A Mucopolissacaridose do tipo I é uma doença autossômica recessiva, causada por mutações na enzima α-L-iduronidase, a qual é responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos heparan sulfato e dermatan sulfato. Pacientes MPS I apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde a forma mais grave da doença (Síndrome de Hurler) até a forma mais branda (síndrome de Scheie). A gravidade da doença está intimamente relacionada a mutações na enzima α-L-iduronidase, as quais podem ter um impacto tanto na estabilidade quanto na atividade enzimática. O objetivo principal deste trabalho foi realizar a modelagem molecular da enzima α-L-iduronidase humana utilizando diferentes metodologias. A partir dessas modelagens realizamos comparações com a estrutura cristalografada dessa proteína (PDB ID: 4JXP - publicado após a obtenção dos modelos), com o intuito de detectar o método mais apropriado para modelagens que apresentam moldes de baixa identidade. Adicionalmente, avaliamos através da dinâmica molecular duas mutações - R89W e R89Q - que ocorrem no mesmo resíduo da IDUA e apresentam impactos diferenciados sobre a função da proteína. Dentre as técnicas de modelagem utilizadas nesse trabalho as que apresentaram os melhores desempenhos foram a modelagem mista (utilizando a ferramenta I-tasser) bem como a modelagem por homologia (através da ferramenta Modeller 9v9) utilizando um alinhamento baseado em reconhecimento de padrões de enovelamento. Em relação à validação dos modelos destacamos a importância da utilização de diferentes ferramentas de validação, bem como a inclusão da simulação de dinâmica molecular como passo final na avaliação dos modelos. Com relação aos dados de dinâmica molecular, a substituição de uma arginina (R) na posição 89 por um triptofano (W) apresentou um impacto maior no sítio ativo da IDUA do que a substituição por uma glutamina (Q). Esse impacto se refletiu tanto no número de ligações de hidrogênio realizadas pelo resíduo na posição 89 e nas distâncias dos dois glutamatos catalíticos (E182 e E299) quanto na desestruturação da hélice α6. A metodologia utilizada neste trabalho pode ser aplicada para a modelagem das outras 5 enzimas da via de degradação de glicosaminoglicanos (responsáveis pelas mucopolissacaridoses II, IIIA, IIIB, IIIC e IIID) que ainda não apresentam sua estrutura cristalografada. / The Mucopolysaccharidosis type I is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the alpha-L-iduronidase enzyme, which is responsible for degradation of heparan and dermatan sulfate glycosaminoglycans. MPS I patients have a wide spectrum of clinical manifestations ranging from the most severe (Hurler syndrome) to the mildest (Scheie syndrome) form of the disease. The severity of the disease is closely related to mutations in the α-L-iduronidase, which may have an impact both in stability and activity of the enzyme. The main objective of this work was to perform a molecular modeling of the human α-L-iduronidase enzyme through different methodologies. From these, we compare the models with the crystal structure of IDUA (PDB ID: 4JXP - released after the models construction), in order to detect the most suitable method for modeling presenting templates with low identity (below 25%). In addition, molecular dynamics was applied to evaluate two mutations - R89W and R89Q - which occur at the same residue and have different impacts on IDUA protein function. Among the modeling techniques used in this work, the threading approach (using the I-Tasser) as well the homology modeling (through the Modeller 9v9) using a folding pattern recognition-based alignment showed the best performances. Regarding the models validation, we highlight the importance of different tools as well the inclusion of molecular dynamics simulation as the final step in the evaluation of the models. The molecular dynamics results demonstrated that the substitution of an arginine (R) at position 89 by a tryptophane (W) had a greater impact on the IDUA active site structure than a replacement for a glutamine (Q). This is reflected both in the number of hydrogen bonds made by the residue 89 and the distances between the two catalytic glutamates (E299 and e182), but also by the disruption of helix α6. The methodology applied in this work can be used to model other enzymes involved in the pathway of glycosaminoglycans degradation (responsible for mucopolysaccharidosis II, IIIA, IIIB, IIIC and IIID) that have not yet crystal structures available.

