Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Química / La presente tesis es un aporte al conocimiento en el área de la Química medicinal mediante el diseño y síntesis de nuevos derivados indólicos que actúen como ligandos multifuncionales con potencial acción antidepresiva. Los estudios de afinidad se efectuaron sobre h-TSER (proteína transportadora de serotonina humana), D2s (receptor de dopamina D2 corto humano) e inhibición sobre la enzima MAO-A (monoamino oxidasa de rata). Estructuralmente las nuevas familias corresponden a indolil propilpiperazinas conectadas a: anillos benzoxazínicos (F1), derivados morfolinoetilbenzamidas fluorados (F2) y anillos aminopiridínicos (F3). Los estudios de afinidad efectuados por desplazamiento de radioligandos en las 3 familias, mostraron que 14 compuestos que exhibieron valores de Ki en el rango nanomolar (3.0-16nM) en la proteína TSER. En los estudios de afinidad por desplazamiento de radioligando para el receptor D2s, 11 compuestos exhibieron afinidades entre 330-910 nM. Finalmente, en los ensayos en MAO–A, 7 compuestos mostraron porcentajes de inhibición sobre el 50%. Solo una (familia III) exhibió un perfil de acción con acción multimodal dual Los compuestos F3F (Ki TSER = 3,13 nM; e inhibición MAO-A = 50%), F3G (Ki TSER = 13,10 nM; e inhibición MAO-A = 75%) y F3L (Ki TSER = 9,64 nM; e inhibición MAO-A = 67%). Todos los ensayos farmacológicos fueron complementados contrastados y discutidos con estudios de acoplamiento molecular inducido (docking) / The main goal of the present thesis is to contribute to the knowledge of the medicinal chemistry through the design and synthesis of novel indol derivatives functioning as multitargets agents with potential antidepressive action. Binding affinities studies were carried out in h-SERT (human serotonine transporter proteine), hD2s (human short-dopamine receptor) and rat MAO-A enzyme inhibition. Indolylpropyl piperazine moieties were connected to the following scaffolds: functionalized benzoxazine rings (F1), morpholinoethylfluorinated benzamide derivatives (F2) and functionalized aminopyridines (F3). Radioligand binding assays on SERT carried out for compounds belonging to the three families showed that 14 compounds displayed Ki values in the nanomolar range (3.0-16nM) six of them belonging to the first family. The D2s receptor study gave 11 compounds displaying affinities between 330-910 nM, the MAO-A assays revealed that 7 compounds showed enzyme inhibition values over 50%. Only Family III displayed a dual mode of biological activity. Compounds F3F (Ki SERT = 3.13 nM, MAO-A inhibition = 50%), F3G (Ki SERT = 13.10 nM, MAO-A inhibition = 75%) and F3L (Ki SERT = 9.64 nM, MAO-A inhibition = 67%). The pharmacological results were supported and discussed using induced molecular coupling studies (docking)

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las proteínas son los polímeros más complejos sintetizados en la naturaleza, estas deben plegarse y adoptar complicadas estructuras tridimensionales para cumplir su función. Más aún, algunas proteínas requieren enhebrar su cadena principal formando un nudo para llegar a su estructura final. Entender como estos nudos (o topologías anudadas) afectan las propiedades y función de las proteínas ha sido un tema de gran interés en biofísica. Así como una cuerda obtiene una nueva función o comportamiento con un nudo, las proteínas anudadas podrían tener propiedades únicas, muy distintas a su contraparte desanudada. Simulaciones moleculares realizadas con polímeros con similar grado de compactación de las proteínas, indican que si el plegamiento de una proteína fuera un proceso al azar la probabilidad de que estas formen un nudo puede llegar a ser de un 90%. Sin embargo sólo un 0,5% de las estructuras de proteínas conocidas poseen un nudo. En consecuencia, se ha propuesto que las proteínas con topologías anudadas han sido seleccionadas negativamente durante la evolución. La presente tesis tiene como objetivo dilucidar si las topologías anudadas en proteínas dificultan procesos biológicos asociados a la translocación de proteínas. Los procesos de translocación de proteínas son fundamentales para la viabilidad celular, ya que permiten la correcta localización celular de proteínas así como también su degradación selectiva. Experimentos in silico muestran que los nudos podrían obstruir el paso de las proteínas que los contienen obstruyendo su translocación a través de canales o poros estrechos. Para poner a prueba esta hipótesis se utilizó la proteasa ATP dependiente ClpXP de Escherichia coli como un modelo para ensayar la translocación y degradación de proteínas anudadas tipo 31. Esta proteasa se encarga de degradar selectivamente sustratos proteicos, desplegándolos mecánicamente para luego translocarlos a través de su estrecho poro central. Si las topologías anudadas dificultan estos procesos se podría explicar su baja representación en la naturaleza. Se encontró que la proteína anudada MJ0366, de Methanocaldococcus jannaschii, se degrada fácilmente por ClpXP cuando su degradación comienza desde su extremo C-terminal. Sin embargo, cuando se agregó la proteína fluorescente verde (GFP), que normalmente es degradada por ClpXP, al extremo libre de MJ0366 (extremo N-terminal), la proteasa es incapaz de degradar este sustrato multidominio liberando un