craneal, claudicación mandibular, alteraciones visuales y VSG.Conclusiones. Ninguno de los virus estudiados parece estar implicado en la etiopatogenia de la ACG. La MMP-9, al contrario de la MMP-2, parece tener un papel en dicha etiopatogenia. La MMP-9 se asocia con hipercolesterolemia y la MMP-2 con la fiebre. El engrosamiento, la disminución de la luz de la arteria temporal y la pérdida de peso se han encontrado asociadas a una elevada probabilidad de resultado positivo de la biopsia en los enfermos estudiados. / The etiology of giant cell arteritis (GCA) is unknown and their etiopathogenic aspects have been little studied.Aims. 1. To study the presence of parvovirus B19 and herpes viruses in positive and negative temporal artery biopsies (TAB) for GCA. 2. To study the association between metalloproteinase-2 (MMP-2) and 9 (MMP-9) expression and TAB result, the type of cells expressing them and their location. 3. To analyse if the presence of these MMP or the viruses is related to histologic findings and to clinical-epidemiological variables of the patients. 4. To identify predictive factors of TAB result. Material and methods. All the valid TAB consecutively performed in Hospital Universitari Vall d'Hebron because of clinical suspicion of GCA between January 1997 and March 2002. ACR anatomopathological criteria were used. The presence of viral DNA was determined by means of polymerase chaín reaction. New hematoxilin-eosin, elastic fibers and Masson's trichromic stainings were performed. CD68 macrophages, MMP-2 and MMP-9 were detected by immunohistochemistry. Clinical and epidemiological data were obtained from clinical files. The multiple logistic regression was used for multivariable analysis. Results. During the study period, 147 valid TAB were found, 50 (35%) positive and 97 (66%) negative for GCA. Clinical files of 125 patients were retrieved, 46 (36.8%) with positive TAB and 79 (63.2%) with negative TAB. DNA of the viruses studied was not found in any of the TAB. MMP-9 was more frequently expressed in positive than in negative TAB for GCA (OR=2.93; p=0.005). The difference was not statistically significant for MMP-2 (p=0.08). Both MMP were expressed in macrophages of the intima and the media near internal elastic lamina, in giant cells and in cells of the media and the intima resembling smooth muscle cells. The expression of MMP-2 was inversely related to the isolated involvement of the adventitia (p=0.047) and positively to fever (p=0.025). MMP-9 was positively related to: intimal hyperplasia (0.037), elastic lamina degeneration (0.0001), luminal narrowing (0.008), hypercholesterolemia (0.032), scalp tenderness (0.009). Controlling for variables which could influence the biopsy result (age, gender, evolution of symptoms before TAB, previous glucocorticoids treatment and year of biopsy performance), the results between MMP-2 and MMP-9 expression remained unaltered. Temporal artery thickening, pulse decrease and weight loss were independently associated with biopsy result, controlling for age, gender, days of evolution of symptoms, previous treatment, year of biopsy performance, headache, scalp tenderness, jaw claudication, visual disturbances and erythrocyte sedimentation rate.Conclusions. None of the viruses studied seems to be involved in GCA etiopathogenesis. MMP-9, in contrast to MMP-2, seems to play an etiopathogenic role in GCA. MMP-9 is associated with hypercholesterolemia and MMP-2 with fever. Temporal artery thickening and luminal narrowing and weight loss are associated with a high probability of positive biopsy result in the patients studied.