A Mucopolissacaridose do tipo I é uma doença autossômica recessiva, causada por mutações na enzima α-L-iduronidase, a qual é responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos heparan sulfato e dermatan sulfato. Pacientes MPS I apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde a forma mais grave da doença (Síndrome de Hurler) até a forma mais branda (síndrome de Scheie). A gravidade da doença está intimamente relacionada a mutações na enzima α-L-iduronidase, as quais podem ter um impacto tanto na estabilidade quanto na atividade enzimática. O objetivo principal deste trabalho foi realizar a modelagem molecular da enzima α-L-iduronidase humana utilizando diferentes metodologias. A partir dessas modelagens realizamos comparações com a estrutura cristalografada dessa proteína (PDB ID: 4JXP - publicado após a obtenção dos modelos), com o intuito de detectar o método mais apropriado para modelagens que apresentam moldes de baixa identidade. Adicionalmente, avaliamos através da dinâmica molecular duas mutações - R89W e R89Q - que ocorrem no mesmo resíduo da IDUA e apresentam impactos diferenciados sobre a função da proteína. Dentre as técnicas de modelagem utilizadas nesse trabalho as que apresentaram os melhores desempenhos foram a modelagem mista (utilizando a ferramenta I-tasser) bem como a modelagem por homologia (através da ferramenta Modeller 9v9) utilizando um alinhamento baseado em reconhecimento de padrões de enovelamento. Em relação à validação dos modelos destacamos a importância da utilização de diferentes ferramentas de validação, bem como a inclusão da simulação de dinâmica molecular como passo final na avaliação dos modelos. Com relação aos dados de dinâmica molecular, a substituição de uma arginina (R) na posição 89 por um triptofano (W) apresentou um impacto maior no sítio ativo da IDUA do que a substituição por uma glutamina (Q). Esse impacto se refletiu tanto no número de ligações de hidrogênio realizadas pelo resíduo na posição 89 e nas distâncias dos dois glutamatos catalíticos (E182 e E299) quanto na desestruturação da hélice α6. A metodologia utilizada neste trabalho pode ser aplicada para a modelagem das outras 5 enzimas da via de degradação de glicosaminoglicanos (responsáveis pelas mucopolissacaridoses II, IIIA, IIIB, IIIC e IIID) que ainda não apresentam sua estrutura cristalografada. / The Mucopolysaccharidosis type I is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the alpha-L-iduronidase enzyme, which is responsible for degradation of heparan and dermatan sulfate glycosaminoglycans. MPS I patients have a wide spectrum of clinical manifestations ranging from the most severe (Hurler syndrome) to the mildest (Scheie syndrome) form of the disease. The severity of the disease is closely related to mutations in the α-L-iduronidase, which may have an impact both in stability and activity of the enzyme. The main objective of this work was to perform a molecular modeling of the human α-L-iduronidase enzyme through different methodologies. From these, we compare the models with the crystal structure of IDUA (PDB ID: 4JXP - released after the models construction), in order to detect the most suitable method for modeling presenting templates with low identity (below 25%). In addition, molecular dynamics was applied to evaluate two mutations - R89W and R89Q - which occur at the same residue and have different impacts on IDUA protein function. Among the modeling techniques used in this work, the threading approach (using the I-Tasser) as well the homology modeling (through the Modeller 9v9) using a folding pattern recognition-based alignment showed the best performances. Regarding the models validation, we highlight the importance of different tools as well the inclusion of molecular dynamics simulation as the final step in the evaluation of the models. The molecular dynamics results demonstrated that the substitution of an arginine (R) at position 89 by a tryptophane (W) had a greater impact on the IDUA active site structure than a replacement for a glutamine (Q). This is reflected both in the number of hydrogen bonds made by the residue 89 and the distances between the two catalytic glutamates (E299 and e182), but also by the disruption of helix α6. The methodology applied in this work can be used to model other enzymes involved in the pathway of glycosaminoglycans degradation (responsible for mucopolysaccharidosis II, IIIA, IIIB, IIIC and IIID) that have not yet crystal structures available.

