Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par des bactéries naturellement immunisées contre leurs propres bactériocines. Ce travail a permis l’identification de nombreuses souches productrices de peptides antimicrobiens. Ces derniers ont été extraits et purifiés par différentes techniques chromatographiques, puis identifiés et caractérisés par la mesure de leurs masses et par l’analyse de leurs structures (approche protéomique et séquençage d’Edman). Parmi les résultats obtenus, il y a :- la mise en évidence d’une nouvelle bactériocine (maltaricin CPN), appartenant à la classe IIa, isolée et identifiée chez Carnobacterium maltaromaticum ;- l’identification de trois nouvelles espèces productrices de pédiocine PA-1 ;- l’isolement de souches productrices de bactériocines multiples (appartenant à différentes classes) ;- la mise en évidence pour certaines bactériocines d’une forte activité antimicrobienne in vitro (spectres d’activité incluant des pathogènes).Les travaux se poursuivent avec l’application de deux souches productrices de bactériocines dans du lait fermenté (Lben) en vue de lutter contre L. monocytogenes.Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par des bactéries naturellement immunisées contre leurs propres bactériocines. Ce travail a permis l’identification de nombreuses souches productrices de peptides antimicrobiens. Ces derniers ont été extraits et purifiés par différentes techniques chromatographiques, puis identifiés et caractérisés par la mesure de leurs masses et par l’analyse de leurs structures (approche protéomique et séquençage d’Edman). Parmi les résultats obtenus, il y a :- la mise en évidence d’une nouvelle bactériocine (maltaricin CPN), appartenant à la classe IIa, isolée et identifiée chez Carnobacterium maltaromaticum ;- l’identification de trois nouvelles espèces productrices de pédiocine PA-1 ;- l’isolement de souches productrices de bactériocines multiples (appartenant à différentes classes) ;- la mise en évidence pour certaines bactériocines d’une forte activité antimicrobienne in vitro (spectres d’activité incluant des pathogènes).Les travaux se poursuivent avec l’application de deux souches productrices de bactériocines dans du lait fermenté (Lben) en vue de lutter contre L. monocytogenes. / Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by bacteria naturally immunized against their own bacteriocins. This work has allowed the identification of several strains which produce antimicrobial peptides. These have been purified using different chromatographic techniques. Then, they have been identified and characterized by the measurement of their mass and by the analysis of their structure (proteomic approach/ Edman sequencing). Among the obtained results, there was:- the discovery of a new bacteriocin (maltaricin CPN) produced by C. maltaromaticum and belonging to the class IIa ;- the identification of three new pediocin PA-1 producing species;- the isolation of bacterial strains wich produce multiple bacteriocins belonging to several classes ;- the in vitro determination of a strong antimicrobial activity(affecting pathogens) with some bacteriocins.This work is still underway with the application of two bacteriocin producing strains in fermented milk (Lben) in order to tackle L. monocytogenes.

Les bactéries lactiques préviennent la contamination de produits alimentaires par des bactéries pathogènes en inhibant leur prolifération, essentiellement par la production d'acide lactique et de peptides antimicrobiens nommés bactériocines. Les bactériocines sont synthétisées par voie ribosomique. Elles sont actives contre des bactéries phylogénétiquement proches incluant des pathogènes tels que Listeria et Enterococcus. Notre étude a porté sur l'isolement et la caractérisation d'une bactériocine produite par la souche KM432Bz isolée d'une boisson fermentée des Balkans, le boza et que nous avons identifiée comme un Leuconostoc pseudomesenteroides. Des analyses structurales par spectrométrie de masse et dégradation d'Edman de la bactériocine produite par Ln. pseudomesenteroides KM432Bz ont montré que sa structure primaire était similaire à celles de deux bactériocines de classe IIa, les leucocines A et B et à la leucocine A-QU15 récemment découverte. Le système génétique impliqué dans la biosynthèse de cette leucocine a été identifié et analysé. Le gène codant la préleucocine KM432Bz est identique à ceux codant les préleucocines B et A-QU15. La leucocine produite par la souche KM432Bz présente un spectre d'activité dirigé contre des espèces proches de la souche productrice telles que Lactobacillus, Leuconostoc et Weissella ainsi que des espèces pathogènes appartenant aux genres Listeria, Enterococcus et Streptococcus avec des concentrations minimales inhibitrices comprises entre 0,08 et 10 μM. Par ailleurs, il a été montré que le facteur de transcription s54, impliqué dans la transcription de la mannose perméase du système phosphotransférase, est impliqué dans la sensibilité de Listeria monocytogenes à cette bactériocine.