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Asociación de las metaloproteinasas y sus inhibidores tisulares con el sistema de la fibrinolisis y los marcadores de activación neutrofílica en los derrames pleurales paraneumónicos

Iglesias Sáenz, Daniel 14 November 2002 (has links)
Introducción Los enzimas proteolíticos responsables de la degradación de la matriz extracelular han demostrado tener un papel importante en los procesos inflamatorios, aunque han sido poco estudiados en la patogenia de los derrames pleurales (DP) paraneumónicos. Las metaloproteinasas (MMP) son una familia de proteasas que degradan prácticamente todos los componentes proteicos de la matriz extracelular. La actividad de las MMP está controlada por inhibidores tisulares específicos (TIMP). En la patogenia de los DP paraneumónicos se han implicado mecanismos inflamatorios y de alteración del sistema de la fibrinolisis pleural. La respuesta inflamatoria pleural iniciada por el mesotelio provoca un aumento de la permeabilidad vascular y la liberación de mediadores inflamatorios, como la IL-8 y el TNF-?, que favorecerán la formación de DP exudado, la invasión del espacio pleural por células inflamatorias y la liberación de productos de la degranulación del neutrófilo, como la elastasa polimorfonuclear. El sistema de la fibrinolisis esta regulado por los activadores de plasminógeno (PA), tisular PA (t-PA) y urokinasa PA (u-PA), y por los inhibidores de los activadores del plasminógeno (PAI), tipos 1 y 2. Objetivos El objetivo de este trabajo es estudiar diferentes metaloproteinasas y sus inhibidores tisulares en diferentes tipos de DP y evaluar su asociación con los marcadores de activación neutrofílica y con elementos del sistema de la fibrinolisis en los DP paraneumónicos.Método El estudio incluyó 51 DP paraneumónicos (30 empiemas o DP paraneumónicos complicados, 21 DP paraneumónicos no complicados), 28 DP tuberculosos, 30 DP neoplásicos y 30 trasudados. Se determinaron por ELISA, en plasma y líquido pleural, los marcadores de activación neutrofílica (TNF-?, IL-8, elastasa polimorfonuclear), elementos del sistema de la fibrinolisis (t-PA, u-PA, PAI-1, PAI-2), y diferentes MMP (MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-9) y TIMP (TIMP-1, TIMP-2). Resultados Todos los líquidos pleurales estudiados presentaron concentraciones elevadas de MMP-2 y TIMP-1. Los empiemas y DP paraneumónicos complicados presentaron concentraciones de MMP-1, MMP-8 y MMP-9 significativamente superiores respecto al resto de exudados. En este grupo de DP, no se observó asociación entre los niveles de MMP y TIMP en plasma y en líquido pleural. En los DP paraneumónicos, se observó una asociación positiva de MMP-1, MMP-8 y MMP-9 con los marcadores de activación neutrofílica, u-PA y PAI-1. Además, la MMP-8 en líquido pleural se relacionó con la presencia de paquipleuritis residual en este grupo de derrames pleurales.Conclusiones1. Existen niveles elevados de MMP-2 y TIMP-1 en todos los líquidos pleurales estudiados, lo que sugiere una expresión constitutiva por parte de las células mesoteliales pleurales.2. Las concentraciones en líquido pleural de MMP-1, MMP-8 y MMP-9 son significativamente superiores en los DP paraneumónicos complicados y empiemas. 3. La ausencia de correlación entre las concentraciones de MMP y TIMP en líquido pleural y plasma, en los empiemas y DP paraneumómicos complicados, sugiere una expresión compartimentalizada de las mismas en el espacio pleural. 4. En los DP paraneumónicos existe una íntima asociación positiva de MMP-1, MMP-8 y MMP-9 con los marcadores de activación neutrofílica, u-PA y PAI-1, relacionados con el desarrollo de complicaciones locales en los DP bacterianos.5. La MMP-8, en líquido pleural, se relaciona con la presencia de paquipleuritis residual en los DP paraneumónicos. 6. La asociación de MMP-1, MMP-8 y MMP-9 con los marcadores de activación neutrofílica y el sistema de la fibrinolisis, así como la relación de la MMP-8 con la presencia de complicaciones locales en los DP paraneumónicos, sugiere un papel relevante de estas metaloproteinasas en la fisiopatología de los DP bacterianos. / Introduction: Proteolytic enzymes responsible for breakdown of the extracellular matrix play an important role in inflammatory processes, although they have been little studied in relation to the pathogenesis of exudative pleural effusions (PE). The metalloproteinases (MMPs) are a family of proteases that break down virtually all the protein components of the extracellular matrix. The activity of the MMPs is controlled by specific tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). Inflammatory mechanisms and alterations in the balance of pleural fibrinolysis have been implicated in the pathophysiology of infectious PE. The inflammatory response initiated by the mesothelium provokes increased vascular patency and the release of