A Mucopolissacaridose do tipo I é uma doença autossômica recessiva, causada por mutações na enzima α-L-iduronidase, a qual é responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos heparan sulfato e dermatan sulfato. Pacientes MPS I apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde a forma mais grave da doença (Síndrome de Hurler) até a forma mais branda (síndrome de Scheie). A gravidade da doença está intimamente relacionada a mutações na enzima α-L-iduronidase, as quais podem ter um impacto tanto na estabilidade quanto na atividade enzimática. O objetivo principal deste trabalho foi realizar a modelagem molecular da enzima α-L-iduronidase humana utilizando diferentes metodologias. A partir dessas modelagens realizamos comparações com a estrutura cristalografada dessa proteína (PDB ID: 4JXP - publicado após a obtenção dos modelos), com o intuito de detectar o método mais apropriado para modelagens que apresentam moldes de baixa identidade. Adicionalmente, avaliamos através da dinâmica molecular duas mutações - R89W e R89Q - que ocorrem no mesmo resíduo da IDUA e apresentam impactos diferenciados sobre a função da proteína. Dentre as técnicas de modelagem utilizadas nesse trabalho as que apresentaram os melhores desempenhos foram a modelagem mista (utilizando a ferramenta I-tasser) bem como a modelagem por homologia (através da ferramenta Modeller 9v9) utilizando um alinhamento baseado em reconhecimento de padrões de enovelamento. Em relação à validação dos modelos destacamos a importância da utilização de diferentes ferramentas de validação, bem como a inclusão da simulação de dinâmica molecular como passo final na avaliação dos modelos. Com relação aos dados de dinâmica molecular, a substituição de uma arginina (R) na posição 89 por um triptofano (W) apresentou um impacto maior no sítio ativo da IDUA do que a substituição por uma glutamina (Q). Esse impacto se refletiu tanto no número de ligações de hidrogênio realizadas pelo resíduo na posição 89 e nas distâncias dos dois glutamatos catalíticos (E182 e E299) quanto na desestruturação da hélice α6. A metodologia utilizada neste trabalho pode ser aplicada para a modelagem das outras 5 enzimas da via de degradação de glicosaminoglicanos (responsáveis pelas mucopolissacaridoses II, IIIA, IIIB, IIIC e IIID) que ainda não apresentam sua estrutura cristalografada. / The Mucopolysaccharidosis type I is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the alpha-L-iduronidase enzyme, which is responsible for degradation of heparan and dermatan sulfate glycosaminoglycans. MPS I patients have a wide spectrum of clinical manifestations ranging from the most severe (Hurler syndrome) to the mildest (Scheie syndrome) form of the disease. The severity of the disease is closely related to mutations in the α-L-iduronidase, which may have an impact both in stability and activity of the enzyme. The main objective of this work was to perform a molecular modeling of the human α-L-iduronidase enzyme through different methodologies. From these, we compare the models with the crystal structure of IDUA (PDB ID: 4JXP - released after the models construction), in order to detect the most suitable method for modeling presenting templates with low identity (below 25%). In addition, molecular dynamics was applied to evaluate two mutations - R89W and R89Q - which occur at the same residue and have different impacts on IDUA protein function. Among the modeling techniques used in this work, the threading approach (using the I-Tasser) as well the homology modeling (through the Modeller 9v9) using a folding pattern recognition-based alignment showed the best performances. Regarding the models validation, we highlight the importance of different tools as well the inclusion of molecular dynamics simulation as the final step in the evaluation of the models. The molecular dynamics results demonstrated that the substitution of an arginine (R) at position 89 by a tryptophane (W) had a greater impact on the IDUA active site structure than a replacement for a glutamine (Q). This is reflected both in the number of hydrogen bonds made by the residue 89 and the distances between the two catalytic glutamates (E299 and e182), but also by the disruption of helix α6. The methodology applied in this work can be used to model other enzymes involved in the pathway of glycosaminoglycans degradation (responsible for mucopolysaccharidosis II, IIIA, IIIB, IIIC and IIID) that have not yet crystal structures available.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I. / Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I. / Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I. / Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.