Le projet de ma thèse a consisté à étudier chez les nouveau-nés la réponse des cellules épithéliales intestinales (IEC) en microARN (miR) et en peptides antimicrobiens (PAM) dans le contexte de l’infection par Cryptosporidium parvum. Ce protozoaire monoxène se développe uniquement dans les IEC et affecte plus particulièrement les nouveau-nés et les individus immunodéprimés. Nous avons étudié la réponse en miR dans les IEC après infection par C. parvum. La comparaison des réponses obtenues dans les IEC in vitro et in vivo nous a permis de montrer que l’expression du miR-181d-5p est diminuée durant l’infection et que cette diminution d’expression lèverait l’inhibition de l’expression des facteurs anti-apoptotiques OPG et BCL2, favorisant la survie du parasite dans les IEC. Nous avons également caractérisé l’impact de C. parvum sur l’expression des PAM chez le nouveau-né et leur rôle durant l’infection. Nous avons mis en évidence que l’infection entraine une forte modification de l’expression des PAM. Notre attention a été retenue par la diminution, surprenante, de l’expression de la chimiokine antimicrobienne CCL20 et de la cathélicidine CRAMP au cours de l’infection. Pour ces deux peptides, nous avons montré qu’une administration aux souriceaux réduisait significativement la charge parasitaire. Nous avons pu montrer que la protection induite par ces deux molécules antimicrobiennes résultait de leur activité parasiticide sur C. parvum. Ainsi, leur diminution d’expression semble être favorable au développement du parasite et nous avons suggéré qu’elle puisse être induite par le parasite pour échapper à cette activité parasiticide avec notamment la modulation de certains miR. / The aim of my thesis was to study in the mouse model, the intestinal epithelial cell (IEC) response during neonatal Cryptosporidium parvum infection with a focus on microRNAs (miR) and antimicrobial peptides (AMP) response. C. parvum is a protozoan parasite that affects preferentially newborn, young or immunocompromised adult and completes its life cycle only in IECs. In a first part, we studied the expression of miRs in IEC during C. parvum infection. We compared the responses between in vitro infected IEC and IECs purified from infected neonatal mice and observed a decrease of miR-181d-5p expression. This reduced expression of miR-181d-5p was associated with an upregulation of the mRNA coding for two putative targets OPG and BCL2 which are anti-apoptotic agents that may favor parasite survival in IEC. This functional relation between miR-181d-5p and OPG was next demonstrated by using reporter dual-luciferase assay. In a second part of my thesis, we characterized the AMP expression profile and studied their role during C. parvum infection in neonates. We showed that infection up-regulates a broad expression of AMP except for CCL20 and CRAMP cathelicidin for which mRNA expression was decreased. We next choose to focus our work on these two molecules and reported that administration of CCL20 and CRAMP to infected neonatal mice significantly reduced the number of parasites in the intestine through a direct killing activity on free stages of the parasite. As the decreased expression of these two AMPs during infection seems to favor the development of the parasite, this could be an escape mechanism developed by C. parvum that may occur through the modulation of miR.