producto parcialmente degradado. El peso molecular de este producto corresponde a GFP más 48 aminoácidos, este tamaño sugiere que el nudo de MJ0366 se aprieta contra el dominio plegado de GFP, protegiéndola de la degradación. No obstante, cuando se incrementa la distancia entre GFP y MJ0366, mediante la inserción de un polipéptido desplegado, la protección de GFP disminuye dramáticamente. Estos resultados indican la existencia de dos posibles vías para la degradación de sustratos anudados multidominio: i) el nudo se desliza y aprieta contra GFP deteniendo la degradación, o ii) el nudo es translocado por ClpXP cuando este se aprieta antes de llegar GFP. En este último caso ClpXP puede degradación de todo el sustrato. Para estudiar en mayor detalle el mecanismo de degradación de los sustratos multidominio anudados, se realizaron ensayos de degradación in singulo en pinzas ópticas de alta resolución. Esta metodología permitió estudiar los eventos de desplegamiento y translocación separadamente. Resultados preliminares, muestran que el nudo no afecta la estabilidad mecánica de MJ0366, sino que afecta la eficiencia de translocación de MJ0366 y la capacidad de ClpXP para desplegar GFP. Estos resultados son la primera evidencia experimental de que las topologías anudadas pueden detener procesos asociados a la translocación y describen por primera vez, in vitro, la dinámica del movimiento de un nudo en una cadena polipeptídica / Proteins are the most complex polymers synthesized by the nature, they have to fold and adopt intricate three-dimensional structures to fulfill its functions. Even more, some proteins need to thread its main chain and form a knot to achieve its native state. How these knots (or knotted topologies) affect the properties and functions of proteins is a subject of great interest in biophysics. In the same way that a knot can give new functions or behaviors to a rope, knotted proteins could have unique properties, very different from unknotted ones. Molecular simulations have shown that randomly compacted protein polymers have a high probability to form knots. However, only 0.5% of the protein structures in the protein data bank present a knot in their structures, in consequence it has been proposed that knotted topologies have been negatively selected by evolution. The aim of this thesis is to determine if knotted topologies in proteins hinder biological processes associated with protein translocation. Translocation of proteins is a fundamental process for cell viability; it allows the correct localization of proteins in the cell and the control of protein levels through degradation. Molecular dynamics have shown that knots in proteins can obstruct narrow pores during translocation, but there is no experimental evidence yet. To test this hypothesis, we used the ClpXP ATP dependent protease of Escherichia coli to study the translocation of knotted proteins. To degrade its protein substrates, ClpXP needs to mechanically unfold them and translocate their polypeptide chain through its narrow pore. If knotted topologies can obstruct protein degradation, it could explain why there are so few knotted proteins. It was found that ClpXP easily degrade a knotted protein of Methanocaldococcus jannaschii, MJ0366, when a degradation tag is added to its C-Terminal end. However, when the green fluorescent protein (GFP), a normally degradable domain, is added to the N-Terminal end of MJ0366, ClpXP is unable to degrade this multidomain substrate releasing a partially degraded product with an intact GFP domain. The molecular weight of this partially degraded product suggests that the knot tightens against the folded domain of GFP, protecting it from degradation. However, when the distance between MJ0366 and GFP increased, by the insertion of an unfolded polypeptide, the degree of protection of GFP decrease dramatically. This results indicates two possible outcomes for multidomain knotted substrate degradation: i) the knot can slide and tighten against GFP, thus stopping degradation, or ii) the knot is translocated through ClpXP pore when the knot tightening occurs before reaching GFP, leading to complete substrate degradation. To study the mechanism of degradation of the knotted multidomain substrates in detail, in singulo degradation assays where performed in high resolution optical tweezers. This approach allowed the characterization of the impact of the knotted topologies in the unfolding and translocation steps. Preliminary results show that the knot does not affect the mechanically stability of MJ0366, but can generate pauses during translocation and even stalls ClpXP for minutes when trying to unfold GFP. These results are the first experimental evidence of knotted topologies impairing a biological process associated with translocation and describe, in vitro, the dynamic of knot movement on a polypeptide chain / Fondecyt 1151274; CONICYT

