Declining antibiotic discovery and flourishing antibiotic resistance have led to a modern antibiotic crisis which threatens to compromise our ability to treat infectious disease. Consequently, there is significant interest in developing new antibiotics with novel modes of action and chemical properties. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) are natural compounds with the appealing attributes of being derived directly from a genetic template while possessing numerous exotic chemical features that contribute to stability and antimicrobial activity. Abundant in nature, their diverse range of biological activities makes them excellent prospects for antibiotic development. Thiopeptides, a RiPP family rich in chemical complexity, represent a particularly promising example. Characterized by post-translationally formed sulfur- and nitrogen-containing heterocycles, more than 100 different thiopeptides have been identified from various cultivable bacterial producers, and the mining of genomic and metagenomic data promises to uncover many more chemical species that have eluded discovery by conventional means. These peptides are potent inhibitors of bacterial protein synthesis and have been shown effective against many drug-resistant pathogens. Despite these attractive properties, therapeutic applications have been limited by the lack of an efficient synthetic route and poor aqueous solubility. Both of these challenges would be greatly alleviated by a more complete understanding of thiopeptide biosynthesis and improved systems for analysis and engineering. Here we describe the characterization of a new thiopeptide gene cluster, which encodes the archetypal thiopeptide micrococcin P1. We describe the identification of the bioactive product and detail the mechanism of immunity in the producing strain. We also describe efforts to engineer this pathway for heterologous expression in Bacillus subtilis. Using this platform, we have been able to dissect this intricate biosynthetic pathway and parse the order and timing of the processing events involved in peptide maturation. The knowledge gained from these studies will inform future efforts to adapt thiopeptides for therapeutic use, and guide efforts to engineer unnatural compounds using the exotic enzymology employed by thiopeptide producing bacteria.

Le microbiote humain est constitué de milliers d’espèces bactériennes qui synthétisent de nombreux métabolites secondaires. Cependant, notre connaissance des produits naturels dérivés du microbiome est encore limitée. Parmi eux, les RiPPs (Ribosomally Synthesized and Post-translationally modified Peptides) apparaissent comme une famille majeure de produits naturels possédant diverses structures et fonctions biologiques dont des propriétés antibiotiques, en faisant une famille de molécules d’intérêt majeur pour la santé publique. La biosynthèse des RiPPs commence par la traduction d’un peptide précurseur, qui est ensuite maturé par l’action d’une ou plusieurs enzymes avant l’excision d’une séquence signal et l’export du produit naturel actif. La diversité structurale et fonctionnelle des RiPPs démontre la nécessité de la compréhension des voies de biosynthèse de ces produits naturels, de l’étude systématique des mécanismes de modification et de la caractérisation des maturases associées. En particulier, une famille de métallo-enzymes, les enzymes à radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM), a récemment été impliquée dans la biosynthèse de nombreux RiPPs. Ces enzymes catalysent un large éventail de réaction, via un mécanisme de chimie radicalaire, aboutissant à une grande variété de modifications post-traductionnelles. Néanmoins, les voies de biosynthèse de nombreux RiPP restent mal comprises.En 2011, il a été montré que Ruminococcus gnavus, un membre important du microbiote humain, produisait un peptide actif contre Clostridium perfringens, la Ruminococcin C (RumC). Le séquençage de l’opéron de biosynthèse de RumC montre la présence de cinq gènes codants des peptides précurseurs (RumC1-5) et deux gènes codant des enzymes (RumMC1 et RumMC2).L’objectif de ma thèse est de mieux comprendre les voies de biosynthèse des produits naturels au sein du microbiome humain. Nous avons démontré l’appartenance des protéines RumMC1 et RumMC2 à la famille des enzymes à radical SAM, ainsi que leurs implications dans la formation de quatre modifications post-traductionnelles (ponts α-thioether) essentielles à l’activité antibiotique de RumC1 et RumC2. Ces études nous ont permis de proposer un mécanisme catalytique pour la maturation de la Rummonicoccin C et ainsi de mieux documenter cette famille d’enzymes émergentes. / The human microbiota consists of thousands bacterial species which synthesize numerous secondary metabolites. However, our knowledge of microbiome-derived natural products is still limited. Among them, RiPPs (Ribosomally synthesized and Post-translationally modified Peptides) are emerging as a major family of natural products possessing diverse structures and biological functions including antibiotic properties, making them a major family of molecules of interest for public health. The biosynthesis of RiPPs occurred by the translation of a precursor peptide, which is then matured via the action of one or more enzymes before the excision of a signal sequence and the export of the active natural product. The structural and functional diversity of RiPPs demonstrates the need for understanding the biosynthetic pathways of these natural products, the systematic study of the modification mechanisms and the characterization of associated maturases. In particular, a family of metallo-enzymes, the S-adenosyl-L-methionine radical (SAM) enzymes, has recently been implicated in the biosynthesis of many RiPPs. These enzymes catalyze a wide range of reactions, via a mechanism of radical chemistry, resulting in a wide variety of post-translational modifications. Nevertheless, the biosynthetic pathways of many RiPPs remain poorly understood.In 2011, it was shown that Ruminococcus gnavus, a major member of the human microbiota, produced an active peptide against Clostridium perfringens, Ruminococcin C (RumC). Sequencing of the RumC biosynthesis operon shows the presence of five genes encoding precursor peptides (RumC1-5) and two genes encoding enzymes (RumMC1 and RumMC2).The aim of my thesis is to understand the biosynthetic pathways of natural products within the human microbiome. We have demonstrated that the RumMC1 and RumMC2 proteins belong to the radial SAM enzyme family, as well as their involvement in the formation of four post-translational modifications (α-thiother bridges) essential for the antibiotic activity of RumC1 and RumC2. These studies allowed us to propose a catalytic mechanism for the maturation of Rummonicoccin and thus to better document this family of emerging enzymes.

