Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-17T16:40:15Z No. of bitstreams: 1 2012_RafaelDonadelliMelani_Parcial.pdf: 4654950 bytes, checksum: 7edd9468c1ef1b6ce3657f041425449a (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-24T12:12:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RafaelDonadelliMelani_Parcial.pdf: 4654950 bytes, checksum: 7edd9468c1ef1b6ce3657f041425449a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-24T12:12:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RafaelDonadelliMelani_Parcial.pdf: 4654950 bytes, checksum: 7edd9468c1ef1b6ce3657f041425449a (MD5) / A peçonha de aranhas é um conjunto de diferentes moléculas bioativas usadas para subjugar a presa e como mecanismo de defesa. Essas moléculas atuam de forma variada em diversos sistemas biológicos, porém pouco se sabe sobre as peçonhas de aranhas caranguejeiras do Brasil. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização química e farmacológica de alguns componentes bioativos não peptídicos presentes na peçonha de Lasiodora sp. A peçonha bruta de Lasiodora sp. apresenta efeito inotrópico e cronotrópico negativos em preparação de coração in situde rã e de contração e diminuição da resposta de acetilcolina (Ach) em relação ao controle, em preparação de músculo reto abdominal de rã. O efeito sobre o coração é atribuído ao acúmulo de Ach na peçonha na concentração de 8,75±0,45 µg/mg de peçonha bruta, quantificada analiticamente por LC-MS/MS. A presença de Ach também foi constatada na peçonha de outras aranhas e outros animais peçonhentos como escorpiões e lacraias. O efeito sobre o músculo ocorre nos receptores nicotínicos para Ach e está relacionado à presença de ésteres de colina com núcleos imidazólicos. Os compostos foram identificadosquimicamente através de diferentes revelações após cromatografia de camada delgada e por espectrometria de massa. Este estudo contribui para a compreensão da diversidade e complexidade de moléculas de baixa massa molecular não peptídicas presentes na peçonha da aranha Lasiodora sp., bem como preenche lacunas até então não esclarecidas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The spiders venoms are a diverse set of bioactive molecules used for predation and as a defense mechanism. Although these molecules act on many biological systems by different means, little is known about the tarantula spiders venoms from Brazil. Thus, the objective of this study was to characterize chemically andpharmacologically some of the non-peptide bioactive components present in the venom of Lasiodora sp. The crude venom of Lasiodora sp. presents inotropic and chronotropic negative effects in in situ frog heart preparation. In frog rectus abdominis preparation the crude venom led to contraction and decrease of the action of acetylcholine (Ach). The effect on the heart is attributed to Ach accumulation on the venom at a concentration of 8.75 ± 0.45 µg/mg of crude venom, analytically quantified by LC-MS/MS. The presence of Ach was also found in the venom of other spiders and other venomous animals such as scorpions and centipedes. The effect on the muscle occurs on nicotinic Ach receptors and is related to the presence choline esters with imidazole nuclei. The compounds were chemically identified by various spraying reagents after thin layer chromatography and by mass spectrometry. This study contributes to understand the molecular diversity and complexity of non-peptide compounds with low molecular weight present in the venom of the spider Lasiodora sp. and fills unexplained gaps in the study of tarantula venoms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-11-14T11:55:11Z No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-11-14T12:18:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T12:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Aranhas produzem em sua peçonha uma complexa mistura de moléculas, as quais, devido a seus potenciais neurotoxicos, tem despertado o interesse para a prospecção de novos fármacos e pesticidas. No entanto, poucos estudos são realizados com a peçonha de aranhas caranguejeiras, em especial de espécies encontradas no Brasil. O presente estudo teve como objetivo a caracterização da peçonha bruta da aranha caranguejeira Acanthoscurrio poulensis em busca de peptídeos neuroativos, sendo este o primeiro estudo completo realizado com essa peçonha. A peçonha de A. paulensis apresentou um total de 58 frames cromatograficas e 97 massas moleculares distintas, variando de m/z 601,4 a 21.932,3. A dose letal media em camundongos foi de 25,45 ± 2,42 µg/g. Nos ensaios em coração de rã (coração in situ e fatias isoladas de ventrículo), a peçonha bruta e a "fração de baixa massa molecular" (FBMM) promoveram efeitos semelhantes ao do estímulo vagal, os quais foram bloqueados na presença de atropina, um antagonista muscarinico. A fração protéica (FP) da pegonha não apresentou atividade similar nessas preparações. Um peptídeo denominado Ap1a, eluído aos 41% de acetonitrila no fracionamento da peçonha bruta, foi isolado e caracterizado. A seqüência precursora da Apia apresentou um peptídeo sinal e pro-peptídeo contendo 23 e 27 resíduos de aminoácidos, respectivamente, e 48 resíduos de aminoácidos, com seis cisteínas, referentes ao peptídeo maduro. Esse peptídeo, com massa molecular monoisotopica ([M+H]+) de 5.457,79, apresentou de 60 a 84% de identidade com toxinas da família da HWTX-II. Diferentemente do padrão estrutural proposto para essas toxinas, a Ap1a apresentou um arranjo das pontes dissulfeto típico do motivo ICK. A Ap1a induziu um efeito paralítico dependente da dose em lagartas Spodoptero frugiperda, com DE50 de 13,01 ± 4,21 µg/g. No circuito da Fibra Gigante de Drosophilo melonogoster, a Ap1a causou a redução de freqüência e amplitude nas respostas das vias GF-TTM e GF-DLM, indicando uma ação na junção neuromuscular de Drosophilo, a qual e mediada por receptores glutamatergicos. A Apia foi também letal a camundongos (30 mg/animal via intracranial), causando hipermotilidade com movimentos circulares e saltos e crises tônicas generalizadas com status epiiepticus e morte entre 25 e 35 min, sendo esses efeitos semelhantes aos reportados com a administração via i.c.v. de NMDA, um agonista glutamatergico. A Ap1a (1 µM) não alterou a resposta induzida por acetilcolina na preparação com células de rabdomiossarcoma, e seus efeitos foram mínimos nos canais hNav1.2, hNav1.4, hNav1.5 e hNav1.6. Dessa forma, o presente estudo proporcionou a caracterização química e biológica de uma nova molécula neuroativa da peçonha da aranha A. paulensis, com possível ação na neurotransmissao glutamatergica, e também a caracterização da peçonha bruta, mostrando uma grande variedade de compostos que podem ser futuramente estudados visando a melhor compreensão de canais iônicos ou receptores celulares e o desenvolvimento de novos fármacos e pesticidas. / Spiders produce in their venoms a complex mixture of molecules which, due to their neurotoxic potential, have raised interest in prospecting new drugs and pesticides. Nevertheless, few studies are carried out with tarantula venoms, especially with species found in Brazil. The present study aimed to characterize the crude venom from Aconthoscurria paulensis tarantula venom in search of neuroactive peptides, being this the first complete study performed with this venom. The venom of A. paulensis presented a total of 58 chromatographic fractions and 97 different molecular masses ranging from m/z 601.4 to 21,932.3. The median lethal dose in mice was 25.45 ± 2.42 |ig/g. On the frog heart assays [in situ and isolated ventricle slices), the crude venom and the "low molecular mass fraction" (LMMF) promoted effects similar to vagal stimulation, which were blocked in the presence of atropine, a muscarinic antagonist. The proteic fraction did not show similar effects on frog heart tissue. A peptide named Apia, eluted with 41% acetonitrile in the crude venom fractionation was isolated and characterized. The Apia showed 48 amino acid residues, with six cysteines, and a precursor sequence showing a signal peptide and pro¬peptide containing 23 and 27 residues, respectively. This peptide, with a monoisotopic molecular mass ([M+H]+) of 5457.79, presented 60 to 84% identity with toxins from the HWTX-II family. Unlike the structural pattern proposed for these toxins, Apia presented an arrangement of disulfide bonds typical of the ICK motif. The Apia induced a dose-dependent paralytic effect in Spodoptera frugiperda caterpillars, with and ED50 of 13.01 ± 4.21 ng/g. In the Drosophilo melonogaster Giant Fiber circuit, Apia has reduced both the amplitude and frequency of responses from GF-TTM and GF-DLM pathways, indicating an action at the Drosophilo neuromuscular junction, which is mediated by glutamatergic receptors. The Apia was also lethal to mice (30 |_ig/animal by intracranial route), causing hypermotility with circular and jump movements and generalized tonic seizures with status epilepticus and death between 25 and 35 min. These effects were similar to those reported with the administration by i.e.v. route of NMDA, a glutamatergic agonist. The Apia (1 yiM) did not alter the response induced by acetylcholine on the rhabdomyosarcoma cells preparation, and it presented minimal effects on hNavl.2, hNavl.4, hNavl.5 and hNavl.6 channels. Thus, this study provided chemical and biological characterization of a new neuroactive molecule from A. paulensis spider venom, with possible action on glutamatergic neurotransmission, and also the crude venom characterization, showing a wide variety of compounds that can be further studied in order to better understanding ion channels or cell receptors and to the design of new drugs and pesticides.