Introdução: A mucopolissacaridose tipo I é comumente classificada em três síndromes clínicas (Hurler, Hurler-Scheie e Scheie), de acordo com a gravidade do fenótipo. Devido à alta heterogeneidade da doença e à sobreposição de sintomas em pacientes, alguns autores consideram esta forma de classificação ultrapassada e defendem que a doença apresenta um espectro fenotípico mais amplo. Para tanto, seria muito útil o desenvolvimento de novas ferramentas que possam contribuir para uma melhor classificação dos pacientes. Objetivo: Avaliar um novo instrumento para a classificação fenotípica da MPS I e verificar a correlação dos resultados obtidos com o mesmo com as características bioquímicas e moleculares dos pacientes avaliados. Materiais e Método: Um instrumento elaborado por um grupo de especialistas foi por nós adaptado para avaliar a gravidade do fenótipo ao diagnóstico de 43 pacientes brasileiros com MPS I. Uma nota de zero a 14 foi obtida com a aplicação deste instrumento pela avaliação da presença ou ausência dos seguintes sinais e sintomas ao diagnóstico: atraso no desenvolvimento neuropsicomotor e/ou declínio cognitivo, rigidez articular/artropatia/contraturas articulares, cifose, disostose multiplex, macrocefalia e bossa frontal. Os pacientes incluídos foram também avaliados em relação aos mesmos parâmetros do instrumento e quanto ao seu fenótipo por três geneticistas com reconhecida experiência com essa doença. Dados bioquímicos e moleculares também foram utilizados para comparação com os resultados da aplicação do instrumento. Resultados: Os pontos de corte com melhor balanço de sensibilidade e especificidade encontrados a partir da aplicação do instrumento e a partir da avaliação dos geneticistas foram, respectivamente 7 e 9. Os parâmetros do instrumento para os quais foi observada diferença estatisticamente significativa foram atraso do desenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo (entre o fenótipo Hurler e os fenótipos Hurler-Scheie e Scheie) e disostose múltipla (entre os fenótipos Hurler e Scheie). Não foi observada correlação entre a nota obtida no instrumento e os valores de GAGs urinários, nos diferentes fenótipos. A maior parte dos pacientes com mutações sem sentido foi classificada como grave, tanto a partir do instrumento quanto pela avaliação dos geneticistas. Conclusões: Os pontos de corte encontrados podem ser úteis para a classificação dos pacientes em dois grupos distintos – grave e atenuado. O atraso no dsenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo e a disostose múltipla são achados importantes para predizer a gravidade da doença. Mutações sem sentido parecem determinar o fenótipo mais grave da síndrome. Não foi possível distinguir os diferentes fenótipos a partir dos valores de GAGs na urina. A ferramenta desenvolvida parece ser útil para auxiliar na classificação da gravidade da MPS I, mas é recomendável sua aplicação em um número maior de pacientes para melhor dimensionar sua potencial aplicação. / Introduction: Mucopolysaccharidosis type I is usually classified into three clinical syndromes (Hurler, Hurler-Scheie and Scheie) according to the severity of the phenotypic expression. Some authors believe this classification is not accurate because of disease variation and overlapping findings in some patients, and suggest that its phenotypic spectrum is wider. With this view, it would be useful the development of new tools which could contribute to a better classification of patients. Objective: To evaluate a new tool the phenotypic classification of MPS I and investigate whether the results obtained are correlated with biochemical and molecular characteristics of the patients. Material and methods: A tool developed by a group of specialists was adapted by us for the evaluation of the phenotypic severity at diagnosis in 43 Brazilian patients with MPS I. A score of zero to 14 was obtained using this tool, which evaluated presence or absence of the following signs and symptoms: delay in neurological and psychomotor development and cognitive decline; joint stiffness, arthropathy and joint contractures; kyphosis; dysostosis multiplex; macrocephaly; and frontal bossing. The same patients had the same parameters evaluated by three MDs with expertise in MPS who also provided their impression about the phenotype. Biochemical and molecular findings were also compared with