inflammatory mediators, e.g. interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor alpha (TNF-?), thereby favoring formation of exudative PE, invasion of the pleural space by inflammatory cells and release of neutrophil degranulation products, such as polymorphonuclear elastase (PMN-E). The fibrinolytic system is regulated by two plasminogen activators (PAs), tissue PA (t-PA) and urokinase PA (u-PA), and by plasminogen activator inhibitors (PAIs) types 1 and 2 (PAI-1, PAI-2). Objectives: The aim of this work was to study several metalloproteinases and their tissue inhibitors in PE and to evaluate the association between these enzymes and neutrophilic activation markers and elements of the fibrinolysis system in parapneumonic effusions.Methods: The study included 51 parapneumonic effusions (30 empyema or complicated parapneumonic, 21 non-complicated parapneumonic), 28 tuberculous, 30 malignant and 30 transudates. Neutrophilic activation markers (TNF-?, IL-8, polymorphonuclear elastase), fibrinolytic system variables (t-PA, u-PA, PAI-1, PAI-2), and several MMPs (MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-9) and TIMPs (TIMP-1, TIMP-2), were determined by ELISA in plasma and pleural fluid. Results: Elevated MMP-2 and TIMP-1 concentrations were observed in all the pleural fluid samples studied. The group of empyema or complicated parapneumonic effusions showed higher MMP-1, MMP-8 and MMP-9 concentrations than the remaining exudates. There was no correlation between MMP and TIMP levels in plasma and pleural fluid in this group of effusions. In parapneumonic effusions, MMP-1, MMP-8 and MMP-9 showed a positive correlation with the neutrophilic activation markers and with u-PA and PAI-1. Moreover, there was a relationship between MMP-8 concentration in pleural fluid and pleural thickening at the end of treatment. Conclusions: 1. Elevated MMP-2 and TIMP-1 levels were found in all the pleural fluid samples studied, suggesting their constitutive expression by mesothelial cells.2. The group of empyema or complicated parapneumonic effusions showed the highest concentrations of MMP-1, MMP-8 and MMP-9 in pleural fluid. 3. In empyema and complicated parapneumonic effussion, no correlation was found between plasma and pleural fluid levels of MMPs and TIMPs, suggesting a compartmentalization of these enzymes in the pleural space. 4. In parapneumonic effusions exists a close positive correlation of MMP-1, MMP-8 and MMP-9 with the neutrophilic activation markers (IL-8, TNF-?, PMN-E), u-PA and PAI-1, all of them related to the developement of local complications in infectious effusions. 5. In parapneumonic effusions, pleural fluid MMP-8 was related to the presence of residual pleural thickening. 6. In parapneumonic effusions, the association of MMP-1, MMP-8 and MMP-9 with neutrophil activation markers and the fibrinolysis system, and also the relation of MMP-8 with the presence of local complications, suggests an important role of this enzymes in the physiopathology of infectious effusions.
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Expresión de anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) y análisis de su capacidad neutralizante de la actividad hemorrágica de una fracción del veneno de la serpiente Bothrops atrox

Leiva Duran, Walter Jhon January 2019 (has links)
Expresa y purifica anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) en Escherichia coli y evaluar su capacidad para neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción pesada del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox, en ratones de laboratorio. Se analizaron 18 Nb expresados y purificados en E. coli para determinar su capacidad neutralizante de la actividad hemorrágica empleando ratones de laboratorio. Para esto se realizó un fraccionamiento del veneno de serpiente Bothrops atrox por cromatografía de exclusión molecular sobre resina Sephadex G-100 y se seleccionó una fracción de alto peso molecular con actividad hemorrágica. Se evaluó la dosis hemorrágica mínima (DHM) en el veneno crudo (0.810 μg) y en la fracción (0.433 μg) la cual representó 1.87 veces superior a la del veneno crudo; luego se evaluó la dosis eficaz 50% (DE 50) para cada Nb usando como dosis reto 4 DHM. Se encontró que 6 Nb tienen capacidad neutralizante además uno de ellos tiene una dosis eficaz 50% contra el efecto hemorrágico muy efectivo de 2247 μL de antiveneno/mg de veneno. También se evaluó la neutralización de la citotoxicidad de algunos Nb. Se concluye que algunos de los anticuerpos recombinantes de un solo dominio de llama (Lama glama) obtenidos en este estudio, son capaces de neutralizar la actividad hemorrágica de una fracción del veneno de la serpiente peruana B. atrox. Hay Nb que pueden ser usados para la formulación de un antídoto recombinante efectivo y económico. / Tesis

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