Dissertação(mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-03-18T18:33:28Z No. of bitstreams: 1 2010_SolangeCristinaRegoFernandes.pdf: 3140317 bytes, checksum: 5132f0dfcdca97c725e1888ea71940f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-03-21T11:56:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_SolangeCristinaRegoFernandes.pdf: 3140317 bytes, checksum: 5132f0dfcdca97c725e1888ea71940f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-21T11:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_SolangeCristinaRegoFernandes.pdf: 3140317 bytes, checksum: 5132f0dfcdca97c725e1888ea71940f7 (MD5) / A peçonha de aranhas tem provado ser uma fonte valiosa de componentes farmacologicamente ativos capazes de exercer as mais diversas funções. Por atuarem em diferentes sistemas biológicos, a caracterização de componentes bioativos desperta grande interesse na prospecção de novos fármacos. Poucos trabalhos com aranhas caranguejeiras brasileiras têm sido desenvolvidos nessa área e nenhum até o momento foi realizado com a peçonha de Nhandu coloratovillosus. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a composição bioquímica da peçonha de N. coloratovillosus visando à identificação de compostos bioativos. A peçonha bruta foi submetida a fracionamento por RP-HPLC e 35 frações foram eluídas. Análises por MALDI-TOF MS detectaram a presença de 46 componentes de massas moleculares distintas. Por meio de eletroforese foi possível visualizar a presença de componentes de alta massa molecular. Um componente com atividade hialuronidásica foi identificado e purificado, apresentando aproximadamente 42 kDa. Foi possível determinar a concentração inibitória mínima da peçonha bruta de N. coloratovillosus contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Foi identificada atividade antibacteriana em quatro frações cromatográficas e um grupo de frações com baixa massa molecular (GF1), entretanto não foi possível a determinação de MIC. A aplicação de 1,5 mg da peçonha bruta de N. coloratovillosus apresentou um efeito neurotóxico irreversível em nervo ciático de rã, enquanto que GF1 apresentou um leve efeito reversível. Um peptídeo teve sua estrutura primária parcialmente elucidada e análises por alinhamento revelaram 90% de identidade com LTx2, uma toxina isolada de Lasiodora sp. que interfere nas correntes de Ca++ em canais para Ca++ voltagem-dependentes. A utilização de 365 nM desse peptídeo em ensaio cardiotóxico não causou efeito significativo na ampitude do estímulo. O estudo e caracterização de componentes bioativos presentes na peçonha de aranhas são de extrema relevância, uma vez que podem auxiliar no esclarecimento de questões taxonômicas, na identificação de potenciais drogas terapêuticas e no entendimento da biologia desses animais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Spiders venoms has proved to be a valuable source of pharmacologically active compounds, capable of performing diverse functions. By acting on different biological systems, the characterization of such compounds exerts grest interest in prospecting for new drugs. Few studies with Brazilian spiders have been developed in this area and none so far has been conducted with the venom of Nhandu the venom of N. Coloratovillosus, aiming at the identification of biologically active compounds. The crude venom was frationated by RP-HPLC, and 35 fractions were eluted. Analysis by MALDI-TOF MS detected the presence of 46 compounds with different molecular weights. The presence of components with high molecular weights was visualized by SDS-PAGE. One component with hyaluronidase activity was identified and purified, with a molecular mass of approximately 42 kDa. The minimal inhibitory concentration (MIC) of the crude venom of N. Coloratovillosus was determined against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ntibacterial activity was identified in four chromatographic fractions and a group of low molecular weight fractions (GF1), however it was not possible to determine their MIC. The application of 1,5 mg of the crude venom of N. Coloratovillosus showed an ireversible neurotoxic effect in frog sciatic nerce, whereas GF1 showed a mild reversible effect. The primary structure of one peptide was partially elucidated, and alignment analysis eveled 90% identity with LTx2, a toxin isolated from Lasiodora sp. Wich modulates Ca++ currents in Ca++ voltage-dependent channels. The utilization of 365 nM of this peptide in a cardiotoxic test caused no significant effect at the amplitude of the stimulus. The study and characterization of bioactive compounds present in the venom of spiders is of utmost importance since it may help in the understanding of taxonomic issues, the biology of these animals and in the identification of potential therapeutic drugs.