Les antibiotiques sont des médicaments qui ont changé notre manière d’aborder les infections bactériennes et sont devenus l’un des symboles de la médecine moderne. Cependant leur utilisation massive a conduit à l'émergence de souches bactériennes multirésistantes. Ce problème est sans aucun doute un des grands défis que la médecine actuelle doit relever. Sachant que les bactéries évoluent à un rythme plus rapide que la production de nouveaux antibiotiques, il est urgent de trouver des approches alternatives. Il a été mis en évidence que ces mêmes bactéries sont capables de sécréter différents peptides antimicrobiens, ou bactériocines. Ces macromolécules présentent une grande diversité structurale et sont très efficaces pour combattre un grand nombre de souches pathogènes de façon spécifique. Les bactériocines ont un immense potentiel dans les domaines agroalimentaire et pharmaceutique. Notre projet s’intéresse aux bactériocines RumCs produites par une souche dérivée de Ruminococcus gnavus, une bactérie anaérobie stricte, membre dominant du microbiote intestinal humain. Le travail présenté dans ce manuscrit concerne la mise au point d’un système d’expression et de maturation hétérologue chez E. coli de la bactériocine RumC1. La caractérisation biochimique du peptide RumC1 montre que les bactériocines RumCs appartiennent à la famille des sactipeptides pour laquelle l’étape de biosynthèse fait intervenir une enzyme radical-SAM. Les sactipeptides présentent dans leurs séquences peptidiques un ou plusieurs ponts thioéther entre une cystéine et le carbone alpha d’un acide aminé partenaire. RumC1 renferme 4 ponts thioéther ce qui lui confère une structure originale en double épingle à cheveux. L’activité biologique de RumC1 montre que ce peptide est efficace contre un large spectre de bactéries à Gram positif incluant des pathogènes résistants tels que S.aureus et E. faecalis. Dans ces études nous n’avons pas noté de toxicité significative de RumC1 sur différentes lignées cellulaires humaine ni observé de phénomène de résistance. Les travaux en cours visent notamment à définir le mode d’action de RumC1 et à évaluer l’activité biologique de RumC1 dans un contexte d’infection in vivo chez la souris. / Antibiotics are drugs that have changed the way we approach bacterial infections and have become one of the symbols of modern medicine. However, their widespread use has led to the emergence of multiresistant bacterial strains. This problem is undoubtedly one of the major challenges facing today's medicine. Knowing that bacteria evolve at a faster rate than the discovery of new antibiotics, it is urgent to find alternative approaches. It has been shown that these same bacteria are capable of secreting antimicrobial peptides, the bacteriocins. These macromolecules have a high structural diversity and are very effective in combating a large number of pathogenic strains in a specific way. Bacteriocins have immense potential in the agro-food and pharmaceutical sectors. Our project focuses on the bacteriocins RumCs produced by a strain derived from Ruminococcus gnavus, a strict anaerobic bacterium of the human intestinal microbiota. The work presented in this manuscript concerns the development of a heterologous expression and maturation system in E. coli of the bacteriocin RumC1. The biochemical characterization of the RumC1 peptide shows that the RumCs bacteriocins belong to the family of sactipeptides for which the biosynthesis step involves a radical-SAM enzyme. The sactipeptides have in their peptide sequences one or more thioether bridges between a cysteine and the alpha carbon of a partner amino acid. RumC1 contains 4 thioether bridges which gives it an original structure in double hairpin. The biological activity of RumC1 shows that this peptide is effective against a broad spectrum of Gram-positive bacteria including resistant pathogens such as S.aureus and E. faecalis. In these studies, we did not note any significant toxicity of RumC1 on different human cell lines nor observed resistance phenomena. Current work aims to define the mode of action of RumC1 and to evaluate the biological activity of RumC1 in an in vivo context of infection in mice.