Magíster en ciencias biológicas mención biología celular / El primer movimiento morfogenético observado durante el desarrollo temprano del pez cebra es la epibolia. Durante este movimiento las blastómeras profundas emitirían protrusiones de manera polarizada hacia las capas más superficiales del blastodermo, interdigitándose entre células adyacentes. Este comportamiento es denominado intercalación radial, evidencia de este mecanismo proviene de estadios tardíos (80 % epibolia) sin embargo con evidencia proveniente de tinciones vitales se ha propuesto su existencia y se ha sugerido como un proceso con el cual se inicia la expansión del blastodermo. Durante estadios tempranos se han descrito moléculas de adhesión que estarían mediando este proceso. E-Cadherina participaría en el proceso de epibolia, sin embargo, el papel de N-Cadherina aún no es claro. Embriones de pez cebra mutantes para n-cadherina no presentan alteraciones aparentes durante la epibolia pero sí en estadios posteriores. Dicho mutante presenta alteraciones en la adhesión de células neuroepiteliales provocando problemas en el cierre del tubo neural. Embriones morfantes de n-cadherina demostraron el rol de esta molécula a nivel celular donde se observa una alteración de la polaridad, persistencia y número de protrusiones de células neuroepiteliales, lo que impide el correcto cierre del tubo neural, esto se traduce en defectos durante la intercalación medio lateral, fenómeno presente durante el cierre del tubo neural. Este trabajo describe un posible rol de N-Cadherina en la orientación del movimiento de intercalación radial, además de su participación en la regulación de la dinámica de las blastómeras profundas en etapas tempranas del desarrollo de pez cebra. / Epiboly is the first movement observed during the zebrafish development. During this process, deep cells exhibit polarize protrusions toward the superficial blastoderm layer, migrating through adjacent cells. This particular behavior has been called radial intercalation, the mechanism’s strongest evidence comes from late developmental stages (around 80% epiboly), nevertheless there are studies from vital staining that propose their existence and suggest it could be the first hallmark of development during the initial blastoderm expansion. In early stages of development it has been described that adhesion molecules mediate this process. E-Cadherin could be involved in epiboly, nevertheless NCadherin role is still unclear. n-cadherin mutant zebrafish embryo doesn’t exhibits apparent phenotype during epiboly, but they do in later stages. Those mutants show adhesion problems in neuroepithelial cells which induce problems during neural tube closure. n-cadherin morphants embryos exhibit problems with polarity, persistence and protrusion, demonstrating the molecule role at cellular level (neuroepithelial cells). These problems cause medio-lateral intercalation defects causing an aberrant neural tube closure. This thesis describes the that could have N-Cadherin in radial intercalation movement. Also, N-Cadherin could be related in the deep cell dynamics regulation in early stages of zebrafish development.

Grado de magíster en fisiología / En el músculo esquelético, la función más estudiada del receptor de dihidropiridina o canal de calcio tipo L (Cav1.1), además de su función como canal de Ca+2 tipo L, ha sido el acoplamiento excitación-contracción (ECC). En los últimos años, se ha descrito una nueva función para el Cav1.1, relacionando su actividad al acoplamiento excitación-transcripción (ETC). En el ETC, el Cav1.1 es clave y participa regulando la activación del canal de Panexina 1 (Panx1), el cual permite la salida de ATP desde el interior hacia el exterior de la célula. En fibras musculares, nuestro grupo ha descrito que este proceso de liberación de ATP por parte de Panx1 puede activarse mediante un estímulo eléctrico. Aún más importante, este es un proceso dependiente de la frecuencia de estimulación eléctrica y que, en conjunto a otros intermediarios, genera señales de Ca+2 intracelulares regulando la expresión génica asociada a la plasticidad muscular. El control que ejerce el Cav1.1 sobre la actividad del Panx1 luego de estímulos eléctricos a frecuencias permisivas, demuestra una influencia unidireccional desde Cav1.1 hacia Panx1. Por otro lado, estas proteínas se encuentran a menos de 40 nm de distancia y co-inmunoprecipitan. A pesar de estos hallazgos, la estrecha regulación funcional entre Cav1.1 y Panx1 permanece poco explorada. Se ha descrito que el Cav1.1 en su rol en el ECC, ejerce una regulación unidireccional o anterógrada, en la cual, frente a la depolarización de la membrana plasmática sufre un cambio conformacional que activa al Receptor de Rianodina tipo 1 (RyR1) permitiendo la salida de Ca+2 desde el retículo sarcoplasmático y la contracción muscular. Sin embargo, en las últimas décadas se ha mostrado que existe también una regulación retrógrada desde RyR1 hacia Cav1.1, en la cual el RyR1 puede influenciar las características biofísicas del Cav1.1, como ocurre en modelos de inhibición o ausencia de RyR1, donde se encuentran alteraciones en la corriente de Ca+2 tipo L y en el “movimiento de carga” del Cav1.1. En relación a estos antecedentes, nuestra hipótesis es que existe una regulación retrógrada de Panx1 hacia Cav1.1. En este trabajo, evaluamos la influencia de Panx1 en la función de Cav1.1. Para esto, desarrollamos un modelo de knockdown para Panx1, con la técnica del RNA interferente, mediante la electroporación de un plasmidio shPanx1 en el músculo Flexor Digitorum Brevis (FDB). Medimos la corriente de Ca+2 tipo L y el movimiento de carga en condiciones de “potencial de membrana controlado, en célula completa” (Whole cell Voltage-Clamp) en fibras musculares aisladas del