Magíster en ciencias biológicas, mención biología celular / El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune, sistémica y crónica que se caracteriza por la alteración funcional de las glándulas salivales (GS) y lacrimales, que conduce a signos y síntomas de sequedad bucal y ocular. Los acinos de las GS sintetizan y secretan los productos de la saliva. Las mucinas son glicoproteínas de alto peso molecular que mantienen la humectación de las mucosas por su capacidad de retener agua. Esta propiedad está dada por los grupos sulfatos y ácido siálico unidos covalentemente a los oligosacáridos asociados al núcleo proteico de las mucinas. En nuestro laboratorio se demostró recientemente que en las GS de pacientes SS, MUC5B, la mucina oligomérica más abundante de la saliva, se encuentra hiposulfatada, lo que provocaría una pérdida de avidez por el agua, contribuyendo a la sensación de boca seca que experimentan los pacientes. Un hecho relevante es que la reducción de sulfatación es equivalente, tanto en pacientes que tienen un flujo salival no estimulado normal, como en aquellos en que está disminuido. Así, el volumen de agua en la saliva no sería el único factor responsable de la sensación de boca seca, rompiendo un paradigma clásico en esta patología para explicar la sequedad oral en los pacientes con SS. Los factores involucrados en la sulfatación de las mucinas salivales son diversos. En esta tesis estudiamos los niveles de expresión y actividad de algunas glicosiltransferasas, con énfasis en las sulfotransferasas del complejo de Golgi. Estas enzimas transfieren grupos sulfatos desde un residuo sulfatado activo 3’-fosfoadenosin 5’-fosfosulfato (PAPS), que actúa como dador, a una posición definida de un oligosacárido aceptor. Postulamos que una disminución en los niveles de expresión y/o actividad de sulfotransferasas explicaría la hiposulfatación de MUC5B en las GS de pacientes SS. Para abordar ésta hipótesis se desarrollaron los siguientes objetivos específicos: 1) Determinar los niveles de mRNA de Gal3-O-sulfotransferasas (Gal3STs) 2, 3, 4 y de β3-Galactosiltransferasa 5 (β3GalT-5); 2) Determinar los niveles de proteínas de Gal3STs 2, 4 y de β3GalT-5; 3) Cuantificar la actividad enzimática de Gal3STs y sialiltransferasas y 4) Cuantificar la actividad enzimática de glicosiltransferasas involucradas en la síntesis y extensión de oligosacáridos asociados al núcleo proteico de las mucinas. Se estudiaron GS labiales de 31 pacientes con SS primario y 31 individuos controles. Los niveles relativos de mRNA se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real, mientras que los niveles relativos de proteínas se determinaron mediante western blot. Los niveles de actividad enzimática se determinaron mediante reacciones radiactivas in vitro, la cuantificación de la radiactividad se realizó luego de purificar los productos obtenidos mediante una doble separación cromatográfica. Nuestros resultados demuestran que en GS de pacientes SS, las glicosiltransferasas que sintetizan los oligosacáridos, sustratos de sulfotransferasas, presentan una actividad enzimática similar a los individuos controles. Al evaluar la actividad de sialiltransferasas tampoco encontramos cambios en GS de pacientes SS respecto a los controles. Sin embargo, la actividad enzimática de sulfotransferasas mostró una disminución significativa en GS de pacientes SS (p = 0,0004). Este cambio no presenta correlación con los niveles de expresión relativa de mRNA y proteínas de estas enzimas. Concluimos que la disminución de la actividad sulfotransferasa explicaría la hiposulfatación de mucinas observada en GS de pacientes SS. La implementación de futuras terapias que consideren la calidad de las mucinas salivales permitirá reducir la sensación de sequedad bucal y mejorar la calidad de vida de los pacientes con síndrome de Sjögren. / Sjögren syndrome (SS) is a systemic, chronic autoimmune disease characterized by functional alterations of lachrymal and salivary glands (SG) leading to eye and mouth dryness. GS acini synthesize saliva components including mucins. Mucins are high molecular weight glycoproteins essential to keep hydrated mucosa because of their ability to retain water. This property is due to sulfate and sialic acid groups covalently bonded to the protein backbone of mucins. Our group has recently demonstrated that MUC5B, the most abundant oligomeric mucin in saliva, is found hyposulfated in SG of SS-patients. Thus, dry mouth sensation in these patients could be partly due to a loss of water binding ability. Importantly, decreased sulfation is observed in patients showing either a normal or a decreased unstimulated salivary flow. Therefore, water content of saliva would not be the only factor responsible of dry mouth sensation, breaking a classical paradigm to explain this symptom in patients affected by SS. Diverse