Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Mucopolissacaridose do tipo I (MPS I) é uma doença de acúmulo lisossomal que leva a neurodegeneração e déficits neurológicos, entre outras conseqüências patológicas e clínicas. A ausência de estudos sobre parâmetros neurocomportamentais do modelo murino de MPS I capazes de avaliar sua função cognitiva motivou a realização deste trabalho. O primeiro nosso objetivo foi analisar parâmetros cognitivos que possam ser utilizados na avaliação de diferentes terapias e seus efeitos sobre o SNC. Durante a exploração do campo aberto, camundongos MPS I (Idua-/-) adultos mostraram locomoção e ansiedade normais, mas reduzido número de rearings. Camundongos Idua-/- tiveram uma performance normal no reconhecimento de objeto novo e mostraram memória de curta duração de esquiva inibitória normal. Entretanto a memória de longa duração de esquiva inibitória estava prejudicada. O déficit observado na esquiva inibitória não pode ser atribuído a redução na reatividade ao choque. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- apresentam um déficit na memória de longa duração para treinamento aversivo e comportamento exploratório. O segundo objetivo foi avaliar biomarcadores de estresse oxidativo neste modelo animal. Nós avaliamos atividade enzimática antioxidante, dano a proteínas e peroxidação lipídica no telencéfalo, cerebelo, coração, pulmão, diafragma, fígado, rim, e baço. De oito órgãos analisados, sete tiveram alteração em no mínimo um parâmetro. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- podem estar sofrendo estresse oxidativo. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease that leads to neurodegeneration and neurological deficits, among other pathological and clinical consequences. The absence of behavioral parameters from the MPS I mouse model motivated the accomplishment of this work. Our first objective was to analyze behavioral parameters that might be used to essay the effect of different therapies on the CNS. During exploration of an open field, adult MPS I (Idua-/-) mice showed normal locomotion and anxiety, but reduced number of rearings. Idua-/- mice performed normally in a novel object recognition memory task and showed normal short-term retention of inhibitory avoidance training. By contrast, long-term retention of inhibitory avoidance was impaired. The deficit in inhibitory avoidance memory could not be attributed to reduced footshock reactivity. The results indicate that Idua-/- mice present deficits in long-term memory for aversive training and reduced exploratory behavior. The second aim was to evaluate oxidative biomarkers on this mice model. We evaluated antioxidant enzymatic activity, protein damage and lipid peroxidation on forebrain, cerebellum, heart, lung, diaphragm, liver, kidney and spleen. From eight analyzed organs, seven had alteration on at least one parameter. The results indicate that Idua-/- mice can be under oxidative stress.

Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Mucopolissacaridose do tipo I (MPS I) é uma doença de acúmulo lisossomal que leva a neurodegeneração e déficits neurológicos, entre outras conseqüências patológicas e clínicas. A ausência de estudos sobre parâmetros neurocomportamentais do modelo murino de MPS I capazes de avaliar sua função cognitiva motivou a realização deste trabalho. O primeiro nosso objetivo foi analisar parâmetros cognitivos que possam ser utilizados na avaliação de diferentes terapias e seus efeitos sobre o SNC. Durante a exploração do campo aberto, camundongos MPS I (Idua-/-) adultos mostraram locomoção e ansiedade normais, mas reduzido número de rearings. Camundongos Idua-/- tiveram uma performance normal no reconhecimento de objeto novo e mostraram memória de curta duração de esquiva inibitória normal. Entretanto a memória de longa duração de esquiva inibitória estava prejudicada. O déficit observado na esquiva inibitória não pode ser atribuído a redução na reatividade ao choque. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- apresentam um déficit na memória de longa duração para treinamento aversivo e comportamento exploratório. O segundo objetivo foi avaliar biomarcadores de estresse oxidativo neste modelo animal. Nós avaliamos atividade enzimática antioxidante, dano a proteínas e peroxidação lipídica no telencéfalo, cerebelo, coração, pulmão, diafragma, fígado, rim, e baço. De oito órgãos analisados, sete tiveram alteração em no mínimo um parâmetro. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- podem estar sofrendo estresse oxidativo. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease that leads to neurodegeneration and neurological deficits, among other pathological and clinical consequences. The absence of behavioral parameters from the MPS I mouse model motivated the accomplishment of this work. Our first objective was to analyze behavioral parameters that might be used to essay the effect of different therapies on the CNS. During exploration of an open field, adult MPS I (Idua-/-) mice showed normal locomotion and anxiety, but reduced number of rearings. Idua-/- mice performed normally in a novel object recognition memory task and showed normal short-term retention of inhibitory avoidance training. By contrast, long-term retention of inhibitory avoidance was impaired. The deficit in inhibitory avoidance memory could not be attributed to reduced footshock reactivity. The results indicate that Idua-/- mice present deficits in long-term memory for aversive training and reduced exploratory behavior. The second aim was to evaluate oxidative biomarkers on this mice model. We evaluated antioxidant enzymatic activity, protein damage and lipid peroxidation on forebrain, cerebellum, heart, lung, diaphragm, liver, kidney and spleen. From eight analyzed organs, seven had alteration on at least one parameter. The results indicate that Idua-/- mice can be under oxidative stress.

Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Mucopolissacaridose do tipo I (MPS I) é uma doença de acúmulo lisossomal que leva a neurodegeneração e déficits neurológicos, entre outras conseqüências patológicas e clínicas. A ausência de estudos sobre parâmetros neurocomportamentais do modelo murino de MPS I capazes de avaliar sua função cognitiva motivou a realização deste trabalho. O primeiro nosso objetivo foi analisar parâmetros cognitivos que possam ser utilizados na avaliação de diferentes terapias e seus efeitos sobre o SNC. Durante a exploração do campo aberto, camundongos MPS I (Idua-/-) adultos mostraram locomoção e ansiedade normais, mas reduzido número de rearings. Camundongos Idua-/- tiveram uma performance normal no reconhecimento de objeto novo e mostraram memória de curta duração de esquiva inibitória normal. Entretanto a memória de longa duração de esquiva inibitória estava prejudicada. O déficit observado na esquiva inibitória não pode ser atribuído a redução na reatividade ao choque. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- apresentam um déficit na memória de longa duração para treinamento aversivo e comportamento exploratório. O segundo objetivo foi avaliar biomarcadores de estresse oxidativo neste modelo animal. Nós avaliamos atividade enzimática antioxidante, dano a proteínas e peroxidação lipídica no telencéfalo, cerebelo, coração, pulmão, diafragma, fígado, rim, e baço. De oito órgãos analisados, sete tiveram alteração em no mínimo um parâmetro. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- podem estar sofrendo estresse oxidativo. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease that leads to neurodegeneration and neurological deficits, among other pathological and clinical consequences. The absence of behavioral parameters from the MPS I mouse model motivated the accomplishment of this work. Our first objective was to analyze behavioral parameters that might be used to essay the effect of different therapies on the CNS. During exploration of an open field, adult MPS I (Idua-/-) mice showed normal locomotion and anxiety, but reduced number of rearings. Idua-/- mice performed normally in a novel object recognition memory task and showed normal short-term retention of inhibitory avoidance training. By contrast, long-term retention of inhibitory avoidance was impaired. The deficit in inhibitory avoidance memory could not be attributed to reduced footshock reactivity. The results indicate that Idua-/- mice present deficits in long-term memory for aversive training and reduced exploratory behavior. The second aim was to evaluate oxidative biomarkers on this mice model. We evaluated antioxidant enzymatic activity, protein damage and lipid peroxidation on forebrain, cerebellum, heart, lung, diaphragm, liver, kidney and spleen. From eight analyzed organs, seven had alteration on at least one parameter. The results indicate that Idua-/- mice can be under oxidative stress.

A Incontinência Pigmentar (IP) é uma genodermatose multissistêmica rara caracterizada por diferentes manifestações clínicas que incluem anormalidades de pele, dentes, cabelos, unhas, olhos e sistema nervoso central. A doença tem um padrão de herança ligado ao X dominante, com letalidade no sexo masculino. A IP é causada por mutações no gene IKBKG, que codifica a subunidade regulatória de um complexo necessário para ativação do fator nuclear kB (NF-kB), envolvido em diferentes funções fisiológicas e patológicas essenciais, incluindo a sobrevivência celular. Cerca de 70-80% dos pacientes com IP carregam um rearranjo recorrente no lócus de IKBKG: a deleção dos éxons 4-10 do gene (IKBKGdel). O objetivo do presente estudo é investigar em uma série de casos de IP a prevalência da deleção recorrente, os achados clínicos associados e as histórias genéticas familiares. O estudo molecular incluiu 36 indivíduos, sendo 23 pacientes diagnosticados com IP (11 casos-índice e 12 familiares) e mais 13 familiares não-afetados. A prevalência da deleção IKBKGdel na amostra (73%) está de acordo com o relatado na literatura, indicando que, independente da origem étnica, essa é a principal mutação em IKBKG. As manifestações clínicas dos pacientes estão de acordo ao descrito em estudos prévios e apontam a importância de avaliações específicas que visem aos principais sinais da IP. A alta variabilidade clínica familiar indica uma ausência de correlação genótipo-fenótipo e sugere que outros fatores devem desenvolver um papel importante para a severidade da doença. Nós demonstramos, pela primeira vez, um desvio da proporção esperada pela segregação Mendeliana de meninos:meninas e meninas afetadas:não-afetadas nos casos familiares, indicando uma aparente transmissão preferencial do alelo IKBKG mutado. Estudos adicionais serão importantes para comprovar esse achado. Esse é o primeiro estudo genético em IP realizado no Brasil e contribui para a compreensão das bases genética e clínica envolvidas. / Incontinentia Pigmenti (IP) is a rare multisystem genodermatosis characterized by several clinical manifestations, including abnormalities of skin, teeth, hair, nail, eyes and central nervous system. The disease is X-linked dominant and lethal in males. IP occurs due to mutations in IKBKG gene, which encodes the regulatory subunit of a complex required for nuclear factor kB (NF-kB) activation, involved in many essential physiological and pathologic functions, including cell survival. Around 70-80% of IP patients carry a recurrent rearrangement in IKBKG locus: the exon 4-10 deletion (IKBKGdel). Our aim was to investigate in a case series of IP the recurrent deletion prevalence, the associated clinical findings and the familial genetic histories. The molecular study included 36 individuals, being 23 IP patients (11 index-cases and 12 relatives) and 13 non-affected relatives. The IKBKGdel prevalence in our sample (73%) is in accordance to that reported in literature, indicating that, irrespectively of ethnical origin, this is the major mutation in IKBKG. The clinical manifestations from our IP patients are consistent to those described in previous studies and point out the importance of a specific examination looking for the most prevalent IP signs. The high observed clinical intrafamilial variability indicates a lack of genotype-phenotype correlation and suggests that other factors might play an important role to disease’s severity. We show, in first instance, a deviation in the expected Mendelian proportion of male:female ratio and, among female, the affected:non-affected ratio in familial cases, indicating an apparent preferential transmission of the mutated IKBKG allele. studies are important to verify this finding. This is the first Brazilian genetic study in IP and it contributes to the understanding of the genetic and clinical bases involved.