Le microbiote humain est constitué de milliers d’espèces bactériennes qui synthétisent de nombreux métabolites secondaires. Cependant, notre connaissance des produits naturels dérivés du microbiome est encore limitée. Parmi eux, les RiPPs (Ribosomally Synthesized and Post-translationally modified Peptides) apparaissent comme une famille majeure de produits naturels possédant diverses structures et fonctions biologiques dont des propriétés antibiotiques, en faisant une famille de molécules d’intérêt majeur pour la santé publique. La biosynthèse des RiPPs commence par la traduction d’un peptide précurseur, qui est ensuite maturé par l’action d’une ou plusieurs enzymes avant l’excision d’une séquence signal et l’export du produit naturel actif. La diversité structurale et fonctionnelle des RiPPs démontre la nécessité de la compréhension des voies de biosynthèse de ces produits naturels, de l’étude systématique des mécanismes de modification et de la caractérisation des maturases associées. En particulier, une famille de métallo-enzymes, les enzymes à radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM), a récemment été impliquée dans la biosynthèse de nombreux RiPPs. Ces enzymes catalysent un large éventail de réaction, via un mécanisme de chimie radicalaire, aboutissant à une grande variété de modifications post-traductionnelles. Néanmoins, les voies de biosynthèse de nombreux RiPP restent mal comprises.En 2011, il a été montré que Ruminococcus gnavus, un membre important du microbiote humain, produisait un peptide actif contre Clostridium perfringens, la Ruminococcin C (RumC). Le séquençage de l’opéron de biosynthèse de RumC montre la présence de cinq gènes codants des peptides précurseurs (RumC1-5) et deux gènes codant des enzymes (RumMC1 et RumMC2).L’objectif de ma thèse est de mieux comprendre les voies de biosynthèse des produits naturels au sein du microbiome humain. Nous avons démontré l’appartenance des protéines RumMC1 et RumMC2 à la famille des enzymes à radical SAM, ainsi que leurs implications dans la formation de quatre modifications post-traductionnelles (ponts α-thioether) essentielles à l’activité antibiotique de RumC1 et RumC2. Ces études nous ont permis de proposer un mécanisme catalytique pour la maturation de la Rummonicoccin C et ainsi de mieux documenter cette famille d’enzymes émergentes. / The human microbiota consists of thousands bacterial species which synthesize numerous secondary metabolites. However, our knowledge of microbiome-derived natural products is still limited. Among them, RiPPs (Ribosomally synthesized and Post-translationally modified Peptides) are emerging as a major family of natural products possessing diverse structures and biological functions including antibiotic properties, making them a major family of molecules of interest for public health. The biosynthesis of RiPPs occurred by the translation of a precursor peptide, which is then matured via the action of one or more enzymes before the excision of a signal sequence and the export of the active natural product. The structural and functional diversity of RiPPs demonstrates the need for understanding the biosynthetic pathways of these natural products, the systematic study of the modification mechanisms and the characterization of associated maturases. In particular, a family of metallo-enzymes, the S-adenosyl-L-methionine radical (SAM) enzymes, has recently been implicated in the biosynthesis of many RiPPs. These enzymes catalyze a wide range of reactions, via a mechanism of radical chemistry, resulting in a wide variety of post-translational modifications. Nevertheless, the biosynthetic pathways of many RiPPs remain poorly understood.In 2011, it was shown that Ruminococcus gnavus, a major member of the human microbiota, produced an active peptide against Clostridium perfringens, Ruminococcin C (RumC). Sequencing of the RumC biosynthesis operon shows the presence of five genes encoding precursor peptides (RumC1-5) and two genes encoding enzymes (RumMC1 and RumMC2).The aim of my thesis is to understand the biosynthetic pathways of natural products within the human microbiome. We have demonstrated that the RumMC1 and RumMC2 proteins belong to the radial SAM enzyme family, as well as their involvement in the formation of four post-translational modifications (α-thiother bridges) essential for the antibiotic activity of RumC1 and RumC2. These studies allowed us to propose a catalytic mechanism for the maturation of Rummonicoccin and thus to better document this family of emerging enzymes.