FDB. Observamos una disminución significativa en la amplitud de la corriente de Ca+2 tipo L durante los pulsos de potencial a 0 mV (p=0,023) y 10 mV (p=0,018) en las células que expresaban el plasmidio shPanx1 versus el control. Para el movimiento de carga, observamos una diferencia significativa en el parámetro V0.5, una de las variables de la distribución de Boltzmann para 2 estados, que representa el potencial de membrana al cual se desplaza la mitad de la carga máxima, mostrando una disminución de este valor en las fibras shPanx1 vs el control (p=0,047). De esta manera, podemos concluir que Panx1 cumple un rol en la regulación de la función de Cav1.1 por lo que la interacción funcional entre estas dos proteínas es bidireccional al igual que en el caso de Cav1.1 y RyR1. Esta interacción debe tenerse en cuenta en el desarrollo de futuros tratamientos farmacológicos que tengan como blanco a Panx1 y para condiciones patológicas donde la función de Cav1.1 se encuentre afectada, como la distrofia muscular, así como en aquellos procesos donde la adaptación muscular juega un rol vital, como son el envejecimiento y la diabetes. / In skeletal muscle, the most studied function of dihydropyridine receptor or L-type calcium channel (Cav1.1), in addition to its function as L-type Ca+2 channel, has been the excitation-contraction coupling (ECC). In recent years it has been described a new role for Cav1.1, linking their activity to the excitation-transcription coupling (ETC). In ETC, Cav1.1 is a key participant regulating the Pannexin 1 (Panx1) activation. This channel allows the outflow of ATP in a process dependent on the frequency of electrical stimulation and differents intermediaries, generates intracellular Ca+2 signals regulating gene expression associated with muscle plasticity. However, the close functional regulation between Cav1.1 and Panx1 remains little explored. In addition to this, for Cav1.1 in ECC, initially a unidirectional or anterograde regulation was described, in which Cav1.1 after cellular membrane depolarization undergoes a conformational change that activates ryanodine receptor type 1 (RyR1) allowing the Ca+2 release and muscle contraction. However, in recent decades a retrograde regulation from RyR1 to Cav1.1 has been described, evidenced as a change in the electrophysiology properties of Cav1.1 during blocking or absence of RyR1, with alterations in the L-type Ca+2 current and "Charge Movement", representatives of Cav1.1 function. Our hypothesis is that there is a retrograde regulation from Panx1 to Cav1.1. We evaluated the influence of Panx1 in Cav1.1 function. For this, we decreased the expression of Panx1 by electroporation of a shPanx1 plasmid, encoding an interference RNA against Panx1 in Flexor Digitorum Brevis (FDB). Then we measured the L-type Ca+2 current and the Charge Movement by the "whole cell control voltage" experiment (Voltage-Clamp) in isolated FDB muscle fibers. We observed a significant decrease in L-type Ca+2 current amplitude during the command pulses at 0 mV (p = 0.02297) and 10 mV (p = 0.01778) in shPanx1 vs control (mCherry). In Charge Movement we showed a significant difference in V0.5, a variable in two-state Boltzmann distribution, which represents the voltage at which there is a half maximum charge (Qmax) displacement, with a decrease in shPanx1 V0.5 vs control (p = 0.047). We can conclude that Panx1 has a role in the function of Cav1.1, so they have a bidirectional-relationship, the same that occurs between Cav1.1 and RyR1.

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Resolvina D1 y Resolvina E1 inhiben la activación de AKT, ERK1/2 y NF-kB dependiente de LPS y previenen la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 en fibroblastos cardíacos Los fibroblastos cardiacos (FC) son células que tienen como función regular la matriz extracelular (MEC), pueden responder a estímulos endógenos o exógenos que alteren la homeostasis del sistema, y en caso de injuria, pueden proliferar y migrar hacia el sitio de daño. Uno de los agentes proinflamatorios más estudiados y utilizados es el lipopolisacárido (LPS) bacteriano, éste desencadena la respuesta inflamatoria activando las vías de señalización Akt, ERK1/2 y NF-κB, que conducen a la expresión de citoquinas proinflamatorias y factores de crecimiento los que, a su vez, aumentan la expresión de proteínas de adhesión como ICAM-1, VCAM-1, E-selectina, L-selectina, entre otras; permitiendo que células del sistema inmune viajen desde la circulación sanguínea hasta el sitio de injuria, para cicatrizar la herida. La inflamación puede ser terminada activamente por mediadores proresolutivos. Unos de estos mediadores son la Resolvina (Rv) D1 y E1. La RvD1 proviene del ácido docosahexaenoico y la RvE1 del ácido eicosapentaenoico. Estas se biosintetizan durante la inflamación y se les ha asociado propiedades antiinflamatorias, limitando la infiltración de neutrófilos, estimulando la fagocitosis de los macrófagos y reduciendo el nivel de dolor inflamatorio y fibrosis. Sin embargo, no existe evidencia de los efectos que podría tener en FC. El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de RvD1 y RvE1 en FC, para así estudiar las acciones que tendría en un contexto inflamatorio inducido por LPS, evaluando la actividad en las vías de señalización Akt, ERK1/2 y NF-κB y sobre la expresión de las proteínas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1. 