factors are involved in salivary mucins sulfation. In this thesis, the expression levels and activities of selected glycosyltransferases, particularly sulfotransferases associated to Golgi complex, were studied. These enzymes transfer sulfate groups from an active sulfated 3’-phosphoadenosin-5’-phosphosulphate (PAPS) donor to an acceptor oligosaccharide. We postulate that a decreased sulfotransferase expression and/or activity may account for MUC5B hyposulfation in GS from SS patients. To approach this hypothesis, the following specific aims were addressed: 1) To determine Gal3-O-sulfotransferases (Gal3STs) 2, 3, 4 and β3-galactosyltransferase 5 (β3GalT-5) mRNA levels; 2) To determine Gal3STs 2, 4 and β3GalT-5 protein levels; 3) To measure Gal3STs and sialyltransferase enzymatic activities and 4) To measure enzymatic activities of glycosyltransferases involved in synthesis and extension of oligosaccharides bonded to mucin proteins. SG from 31 SS-patients and 31 control subjects were studied. Relative mRNA levels were determined by real-time RT-PCR, while relative protein levels were measured by Western blot. Enzymatic activity was addressed by in vitro [35S]-based assays. Prior to radioactive counting, labeled products were purified by a two-step chromatographic procedure. Our results show that the activity of glycosyltransferases, enzymes that synthesize oligosaccharides which are sulfotransferase substrates, show similar levels in SG of controls and SS patients. The same trend was observed in sialyltransferase activity in both groups. However, enzymatic activity of sulfotransferases was significantly decreased in SS-patients (p = 0.0004). These findings are not correlated with relative mRNA and protein levels for these enzymes. We conclude that the decrease of sulfotransferase activity may explain the mucin hyposulfation observed in the SG of SS-patients. Future therapies aimed to address salivary mucin quality will potentially reduce oral dryness improving the life quality of SS patients. / 13/01/2013

Magíster en ciencias biológicas y médicas mención biología celular / El síndrome de Sjögren (SS) es una exocrinopatía autoinmune crónica de etiología desconocida que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lacrimales. Los pacientes que padecen esta enfermedad manifiestan graves alteraciones, tanto en la calidad como, en la cantidad de saliva y lágrimas. Las GS de pacientes SS presentan cambios morfológicos y funcionales en el parénquima glandular y en la matriz extracelular correlacionado con alteraciones en la polaridad de la célula acinar. Las GS de pacientes SS también evidencian cambios en la expresión de proteínas que participan en el tráfico de gránulos de secreción hacia el polo apical de las células acinares. Las células acinares de GS de pacientes SS han mostrado cambios en la concentración de calcio en el lumen del retículo endoplásmico (RE), una disminución en la expresión de genes disulfuro isomerasa y un aumento de genes para enzimas que participan en la ubiquitinación. Además se han reportado alteraciones en la ruta secretora, cambios morfológicos y funcionales a nivel de RE, complejo de Golgi y gránulos de secreción. En conjunto, las evidencias mencionadas sugieren una pérdida de homeostasis glandular y una respuesta celular alterada frente a la alta demanda de síntesis proteica en las células acinares de GS de pacientes SS. La síntesis exacerbada de proteínas en el RE genera estrés en este organelo. En condiciones fisiológicas, células secretoras, tales como las células acinares pancreáticas, células acinares de GS y células plasmáticas, son susceptibles a experimentar un alto nivel de estrés de RE, como consecuencia de una alta demanda de síntesis para alcanzar un eficiente plegamiento de proteínas. Para contrarrestar este efecto se activa la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) la cual promueve la obtención de una conformación adecuada de las proteínas en el RE. Considerando la cronicidad de esta patología, una deficiente UPR en las células de GS de pacientes SS, podría explicar un estado de estrés de RE sostenido que podría desencadenar procesos relacionados con la autoinmunidad. Por otra parte, una menor expresión de XBP-1, como fue observado en un análisis de microarreglos de cDNA, podría asociarse con la hiposecreción de pacientes SS, ya que ha sido demostrado que XBP-1 contribuye con los cambios estructurales y funcionales que las células altamente secretoras requieren para la biosíntesis de proteínas. En la presente tesis, se formuló la hipótesis: “Componentes de la vía IRE1α/XBP-1 de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) se encuentran disminuidos en células acinares de glándulas salivales labiales (GSLs) de pacientes SS”. Para abordar los objetivos planteados, se utilizaron técnicas de biología celular y molecular