Les sources hydrothermales océaniques profondes renferment des écosystèmes extrêmes, situés dans la zone abyssale des Océans. Dans ces environnements dépourvus de lumière, la production primaire est réalisée par la chimiosynthèse microbienne. Ces milieux sont colonisés par des espèces animales, dont la plupart vivent en associations plus ou moins fortes avec des micro-organismes. La crevette Rimicaris exoculata est une espèce hydrothermale endémique des sites de la Ride-Médio-Atlantique (MAR), qui domine la plupart des sites qu’elle colonise. Ce crustacé a pour particularité de posséder deux communautés symbiotiques : une située dans son céphalothorax hypertrophié et une inféodée à son tractus digestif. Tout d’abord, ce travail de thèse s’est concentré sur l’étude de la communication bactérienne (Quorum Sensing ou QS) au sein des communautés ectosymbiotiques de R. exoculata au cours de son cycle de mue et de vie. Ensuite, ce travail s’est focalisé sur l’identification d’un peptide antimicrobien (PAM), puis à rechercher sa fonction dans l'immunité et le contrôle des symbiotes chez Rimicaris exoculata. Ce travail a permis, d’une part, de confirmer la présence de deux gènes du QS (luxS et luxR) dans les communautés ectosymbiotiques de R. exoculata sur quatre sites hydrothermaux : Rainbow, TAG, Snake Pit et Logatchev. Ces gènes étant plus divergents que ceux de l'ARNr 16S, leur utilisation comme marqueurs génétiques biogéographiques pour retracer l'origine des individus est discuté. Ce travail a permis, d’autre part, d’identifier pour la première fois un PAM (sus nommé Re-crustin), chez un arthropode hydrothermal. Les données suggèrent une participation de ce PAM dans le contrôle de l’ectosymbiose. L’ensemble de ces travaux apporte de nouvelles hypothèses sur l’interaction entre les épibiontes du céphalothorax et la crevette Rimicaris exoculata. / Deprived of light, the deep-sea hydrothermal vents are extremes ecosystems sustained by micobial chemosynthesis. These environments are colonized by animal species living in close relationships with these chemoautotrophic micro-organisms, eating them or establishing long term interactions with them, may they be trophic or not only. The shrimp Rimicaris exoculata is an endemic hydrothermal species of the Mid-Atlantic Ridge (MAR) sites. This crustacean represents the predominant macrofauna of some sites of the MAR. It lives in symbiotic association with two distinct microbial communities qualified as ectosymbiosis. One is located in its gill chamber and one in its gut. First, this work focused on the study of bacterial communication (Quorum Sensing or QS) within the ectosymbiontic communities during the molting and life cycles of R. exoculata. Then, we focused on an antimicrobial peptide (AMP) identification and search for its function in R. exoculata immunity and in controlling symbionts. Two QS genes (luxS and luxR) were identified in the R. exoculata ectosymbiontic community at different shrimp molt stages and life stages at the Rainbow, TAG, Snake Pit and Logatchev vent sites.As these genes are more divergent than that of 16S rRNA, they could be then used as biogeographical genetic markers tools to trace back the origin of individuals to a location or between locations along its life cycle. This work reports also the first description of an AMP in an extremophile arthropod (namely Recrustin). Data suggest a participation of this AMP in the control of the ectosymbiosis in Rimicarisexoculata. All this work provides new hypotheses wich are discussed in the manuscript, dealing with the interaction between symbionts and Rimicaris exoculata.