the results obtained in the proposed tool. Results: The cut-off points with better balance of sensitivity and specificity found with the use of the tool and according to the experts' evaluations were 7 and 9, respectively. The tool parameters with statistically significant differences were neurological and psychomotor development delay and cognitive decline (when the Hurler phenotype was compared with the Hurler-Scheie and Scheie phenotypes), and dysostosis multiplex (for the comparison between the Hurler and Scheie phenotypes). There was no correlation between the scores obtained when using the tool and the urinary GAG values across the different phenotypes. Most patients with nonsense mutations were classified as severe according to the tool scores and to the experts’ evaluations. Conclusions: The cut-off points found in this study may be useful for the classification of patients into two distinct groups - severe and attenuated. Neurological and psychomotor developmental delay and cognitive decline, as well as dysostosis multiplex, are important findings to predict disease severity. Nonsense mutations seem to determine the most severe syndrome phenotype. The urinary GAG values do not allow differentiating the different phenotypes. The tool developed seems to be useful to help in the classification of the severity of MPS I, but it would be advisable its application in a larger number of patients to better evaluate its potential application.

Introdução: A mucopolissacaridose tipo I é comumente classificada em três síndromes clínicas (Hurler, Hurler-Scheie e Scheie), de acordo com a gravidade do fenótipo. Devido à alta heterogeneidade da doença e à sobreposição de sintomas em pacientes, alguns autores consideram esta forma de classificação ultrapassada e defendem que a doença apresenta um espectro fenotípico mais amplo. Para tanto, seria muito útil o desenvolvimento de novas ferramentas que possam contribuir para uma melhor classificação dos pacientes. Objetivo: Avaliar um novo instrumento para a classificação fenotípica da MPS I e verificar a correlação dos resultados obtidos com o mesmo com as características bioquímicas e moleculares dos pacientes avaliados. Materiais e Método: Um instrumento elaborado por um grupo de especialistas foi por nós adaptado para avaliar a gravidade do fenótipo ao diagnóstico de 43 pacientes brasileiros com MPS I. Uma nota de zero a 14 foi obtida com a aplicação deste instrumento pela avaliação da presença ou ausência dos seguintes sinais e sintomas ao diagnóstico: atraso no desenvolvimento neuropsicomotor e/ou declínio cognitivo, rigidez articular/artropatia/contraturas articulares, cifose, disostose multiplex, macrocefalia e bossa frontal. Os pacientes incluídos foram também avaliados em relação aos mesmos parâmetros do instrumento e quanto ao seu fenótipo por três geneticistas com reconhecida experiência com essa doença. Dados bioquímicos e moleculares também foram utilizados para comparação com os resultados da aplicação do instrumento. Resultados: Os pontos de corte com melhor balanço de sensibilidade e especificidade encontrados a partir da aplicação do instrumento e a partir da avaliação dos geneticistas foram, respectivamente 7 e 9. Os parâmetros do instrumento para os quais foi observada diferença estatisticamente significativa foram atraso do desenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo (entre o fenótipo Hurler e os fenótipos Hurler-Scheie e Scheie) e disostose múltipla (entre os fenótipos Hurler e Scheie). Não foi observada correlação entre a nota obtida no instrumento e os valores de GAGs urinários, nos diferentes fenótipos. A maior parte dos pacientes com mutações sem sentido foi classificada como grave, tanto a partir do instrumento quanto pela avaliação dos geneticistas. Conclusões: Os pontos de corte encontrados podem ser úteis para a classificação dos pacientes em dois grupos distintos – grave e atenuado. O atraso no dsenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo e a disostose múltipla são achados importantes para predizer a gravidade da doença. Mutações sem sentido parecem determinar o fenótipo mais grave da síndrome. Não foi possível distinguir os diferentes fenótipos a partir dos valores de GAGs na urina. A ferramenta desenvolvida parece ser útil para auxiliar na classificação da gravidade da MPS I, mas é recomendável sua aplicação em