12 Los resultados obtenidos muestran que RvD1 presenta una significativa disminución de la activación de Akt y ERK1/2, no así de NF-κB. RvE1 disminuye significativamente la activación de ERK1/2, sin embargo, no presenta cambios significativos respecto al control en la fosforilación de Akt y NF-κB. Además, se demostró que en FC estimulados con LPS y pretratados con RvD1, disminuyó la activación de las vías Akt, ERK1/2 y NF- κB respecto a LPS, y consecuentemente disminuyó la expresión de VCAM-1, pero no de ICAM-1. Por otro lado, RvE1 disminuyó significativamente la activación de Akt, no así la activación de ERK1/2 y NF-κB estimuladas por LPS. Además, disminuyó la expresión de ICAM-1 estimulado por LPS, pero no de VCAM-1. En conclusión, nuestros resultados sugieren que tanto RvD1 como RvE1 poseen propiedades resolutivas en un modelo de inflamación en FC, lo cual posibilitaría su uso como nuevas herramientas terapéuticas en enfermedades cardiacas / Resolvin D1 and Resolvin E1 inhibit AKT, ERK1/2 and NF-kB activation LPSdependent and prevent ICAM-1 and VCAM-1 expression in cardiac fibroblasts Cardiac fibroblasts (CF) are cells that regulate the extracellular matrix (ECM), they can respond to endogenous or exogenous stimuli that alter the homeostasis of the system, and in case of cardiac tissue injury, they can proliferate and migrate to the site of damage. One of the most studied and used proinflammatory agents is bacterial lipopolysaccharide (LPS), it triggers the inflammatory response activating the signaling pathways Akt, ERK1/2 and NF-κB, which lead to the expression of proinflammatory cytokines and growth factors that increase the expression of adhesion proteins such as ICAM-1, VCAM- 1. E-selectin, L-selectin, among others. These effects of LPS favor to the cells of the immune system extravasate to the site of injury to degrade the microorganism and heal the wound. Inflammation can be actively terminated by proresolving mediators, such as RvD1 and RvE1. RvD1 derived from docosahexaenoic acid and RvE1 from eicosapentaenoic acid. These are biosynthesized during inflammation and have been associated with anti- inflammatory properties, limiting the infiltration of neutrophils, stimulating the phagocytic activity of macrophages and reducing the level of inflammatory pain and fibrosis. However, there is no evidence respect of the effects it could have on FC. In this study, we investigated the role of RvD1 and RvE1 in FC, to study the actions that would have in an inflammatory context induced by LPS, evaluating the activity in the signaling pathways Akt, ERK1/2 and NF-κB and the expression of adhesion proteins ICAM-1 and VCAM-1. 14 The results show that RvD1 exert a significant decrease of Akt and ERK1/2 activity, but not NF-κB; RvE1 significantly decreases the activation of ERK1/2, however, it does not present significant effect in regard to the control in the phosphorylation of Akt and NF-κB. In addition, the pretreatment with RvD1, has decreased the activation of the Akt, ERK1/2 and NF-κB pathways respect to LPS, and consequently decreased the expression of VCAM-1, but not ICAM-1. On the other hand, RvE1 has significantly decreased the activation of Akt stimulated by LPS, but not of ERK1/2 nor NF-κB. Additionally, the expression of ICAM-1 stimulated by LPS has decreased, but not of VCAM-1. In conclusion, our results suggest that RvD1 and RvE1 have resolutive properties in an inflammatory model in CF, which would make possible its use as new therapeutic tool in cardiac diseases / Proyecto Fondecyt N° 1170425

Tesis para optar al grado de Doctor en Bioquímica / Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en todos los países desarrollados, incluyendo Chile. En los últimos años se ha sugerido que la pérdida de cardiomiocitos debido a muerte celular es un factor importante en el desarrollo de la insuficiencia cardiaca. Sin embargo, no existe claridad acerca del mecanismo por el cual se produce la muerte de los cardiomiocitos y de su desaparición del tejido cardiaco. En el corazón se produce estrés hiperosmótico durante eventos de isquemia/reperfusión cardiaca. Existe un pobre conocimiento acerca de las vías de señalización cardiaca que conllevan a la muerte celular como una consecuencia del estrés osmótico. Nosotros hemos demostrado que el estrés hiperosmótico (sorbitol 600 mOsm) induce una rápida apoptosis en cardiomiocitos en cultivo. El futuro desarrollo de esta área requiere la identificación de moléculas que protejan a los cardiomiocitos de la muerte celular. En este aspecto, el agente más promisorio corresponde al factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1). Algunas células poseen eficientes mecanismos reguladores involucrados en la mantención de la homeostasis, sin embargo el cardiomiocito es especialmente vulnerable a la apoptosis inducida por estrés hiperosmótico debido a que regula su volumen muy lentamente. Aunque existe cierta caracterización molecular de los eventos desencadenados en la apoptosis inducida por sorbitol, se desconoce la participación del Ca2+ y de factores transcripcionales en este proceso. El propósito de esta tesis fue estudiar los mecanismos de señalización que regulan la apoptosis del cardiomiocito inducida por estrés hiperosmótico. Con este objetivo, se estudió