Les objectifs de cette thèse étaient d'explorer les mécanismes moléculaires et les bases génétiques impliquées dans la survie des huîtres Crassostrea gigas à des maladies infectieuses, en considérant deux souches de Vibrio pathogènes pour l'huître (V. splendidus LGP32 et V. aestuarianus LPi 02/41) qui ont été associées aux phénomènes de mortalités massives d'huîtres en France. Par l'approche transcriptomique de « Digital Gene Expression », nous avons identifié des composants génétiques d'une réponse efficace à des infections par des Vibrio virulents. La capacité de survie des huîtres se traduit par l'expression basale d'une combinaison de 14 gènes hémocytaires, une signature de survie, et par l'induction de différentes fonctions cellulaires au cours de la réponse immunitaire. Une analyse transcriptomique détaillée au niveau individuel a révélé un extraordinaire polymorphisme d'expression basale des gènes, incluant des cas où chez certaines huîtres des transcrits sont absents. Afin de comprendre ce polymorphisme, nous nous sommes intéressés à la caractérisation d'une nouvelle famille de peptides antimicrobiens (PAMs), les big défensines (Cg-BigDef). Nous avons montré que Cg-BigDef est une famille de PAMs composée de trois membres et diversifiée en termes de séquences, d'organisation génomique et de régulation de l'expression des gènes. Les Cg-BigDefs sont codées par des gènes distincts dont l'expression est régulée suivant différents modes en réponse à une infection. Chose intéressante, certaines huîtres n'expriment pas simultanément les trois formes de Cg-BigDef ou dans certains cas, n'en expriment aucune. Nous avons démontré que l'absence d'expression basale de Cg-BigDef est liée à l'absence de gène correspondant dans le génome des huîtres. C'est la première mise en évidence chez un invertébré de variation de présence/absence (PAV) de gènes, un phénomène qui pourrait contribuer à une susceptibilité accrue aux maladies infectieuses. / The objectives of this thesis were to explore the molecular mechanisms and genetic bases involved in Crassostrea gigas oyster survival to infectious diseases, considering two Vibrio strains (V. splendidus LGP32 and V. aestuarianus LPi 02/41) pathogenic for oysters which have been shown to be involved in C. gigas mass mortalities in France. By the Digital Gene Expression transcriptomic approach, we have identified some genetic components implicated in a successful response and survival to virulent Vibrio infections. Oyster survival capacity is reflected by the basal expression of a selected combination of hemocyte genes, a 14-gene survival signature, and by the induction of some cellular functions during the oyster immune response. A detailed transcriptomic analysis at individual level revealed an extraordinary interindividual polymorphism in basal gene expression, including cases where some transcripts are fully absent. In order to understand this striking variability in gene expression, we have focused on the characterization of a novel family of antimicrobial peptides (AMP) in C. gigas oysters, the big defensins (Cg-BigDef). We have shown that Cg-BigDef is an AMP family, composed of three members, and diversified in terms of sequences but also in terms of genomic organization and regulation of gene expression. Each Cg-BigDef form is encoded by a distinct gene that follows different patterns of gene regulation upon Vibrio infection. Interestingly, some oysters were shown do not express simultaneously the three Cg-BigDef forms or any Cg-BigDef. We demonstrated that the absence of Cg-BigDef basal gene expression is likely due to the absence of the Cg-bigdef gene in oyster genome. This is the first evidence in an invertebrate of a presence/absence variation (PAV) of genes, a phenomenon that could be associated to a susceptibility to infectious diseases.