um número maior de pacientes para melhor dimensionar sua potencial aplicação. / Introduction: Mucopolysaccharidosis type I is usually classified into three clinical syndromes (Hurler, Hurler-Scheie and Scheie) according to the severity of the phenotypic expression. Some authors believe this classification is not accurate because of disease variation and overlapping findings in some patients, and suggest that its phenotypic spectrum is wider. With this view, it would be useful the development of new tools which could contribute to a better classification of patients. Objective: To evaluate a new tool the phenotypic classification of MPS I and investigate whether the results obtained are correlated with biochemical and molecular characteristics of the patients. Material and methods: A tool developed by a group of specialists was adapted by us for the evaluation of the phenotypic severity at diagnosis in 43 Brazilian patients with MPS I. A score of zero to 14 was obtained using this tool, which evaluated presence or absence of the following signs and symptoms: delay in neurological and psychomotor development and cognitive decline; joint stiffness, arthropathy and joint contractures; kyphosis; dysostosis multiplex; macrocephaly; and frontal bossing. The same patients had the same parameters evaluated by three MDs with expertise in MPS who also provided their impression about the phenotype. Biochemical and molecular findings were also compared with the results obtained in the proposed tool. Results: The cut-off points with better balance of sensitivity and specificity found with the use of the tool and according to the experts' evaluations were 7 and 9, respectively. The tool parameters with statistically significant differences were neurological and psychomotor development delay and cognitive decline (when the Hurler phenotype was compared with the Hurler-Scheie and Scheie phenotypes), and dysostosis multiplex (for the comparison between the Hurler and Scheie phenotypes). There was no correlation between the scores obtained when using the tool and the urinary GAG values across the different phenotypes. Most patients with nonsense mutations were classified as severe according to the tool scores and to the experts’ evaluations. Conclusions: The cut-off points found in this study may be useful for the classification of patients into two distinct groups - severe and attenuated. Neurological and psychomotor developmental delay and cognitive decline, as well as dysostosis multiplex, are important findings to predict disease severity. Nonsense mutations seem to determine the most severe syndrome phenotype. The urinary GAG values do not allow differentiating the different phenotypes. The tool developed seems to be useful to help in the classification of the severity of MPS I, but it would be advisable its application in a larger number of patients to better evaluate its potential application.

Introdução: A mucopolissacaridose tipo I é comumente classificada em três síndromes clínicas (Hurler, Hurler-Scheie e Scheie), de acordo com a gravidade do fenótipo. Devido à alta heterogeneidade da doença e à sobreposição de sintomas em pacientes, alguns autores consideram esta forma de classificação ultrapassada e defendem que a doença apresenta um espectro fenotípico mais amplo. Para tanto, seria muito útil o desenvolvimento de novas ferramentas que possam contribuir para uma melhor classificação dos pacientes. Objetivo: Avaliar um novo instrumento para a classificação fenotípica da MPS I e verificar a correlação dos resultados obtidos com o mesmo com as características bioquímicas e moleculares dos pacientes avaliados. Materiais e Método: Um instrumento elaborado por um grupo de especialistas foi por nós adaptado para avaliar a gravidade do fenótipo ao diagnóstico de 43 pacientes brasileiros com MPS I. Uma nota de zero a 14 foi obtida com a aplicação deste instrumento pela avaliação da presença ou ausência dos seguintes sinais e sintomas ao diagnóstico: atraso no desenvolvimento neuropsicomotor e/ou declínio cognitivo, rigidez articular/artropatia/contraturas articulares, cifose, disostose multiplex, macrocefalia e bossa frontal. Os pacientes incluídos foram também avaliados em relação aos mesmos parâmetros do instrumento e quanto ao seu fenótipo por três geneticistas com reconhecida experiência com essa doença. Dados bioquímicos