para analizar marcadores de UPR. Particularmente se determinaron los niveles proteicos de IRE-1α, la expresión génica, proteica y localización celular de XBP-1 (XBP-1u y XBP-1s), de la proteína chaperona GRP78 (BiP) y de la disulfuro isomerasa PDIA3 (ERp57). Además se analizó la expresión de genes río abajo del factor transcripcional XBP-1s, como EDEM1, SEC61, ERdj4. Los resultados de esta tesis indican que hay una disminución significativa de la proteína IRE-1α, del factor transcripcional XBP-1s y de la chaperona BiP en GSLs de pacientes SS. Por otro lado, la proteína PDIA3 se encuentra aumentada significativamente, no así en sus niveles de mRNA. Respecto a la localización, las proteínas XBP-1 y BiP no presentan diferencias entre ambos grupos en estudio, pero sí una disminución en la intensidad inmunofluorescente en las GSLs de pacientes SS. Estos resultados, evidencian una alteración en el eje IRE-1α/XBP-1 de la UPR. Estos hallazgos sugieren que la homeostasis del RE de GSLs de pacientes SS se encuentra alterada, evidenciada por una disminución de la vía IRE-1α/XBP-1 y un aumento de PDIA3. Estos cambios, especialmente los bajos niveles de XBP-1s pueden explicar la hipofunción de GSLs de pacientes SS, sin embargo, la contribución de las otras vías de señalización de la UPR debe ser abordada para conocer la real contribución de la UPR en la homeostasis glandular y en la etiopatogenia del SS. / Sjögren's syndrome (SS) is an autoimmune chronic exocrinopathy of unknown etiology that mainly affects the lachrymal and salivary glands (SG). SS patients experience severe alterations both in quality and quantity of saliva and tears. SG of SS patients show morphological and functional changes in the parenchyma and in the extracellular matrix that correlate with alterations in the acinar cell polarity. SG of SS patients also show changes in the expression of proteins involved in trafficking of secretory granules into the apical pole of the acinar cells. Acinar cells of SG of SS patients showed changes in calcium concentration in the endoplasmic reticulum (ER) lumen, a decrease gene expression of disulfide isomerase and increase gene expression of enzymes involved in ubiquitination. In addition, changes in the secretory pathway as well as morphological and functional changes in ER, Golgi complex and secretory granules have been reported. Together, the above evidence suggest a loss of glandular homeostasis and altered cellular response to high demand of protein in acinar cells of SG from SS patients. Exacerbated proteins synthesis in the ER generates stress to this organelle. Under physiological conditions, secretory cells such as pancreatic acinar cells, acinar cells of SG and plasma cells, can experience a high ER stress level due to a high demand to achieve efficient protein folding. To counteract this effect, unfolded protein response (UPR) is activated leading to an adequate conformation of proteins in the ER. Considering that SS is a chronic condition, an impaired UPR in SG cells of SS patients might induce a sustained ER stress that, in turn, could trigger autoimmunity. Moreover, a reduced transcription of XBP-1, as observed by cDNA microarray analysis, may be associated to hyposecretion of SS patients. Indeed, it has been demonstrated that XBP-1 contributes to structural and functional changes that highly secreting cells need for protein biosynthesis. In this thesis, we hypothesized that "pathway components IRE1α/XBP-1 of unfolded protein response (UPR) are decreased in acinar cells of labial salivary glands (LSG) of SS patients". To address the objectives, cellular and molecular markers of UPR were evaluated. These included protein levels of IRE-1α as well as mRNA, protein and cellular localization of XBP-1 (XBP-1u and XBP-1s), GRP78 chaperone protein (BiP) and protein disulfide isomerase PDIA3 (ERp57). We also analyzed the expression of genes downstream of the transcription factor XBP-1s such as EDEM1, SEC61, ERdj4. The results indicated a significant decrease of IRE-1α protein, the transcription factor XBP-1s and chaperone BiP in LSGs of SS patients. Moreover, PDIA3 protein but nor its mRNA levels were significantly increased. Regarding location, no differences between the two study groups were observed for XBP-1 and BiP proteins, with a decrease in overall immunofluorescent intensity in SS patients. These results suggest an alteration in the UPR IRE-1α/XBP-1 axis. These findings suggest that RE homeostasis is impaired in LSGs from SS patients as evidenced by a decrease of the IRE-1α/XBP-1 pathway and an increased of PDIA3. These changes, especially low levels of XBP-1s can explain LSGs hypofunction of SS patients. Nonetheless the contribution of other signaling pathways of the UPR should be addressed to the total contribution of the UPR in glandular homeostasis in the pathogenesis of SS.