L’émergence de nouvelles souches bactériennes résistantes a signé la fin de l’« âge d’or » des antibiotiques. L’organisation mondiale de la santé a reconnu l’imminence des problèmes associés à ces nouvelles bactéries, qui engendrent de nouveau une mortalité en augmentation. Afin de palier à ce problème, de nouvelles alternatives aux antibiotiques sont envisagées par les chercheurs à travers le monde. La thérapie photodynamique antimicrobienne est l’une de ces alternatives. Elle a su se démarquer grâce à son incapacité à induire la résistance bactérienne. Alors que les résultats furent initialement très prometteurs contre les bactéries Gram positif, une moins bonne sensibilité fut rapidement observée de la part des bactéries Gram négatif. Afin d’augmenter le potentiel antibactérien de cette technique, diverses stratégies furent élaborées comme l’utilisation de photosensibilisateurs cationiques, l’ajout d’un agent de ciblage, ou la présence d’un agent de perméabilisation membranaire. L’un de ces agents est la polymyxine B, un peptide antimicrobien qui arbore une très bonne affinité avec les bactéries Gram négatif. Dans cette étude, nous avons voulu associer chimiquement différents photosensibilisateurs avec des dérivés de polymyxines B de façon covalente, par l’intermédiaire d’un bras « spacer » ou d’une plateforme. L’association de ces deux familles de molécules a permis d’élaborer de nouveaux composés qui ont démontré une activité photobactéricide accrue contre un large spectre de bactérie. De plus, ces composés ont montré une affinité augmentée pour les bactéries, ce qui permettra de réduire les effets secondaires sur les cellules humaines. Cette étude confirme l’importance d’utiliser des peptides antimicrobiens afin d’améliorer la thérapie photodynamique. Ces travaux seront approfondis afin de permettre la création de nouveaux traitements dermatologiques basées sur cette nouvelle thérapie et efficaces contre un large spectre de souche bactérienne / Despite advances achieved over the last decade, infections caused by multi-drug resistant bacterial strains are increasingly important societal issues that need to be addressed. New approaches have already been developed in order to overcome this problem. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) could provide an alternative to fight infectious bacteria. Interesting results have been obtained against Gram-positive bacteria, but it also appeared that Gram-negative strains were less sensitive to PACT. Enhanced efficacy against Gram-negative bacteria had been previously obtained following three differents strategies, which are respectively the use of cationic photosensitizers, photosensitizers bound to antimicrobial peptides, or a membrane disrupting agent. Polymyxin B is an antimicrobial peptide, known as the “last-line” treatment against Gram-negative resistant strains, which has already been used as a disrupting agent in order to improve PACT. In addition of this enhancement, this peptide is known for its strong interaction for Gram-negative bacteria. Thus, in this work, we designed differents coumpounds, consisting of a photosensitizer covalently attached to derivatives of polymyxin B, through a spacer or a chemical platform. These combinations have led to the creation of novel compounds which have shown highly photobactericidal activities against a wide spectrum of bacteria. Moreover, these compounds present enhanced affinity for bacteria, which should significantly reduce side effects on mammalian cells. This study confirmed the importance of using antimicrobial in order to target bacterial strains. Thus, such results may allow the creation of novels PACT-based dermatological treatments efficient against a wide spectrum of bacterial strains.

Dans notre groupe, nous nous intéressons au développement de peptides contenant des acides γ-aminés. Comme d’autres peptides contenant des acides aminés non naturels, ils ont montré leur capacité à posséder des conformations stables et/ou des propriétés biologiques intéressantes. De plus, ces peptides sont généralement résistant à la protéolyse. Dans l’objectif de synthétiser des acides -diaminés sous la forme d’un seul stéréoisomère, nous avons développé une voie de synthèse reposant sur une réaction de Blaise suivie d’une réduction diastéréosélective. En appliquant cette méthode, nous avons synthétisé des acides β,γ-diaminés dérivés de la D-phénylalanine et de l’acide L-glutamique. Le premier a été utilisé pour concevoir des analogues d’un peptide antimicrobien, la gramicidine S. Comparé à la molécule parent, les analogues ont montré une cytotoxicité beaucoup moins importante pour les cellules hôtes tout en conservant une activité antibactérienne intéressante. Cette étude nous a donné de meilleures connaissances pour développer d’autres analogues de la gramicidine S ainsi que d’autres peptides antimicrobiens. Nous avons également effectué de nombreuses optimisations pour synthétiser de façon efficace des acides β,γ-diaminés cycliques à partir de l’acide L-glutamique. Les oligomères incorporant ces acides β,γ-diaminés et des acides α-aminés ont montré un fort potentiel pour l’adoption de conformations stables. Ces études vont être poursuivies. / In our group, we are interested in developing peptides containing β,γ-diamino acids . Along with many other peptides containing unnatural amino acids, they have shown the ability to possess stable conformations and/or interesting biological activities. Moreover, those peptides are usually more resistant to proteolysis. In order to synthesize stereopure γ-amino acids, we have developed a synthetic route using Blaise reaction and subsequent diastereoselective reduction as key reactions. Through applying this method, we have synthesized β,γ-diamino acids derived from D-phenylalanine and L-glutamic acid. The former β,γ-diamino acid was used for designing antimicrobial peptide gramicidin S analogues. Compared with mother molecule, the analogues exerted much less host cell cytotoxicity while remaining interesting antibacterial activity. Meanwhile, it gave us more knowledge for further developing analogues of gramicidin S as well as other antimicrobial peptides. We also paid lots of effort to efficiently synthesize cyclic β,γ-diamino acids starting from L-glutamic acid. Interestingly, when oligomers incorporating this β,γ-diamino acids and α-amino acids, they have shown the potential to adopt stable conformations. The following studies will be continuously investigated.