e moleculares também foram utilizados para comparação com os resultados da aplicação do instrumento. Resultados: Os pontos de corte com melhor balanço de sensibilidade e especificidade encontrados a partir da aplicação do instrumento e a partir da avaliação dos geneticistas foram, respectivamente 7 e 9. Os parâmetros do instrumento para os quais foi observada diferença estatisticamente significativa foram atraso do desenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo (entre o fenótipo Hurler e os fenótipos Hurler-Scheie e Scheie) e disostose múltipla (entre os fenótipos Hurler e Scheie). Não foi observada correlação entre a nota obtida no instrumento e os valores de GAGs urinários, nos diferentes fenótipos. A maior parte dos pacientes com mutações sem sentido foi classificada como grave, tanto a partir do instrumento quanto pela avaliação dos geneticistas. Conclusões: Os pontos de corte encontrados podem ser úteis para a classificação dos pacientes em dois grupos distintos – grave e atenuado. O atraso no dsenvolvimento neuropsicomotor/declínio cognitivo e a disostose múltipla são achados importantes para predizer a gravidade da doença. Mutações sem sentido parecem determinar o fenótipo mais grave da síndrome. Não foi possível distinguir os diferentes fenótipos a partir dos valores de GAGs na urina. A ferramenta desenvolvida parece ser útil para auxiliar na classificação da gravidade da MPS I, mas é recomendável sua aplicação em um número maior de pacientes para melhor dimensionar sua potencial aplicação. / Introduction: Mucopolysaccharidosis type I is usually classified into three clinical syndromes (Hurler, Hurler-Scheie and Scheie) according to the severity of the phenotypic expression. Some authors believe this classification is not accurate because of disease variation and overlapping findings in some patients, and suggest that its phenotypic spectrum is wider. With this view, it would be useful the development of new tools which could contribute to a better classification of patients. Objective: To evaluate a new tool the phenotypic classification of MPS I and investigate whether the results obtained are correlated with biochemical and molecular characteristics of the patients. Material and methods: A tool developed by a group of specialists was adapted by us for the evaluation of the phenotypic severity at diagnosis in 43 Brazilian patients with MPS I. A score of zero to 14 was obtained using this tool, which evaluated presence or absence of the following signs and symptoms: delay in neurological and psychomotor development and cognitive decline; joint stiffness, arthropathy and joint contractures; kyphosis; dysostosis multiplex; macrocephaly; and frontal bossing. The same patients had the same parameters evaluated by three MDs with expertise in MPS who also provided their impression about the phenotype. Biochemical and molecular findings were also compared with the results obtained in the proposed tool. Results: The cut-off points with better balance of sensitivity and specificity found with the use of the tool and according to the experts' evaluations were 7 and 9, respectively. The tool parameters with statistically significant differences were neurological and psychomotor development delay and cognitive decline (when the Hurler phenotype was compared with the Hurler-Scheie and Scheie phenotypes), and dysostosis multiplex (for the comparison between the Hurler and Scheie phenotypes). There was no correlation between the scores obtained when using the tool and the urinary GAG values across the different phenotypes. Most patients with nonsense mutations were classified as severe according to the tool scores and to the experts’ evaluations. Conclusions: The cut-off points found in this study may be useful for the classification of patients into two distinct groups - severe and attenuated. Neurological and psychomotor developmental delay and cognitive decline, as well as dysostosis multiplex, are important findings to predict disease severity. Nonsense mutations seem to determine the most severe syndrome phenotype. The urinary GAG values do not allow differentiating the different phenotypes. The tool developed seems to be useful to help in the classification of the severity of MPS I, but it would be advisable its application in a larger number of patients to better evaluate its potential application.