la actividad y regulación transduccional del factor transcripcional CREB en respuesta a IGF-1 y/o estrés hiperosmótico. CREB es un importante mediador de la sobrevida celular promovida por IGF-1 en otros tipos celulares. Por lo tanto se investigó la participación de CREB en la señalización antiapoptótica gatillada por IGF-1 en este modelo de estrés hiperosmótico. Además, se estudiaron los efectos del estrés hiperosmótico en cultivos primarios de cardiomiocitos, en términos de cambios en los niveles intracelulares de Ca2+ y en las actividades enzimáticas de la proteína kinasa dependiente de Ca2+/CaM (Calmodulina quinasa II, CaMKII) y la proteína fosfatasa Calcineurina (Cn). Los resultados presentados en este estudio demostraron que tanto el estrés hiperosmótico como IGF-1 conllevan a la activación de CREB, a través de su fosforilación, aunque probablemente por vías distintas. La activación de CREB por estrés hiperosmótico dependió de Ca2+ i y las vías MAPK, ya que BAPTA-AM e inhibidores de las vías p38-MAPK y ERK impidieron el aumento de su fosforilación. Por otro lado, la preincubación de cardiomiocitos con BAPTA-AM o inhibidores de las vías p38-MAPK, ERK, PI3-K, Cn and CaMKII disminuyeron significativamente la fosforilación de CREB inducida por IGF-1. El estrés hiperosmótico bloqueó la activación de CREB inducida por IGF-1, con un patrón de activación similar al de el estímulo apoptótico. Finalmente, los resultados indicaron que CREB participa en la señalización antiapoptótica del IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico, pero no en la respuesta de sobrevida celular frente al estímulo osmótico. El efecto protector de IGF-1 frente a estrés hiperosmótico fue bloqueado por la expresión de una forma inactiva de CREB, como se demuestra con la mayoría de los parámetros apoptóticos evaluados en este estudio; sin embargo, la apoptosis inducida con este modelo experimental no presentó cambios significativos tras la sobreexpresión de CREB inactivo. Los resultados, además, demostraron que el estrés hiperosmótico llevó a aumentos rápidos y transitorios de los niveles de Ca2+ i, como resultado tanto del influjo de este ión desde el medio extracelular como de su liberación desde depósitos intracelulares. Este aumento del Ca2+ i estuvo mediado al menos, por entrada de Ca2+ por canales de Ca2+ de tipo L y la liberación desde reservorios de Ca2+ activada por IP3. Los resultados también mostraron que la liberación de Ca2+ desde depósitos intracelulares inducida por el estrés hiperosmótico depende de la activación de Fosfolipasa C (PLC). El estrés hiperosmótico no produjo un aumento de las actividades enzimáticas CaMKII y Cn. El pretratamiento de los cardiomiocitos con KN62 (inhibidor de CaMKII) y CsA (inhibidor de Cn) no modificó significativamente la apoptosis inducida por estrés hiperosmótico, evaluada en términos de viabilidad celular, fragmentación del DNA, activación de caspasa-3 y -9 y externalización de fosfatidilserina. Estos resultados sugieren que dichas vías de señalización probablemente no estarían involucradas en la regulación de la apoptosis desencadenada por el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol. De este trabajo de tesis se puede concluir que: 1) CREB participaría en la señalización antiapoptótica del IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico, pero no en la muerte inducida por este tipo de estrés; 2) el estrés hiperosmótico produce un aumento de los niveles Ca2+ i como consecuencia del influjo de este ión desde el medio extracelular y de su liberación desde depósitos intracelulares; y finalmente, 3) CaMKII y Cn no participarían en la apoptosis inducida por el estímulo osmótico / Cardiovascular diseases are the leading cause of death in all developed countries, including Chile. In recent years, it has been suggested that loss of cardiomyocytes due to cell death is an important causative factor in the development of heart failure. However, the mechanism by which cardiomyocytes die and then disappear from the tissue is not clear. In the heart, osmotic stress occurs during myocardial ischemia/reperfusion. Cardiac signaling pathways leading to cell death as a consequence of osmotic stress remain poorly understood. We have shown that hyperosmotic stress (sorbitol 600 mOsm) rapidly induces apoptosis in cultured cardiomyocytes. Future development in this area will require the identification of molecules that protect cardiac cells from cell death. The most promising agent is insulin like growth factor-1 (IGF-1). Several cells display efficient regulatory mechanisms involved in maintaining homeostasis, however cardiomyocyte is especially vulnerable to hyperosmotic stress-induced apoptosis since its volume is regulated very slowly. Although there is some molecular characterization of the events engaged in estrés hiperosmótico-induced apoptosis, the involvement of Ca2+ and transcription factors remains unknown. The aim of this thesis was to study of the signaling mechanisms regulating hyperosmotic stress-induced apoptosis of cardiomyocyte. With that purpose, the activity and transductional regulation of transcriptional factor CREB in the response to IGF-1 and/or hyperosmotic stress were studied. Since CREB is an important mediator of IGF-1 promotion of cell survival in other cell types, the participation of CREB in the IGF-1-induced