Les antibiotiques sont des médicaments qui ont changé notre manière d’aborder les infections bactériennes et sont devenus l’un des symboles de la médecine moderne. Cependant leur utilisation massive a conduit à l'émergence de souches bactériennes multirésistantes. Ce problème est sans aucun doute un des grands défis que la médecine actuelle doit relever. Sachant que les bactéries évoluent à un rythme plus rapide que la production de nouveaux antibiotiques, il est urgent de trouver des approches alternatives. Il a été mis en évidence que ces mêmes bactéries sont capables de sécréter différents peptides antimicrobiens, ou bactériocines. Ces macromolécules présentent une grande diversité structurale et sont très efficaces pour combattre un grand nombre de souches pathogènes de façon spécifique. Les bactériocines ont un immense potentiel dans les domaines agroalimentaire et pharmaceutique. Notre projet s’intéresse aux bactériocines RumCs produites par une souche dérivée de Ruminococcus gnavus, une bactérie anaérobie stricte, membre dominant du microbiote intestinal humain. Le travail présenté dans ce manuscrit concerne la mise au point d’un système d’expression et de maturation hétérologue chez E. coli de la bactériocine RumC1. La caractérisation biochimique du peptide RumC1 montre que les bactériocines RumCs appartiennent à la famille des sactipeptides pour laquelle l’étape de biosynthèse fait intervenir une enzyme radical-SAM. Les sactipeptides présentent dans leurs séquences peptidiques un ou plusieurs ponts thioéther entre une cystéine et le carbone alpha d’un acide aminé partenaire. RumC1 renferme 4 ponts thioéther ce qui lui confère une structure originale en double épingle à cheveux. L’activité biologique de RumC1 montre que ce peptide est efficace contre un large spectre de bactéries à Gram positif incluant des pathogènes résistants tels que S.aureus et E. faecalis. Dans ces études nous n’avons pas noté de toxicité significative de RumC1 sur différentes lignées cellulaires humaine ni observé de phénomène de résistance. Les travaux en cours visent notamment à définir le mode d’action de RumC1 et à évaluer l’activité biologique de RumC1 dans un contexte d’infection in vivo chez la souris. / Antibiotics are drugs that have changed the way we approach bacterial infections and have become one of the symbols of modern medicine. However, their widespread use has led to the emergence of multiresistant bacterial strains. This problem is undoubtedly one of the major challenges facing today's medicine. Knowing that bacteria evolve at a faster rate than the discovery of new antibiotics, it is urgent to find alternative approaches. It has been shown that these same bacteria are capable of secreting antimicrobial peptides, the bacteriocins. These macromolecules have a high structural diversity and are very effective in combating a large number of pathogenic strains in a specific way. Bacteriocins have immense potential in the agro-food and pharmaceutical sectors. Our project focuses on the bacteriocins RumCs produced by a strain derived from Ruminococcus gnavus, a strict anaerobic bacterium of the human intestinal microbiota. The work presented in this manuscript concerns the development of a heterologous expression and maturation system in E. coli of the bacteriocin RumC1. The biochemical characterization of the RumC1 peptide shows that the RumCs bacteriocins belong to the family of sactipeptides for which the biosynthesis step involves a radical-SAM enzyme. The sactipeptides have in their peptide sequences one or more thioether bridges between a cysteine and the alpha carbon of a partner amino acid. RumC1 contains 4 thioether bridges which gives it an original structure in double hairpin. The biological activity of RumC1 shows that this peptide is effective against a broad spectrum of Gram-positive bacteria including resistant pathogens such as S.aureus and E. faecalis. In these studies, we did not note any significant toxicity of RumC1 on different human cell lines nor observed resistance phenomena. Current work aims to define the mode of action of RumC1 and to evaluate the biological activity of RumC1 in an in vivo context of infection in mice.