A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência da α-Liduronidase (IDUA), uma hidrolase lisosomal responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos (GAG) heparan e dermatan sulfato. Diversos processos bioquímicos e fisiológicos são afetados pelo acúmulo desses substratos nas células, levando a uma condição patológica multisistêmica. Apesar dos benefícios clínicos obtidos com os tratamentos atualmente disponíveis, várias limitações têm sido relatadas, sendo necessária a busca de novas estratégias terapêuticas. Uma abordagem promissora de terapia gênica/celular para o tratamento da MPS I é a microencapsulação de células geneticamente modificadas. Neste trabalho, produzimos microcápsulas com células recombinantes superexpressando IDUA, as quais foram implantadas em camundongos MPS I a fim de avaliar sua eficiência como uma terapia. No primeiro estudo, as cápsulas foram implantadas no tecido subcutâneo para um tratamento de 120 dias. A atividade de IDUA no soro teve um leve aumento nos primeiros 45 dias. Depois de 120 dias, a atividade de IDUA foi detectada no fígado, rim e coração. A dosagem bioquímica do acúmulo de GAG nos tecidos mostrou níveis reduzidos no rim. A análise histológica confirmou esses resultados e, de modo interessante, mostrou uma reorganização no parênquima hepático com menos células vacuolizadas. Além disso, as microcápsulas foram recuperadas para análise histológica e foi observada a presença de células inflamatórias e uma camada fibrótica em torno das cápsulas. O segundo estudo foi um tratamento de 60 dias com as microcápsulas implantadas no epíplon. Os níveis de IDUA no soro foram transitórios durante o tratamento e 60 dias depois da implantação a atividade enzimática foi detectada apenas no coração. A avaliação do acúmulo de GAG não apresentou diferenças entre os camundongos MPS I tratados e não tratados. Em ambos os estudos, alguns animais foram utilizados para um experimento em curto prazo e um aumento nos níveis de IDUA foi observado nos tecidos 24 horas após a implantação das cápsulas. Concluindo, as células microencapsuladas foram capazes de corrigir alguns aspectos da doença. No entanto, fatores como uma resposta imune contra a enzima e ao biomaterial, ou a dose de células nas cápsulas, podem ter prejudicado a eficiência do tratamento, sugerindo que modificações na técnica são necessárias para obter um melhor desempenho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of α-Liduronidase (IDUA), a lysosomal hydrolase responsible for the degradation of the glycosaminoglycans (GAG) heparan and dermatan sulfate. The consequent accumulation of these substrates throughout the cells affects several biochemical and physiological processes, leading to multisystemic pathological condition. Although the clinical benefits of the treatments currently available, several limitations have been noted and the search for alternative therapeutic strategies are necessary. A promising gene/cell therapy approach for treating MPS I is the microencapsulation of genetically modified cells. In this work, we produced microcapsules containing recombinant cells overexpressing IDUA, which were implanted in MPS I mice in order to evaluate their efficiency as a treatment. In the first study, capsules were implanted in the subcutaneous tissue for a 120-days treatment. Serum IDUA activity was slightly increased in the first 45 days. After 120 days, IDUA activity was detected in the liver, kidney and heart. The biochemical measurement of GAG accumulation in the tissues revealed decreased levels in the kidney. The histological analysis confirmed these results and, interestingly, showed a reorganization of the hepatic parenchyma with less cell vacuolization. In addition, microcapsules were retrieved for histological analysis and it was observed the presence of inflammatory cells and a fibrotic layer around the capsules. The second study was a 60- day treatment with the microcapsules implanted in the omentum. Serum IDUA levels were transient over treatment and 60 days post-implantation the enzyme activity was detected only in the heart. The evaluation of GAG storage did not reveal differences between treated and untreated MPS I mice. In both studies, some animals were used for a shortterm experiment and increased IDUA levels were observed in the tissues 24 h after capsules implantation. In conclusion, microencapsulated cells were able to correct some aspects of the disease. However, factors such as immune response against the enzyme and the biomaterial or the dose of cells in the capsules could be impairing the efficiency of the treatment, suggesting that modifications on the technique are necessary to achieve a better performance.