antiapoptotic signaling pathway during hyperosmotic stress was also investigated. In addition effects of sorbitolinduced hyperosmotic stress on primary cardiomyocyte cultures were studied, in terms of changes in Ca2+ intracellular levels, Ca2+/CaM-dependent protein kinase (Calmodulin kinase II, CaMKII) and the protein phosphatase Calcineurin (Cn) enzymatic activities. Data presented in this study showed that CREB activation (phosphorilation) was induced by both hyperosmotic stress and IGF-1, although most likely by different pathways. CREB activation by hyperosmotic stress depended on Ca2+ i and MAPK pathways since BAPTA-AM and p38-MAPK and ERK pathway inhibitors prevented its phosphorylation. In the other hand, pretreatment of cardiomyocytes with BAPTA-AM or p38-MAPK, ERK, PI3-K, Cn and CaMKII pathway inhibitors significantly decreased CREB phosphorylation induced by IGF-1. Hyperosmotic stress prevented CREB activation IGF-1-induced, maintaining the activation pattern of DNA affinity displayed after the apoptotic stimulus. Finally, the results indicated that CREB participates in the IGF-1 antiapoptotic signaling in cardiomyocytes treated with hyperosmotic stress, but not in the cell survival response. The protective effect of IGF-1 towards sorbitol was overridden by the overexpression of an inactive form of CREB, as shown by most of the apoptotic parameters evaluated in this study; however, stress-induced apoptosis with this experimental model remained unchanged by overexpression of inactive CREB. The results also showed that hyperosmotic stress led to fast and transient increases in intracellular Ca2+ levels, which were the result of both Ca2+ influx from the extracellular milieu and the release from intracellular stores. This Ca2+ i increase was mediated in part by Ca2+ inward by L-type Ca2+ channels and release from stores by IP3 receptors. Results also showed that hyperosmotic stress-induced Ca2+ release from intracellular stores was also dependent on PLC activation. Hyperosmotic stress did not induce CaMKII and Cn enzymatic activities. Pretreatment of cardiomyocytes with KN62 (CaMKII inhibitor) and CsA (Cn inhibitor) did not modified significantly hyperosmotic stress-induced apoptosis, evaluated in terms of cell viability, DNA fragmentation, caspases–3 and –9 activation and phosphatidylserine externalization. These results suggested that these two signaling pathways were not likely implicated in the regulation of apoptosis triggered by sorbitol-induced hyperosmotic stress. Conclusions drawn from this thesis work are: 1) CREB most likely is involved in IGF-1 antiapoptotic signal in cardiomyocytes subjected to hyperosmotic stress but not in this type of stress-induced cell death; 2) hyperosmotic stress leads to an increase in intracellular Ca2+ levels due to both influx from the extracellular milieu and release from intracellular stores; and finally, 3) CaMKII and Cn are not likely to be involved in this osmotic stimulus-induced apoptosis / FONDAP 15010006; FONDECYT 1010246; CONICYT

Magíster en ciencias biológicas y médicas mención biología celular / El síndrome de Sjögren (SS) es una exocrinopatía autoinmune crónica de etiología desconocida que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lacrimales. Los pacientes que padecen esta enfermedad manifiestan graves alteraciones, tanto en la calidad como, en la cantidad de saliva y lágrimas. Las GS de pacientes SS presentan cambios morfológicos y funcionales en el parénquima glandular y en la matriz extracelular correlacionado con alteraciones en la polaridad de la célula acinar. Las GS de pacientes SS también evidencian cambios en la expresión de proteínas que participan en el tráfico de gránulos de secreción hacia el polo apical de las células acinares. Las células acinares de GS de pacientes SS han mostrado cambios en la concentración de calcio en el lumen del retículo endoplásmico (RE), una disminución en la expresión de genes disulfuro isomerasa y un aumento de genes para enzimas que participan en la ubiquitinación. Además se han reportado alteraciones en la ruta secretora, cambios morfológicos y funcionales a nivel de RE, complejo de Golgi y gránulos de secreción. En conjunto, las evidencias mencionadas sugieren una pérdida de homeostasis glandular y una respuesta celular alterada frente a la alta demanda de síntesis proteica en las células acinares de GS de pacientes SS. La síntesis exacerbada de proteínas en el RE genera estrés en este organelo. En condiciones fisiológicas, células secretoras, tales como las células acinares pancreáticas, células acinares de GS y células plasmáticas, son susceptibles a experimentar un alto nivel de estrés de RE, como consecuencia de una alta demanda de síntesis para alcanzar un eficiente plegamiento de proteínas. Para contrarrestar este efecto se activa la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) la cual promueve la obtención de una conformación adecuada de las proteínas en el RE. Considerando la cronicidad de esta patología, una deficiente UPR en las células de GS de pacientes SS, podría explicar un estado de estrés de RE sostenido que podría desencadenar procesos relacionados con la autoinmunidad. Por otra parte, una menor expresión de XBP-1, como fue observado en un análisis de microarreglos de cDNA, podría asociarse con la hiposecreción de pacientes SS, ya que