Les antibiotiques sont fréquemment utilisés dans l’alimentation de la volaille afin de prévenir certaines maladies, dont l’entérite nécrotique, ce qui occasionne l’émergence de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. Une alternative prometteuse est l’utilisation de peptides antimicrobiens (AMPs) comme suppléments alimentaires, tels les AMPs provenant des produits laitiers. L’objectif du projet était de développer une méthode de production d’extraits peptidiques à partir de coproduits de la transformation alimentaire (babeurre, lactoferrine, isolat de protéines de pois), afin de tester si ces extraits peptidiques possédaient une activité antimicrobienne sur les pathogènes spécifiques aviaires suivants : Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli et Staphylococcus aureus. Les protéines ont été mises en suspension dans l’eau (5% p/p) et hydrolysées par la pepsine, 6 heures, pH de 2.5. Les peptides furent récupérés par ultrafiltration (< 10 kDa), puis fractionnés selon leur charge nette : totaux, cationiques, anioniques et non liés. L’effet antimicrobien a été évalué surmicroplaques, par la survie bactérienne en présence de concentrations croissantes d’extraits peptidiques. Les extraits cationiques de babeurre ont démontré une efficacité à une concentration inférieure ou égale à 5 mg/mL; perte de 3 log pour Escherichia coli O78 :H80. En comparaison, la lactoferrine cationique a été efficace à une concentration inférieure ou égale à 0.6 mg/mL; perte de 6 log pour E. coli O78 :H80. Les extraits peptidiques du pois ont démontré une efficacité faible. Cette méthode s’avère prometteuse pour le développement d’une alternative ou d’un complément pour la réduction de l’utilisation des antibiotiques dans l’alimentation de la volaille. / Antibiotics are frequently used in poultry feed in order to prevent certain diseases, including necrotic enteritis, which causes the emergence of bacterial strains resistant to antibiotics. A promising alternative is the use of antimicrobial peptides (AMPs) as dietary supplements, such as AMPs from dairy products. The objective of this project was to develop a production method for the extraction peptides, from co-produced food processing (buttermilk, lactoferrin, pea protein isolates). These peptides were tested for the detection of antimicrobial activity on the following specific poultry pathogens; Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Proteins were suspended in water (5% w/w) and pepsin hydrolyzed by pepsin for 6 hours at pH 2.5. Peptides were recovered by ultrafiltration (< 10 kDa) and fractionated based on the basis of their ionic charges: total, cationic, anionic and unbound peptides, to specifically target the fractions with antimicrobial activities. Bacterial survival was measured in contact with different peptides concentrations. Cationic buttermilk extracts were effective at a concentration less or equal to 5 mg / mL; loss of 3 log for Escherichia coli O78: H80, compared with lactoferrin which was effective at a concentration less than or equal to 0.6 mg / mL; loss of 6 log for E. coli O78: H80. The peptide extracts from pea showed low efficiency. The use of antimicrobial peptides, from buttermilk, lactoferrin and peas, is promising for the development of an alternative or a complement to reduce antimicrobial use.