ha sido demostrado que XBP-1 contribuye con los cambios estructurales y funcionales que las células altamente secretoras requieren para la biosíntesis de proteínas. En la presente tesis, se formuló la hipótesis: “Componentes de la vía IRE1α/XBP-1 de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) se encuentran disminuidos en células acinares de glándulas salivales labiales (GSLs) de pacientes SS”. Para abordar los objetivos planteados, se utilizaron técnicas de biología celular y molecular para analizar marcadores de UPR. Particularmente se determinaron los niveles proteicos de IRE-1α, la expresión génica, proteica y localización celular de XBP-1 (XBP-1u y XBP-1s), de la proteína chaperona GRP78 (BiP) y de la disulfuro isomerasa PDIA3 (ERp57). Además se analizó la expresión de genes río abajo del factor transcripcional XBP-1s, como EDEM1, SEC61, ERdj4. Los resultados de esta tesis indican que hay una disminución significativa de la proteína IRE-1α, del factor transcripcional XBP-1s y de la chaperona BiP en GSLs de pacientes SS. Por otro lado, la proteína PDIA3 se encuentra aumentada significativamente, no así en sus niveles de mRNA. Respecto a la localización, las proteínas XBP-1 y BiP no presentan diferencias entre ambos grupos en estudio, pero sí una disminución en la intensidad inmunofluorescente en las GSLs de pacientes SS. Estos resultados, evidencian una alteración en el eje IRE-1α/XBP-1 de la UPR. Estos hallazgos sugieren que la homeostasis del RE de GSLs de pacientes SS se encuentra alterada, evidenciada por una disminución de la vía IRE-1α/XBP-1 y un aumento de PDIA3. Estos cambios, especialmente los bajos niveles de XBP-1s pueden explicar la hipofunción de GSLs de pacientes SS, sin embargo, la contribución de las otras vías de señalización de la UPR debe ser abordada para conocer la real contribución de la UPR en la homeostasis glandular y en la etiopatogenia del SS. / Sjögren's syndrome (SS) is an autoimmune chronic exocrinopathy of unknown etiology that mainly affects the lachrymal and salivary glands (SG). SS patients experience severe alterations both in quality and quantity of saliva and tears. SG of SS patients show morphological and functional changes in the parenchyma and in the extracellular matrix that correlate with alterations in the acinar cell polarity. SG of SS patients also show changes in the expression of proteins involved in trafficking of secretory granules into the apical pole of the acinar cells. Acinar cells of SG of SS patients showed changes in calcium concentration in the endoplasmic reticulum (ER) lumen, a decrease gene expression of disulfide isomerase and increase gene expression of enzymes involved in ubiquitination. In addition, changes in the secretory pathway as well as morphological and functional changes in ER, Golgi complex and secretory granules have been reported. Together, the above evidence suggest a loss of glandular homeostasis and altered cellular response to high demand of protein in acinar cells of SG from SS patients. Exacerbated proteins synthesis in the ER generates stress to this organelle. Under physiological conditions, secretory cells such as pancreatic acinar cells, acinar cells of SG and plasma cells, can experience a high ER stress level due to a high demand to achieve efficient protein folding. To counteract this effect, unfolded protein response (UPR) is activated leading to an adequate conformation of proteins in the ER. Considering that SS is a chronic condition, an impaired UPR in SG cells of SS patients might induce a sustained ER stress that, in turn, could trigger autoimmunity. Moreover, a reduced transcription of XBP-1, as observed by cDNA microarray analysis, may be associated to hyposecretion of SS patients. Indeed, it has been demonstrated that XBP-1 contributes to structural and functional changes that highly secreting cells need for protein biosynthesis. In this thesis, we hypothesized that "pathway components IRE1α/XBP-1 of unfolded protein response (UPR) are decreased in acinar cells of labial salivary glands (LSG) of SS patients". To address the objectives, cellular and molecular markers of UPR were evaluated. These included protein levels of IRE-1α as well as mRNA, protein and cellular localization of XBP-1 (XBP-1u and XBP-1s), GRP78 chaperone protein (BiP) and protein disulfide isomerase PDIA3 (ERp57). We also analyzed the expression of genes downstream of the transcription factor XBP-1s such as EDEM1, SEC61, ERdj4. The results indicated a significant decrease of IRE-1α protein, the transcription factor XBP-1s and chaperone BiP in LSGs of SS patients. Moreover, PDIA3 protein but nor its mRNA levels were significantly increased. Regarding location, no differences between the two study groups were observed for XBP-1 and BiP proteins, with a decrease in overall immunofluorescent intensity in SS patients. These results suggest an alteration in the UPR IRE-1α/XBP-1 axis. These findings suggest that RE homeostasis is impaired in LSGs from SS patients as evidenced by a decrease of the IRE-1α/XBP-1 pathway and an increased of PDIA3. These changes, especially low levels of XBP-1s can explain LSGs hypofunction of SS patients. Nonetheless the contribution of other signaling pathways of the UPR should be addressed to the total contribution of the UPR in glandular homeostasis in the pathogenesis of SS.