La GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle dynamique des protéines cytosoliques et nucléaires qui peut entrer en compétition avec la phosphorylation pour le même résidu de Ser/Thr. Des modifications des taux de GlcNAcylation sont rapportées dans différentes pathologies et dans les cas de cancer du sein, une relation étroite entre GlcNAcylation et tumorigénèse pourrait exister. La delta-lactoferrine est un suppresseur de tumeur potentiel puisqu’elle est sous-exprimée dans le cancer du sein et que son expression conduit à l’arrêt du cycle cellulaire. Nous avons démontré que la delta-lactoferrine est un facteur de transcription régulant l’expression de différents gènes impliqués dans la régulation des acteurs moléculaires du cycle cellulaire (Skp1), dans le déclenchement de l’apoptose (Bax) ou dans la dégradation des ARNm (DcpS). La delta-lactoferrine doit être hautement régulée et nous avons montré que la GlcNAcylation inhibe son activité transcriptionnelle alors que la phosphorylation a l’effet inverse. La mutation des quatre sites de GlcNAcylation conduit à une isoforme de la delta-lactoferrine constitutivement activée possédant une activité pro-apoptotique accrue comparée à l’isoforme sauvage. L’utilisation de mutants de glycosylation, pour lesquels un site unique est préservé, nous a permis de démontrer que la GlcNAcylation du site Ser 10 est cruciale dans la régulation de l’activité de la delta-lactoferrine. Nous avons également localisé une séquence PEST fonctionnelle ainsi que les résidus de lysine cible de l’ubiquitinylation et démontré que la GlcNAcylation de la Ser10 inhibe la polyubiquitinylation et augmente la demi-vie de la protéine. De plus, nous montrons que le complexe transcriptionnel de la delta-lactoferrine interagit avec le ΔLfRE sous une forme phosphorylée et ubiquitinylée suggérant que l’activité transcriptionnelle de la delta-lactoferrine et sa dégradation sont concomitantes / The GlcNAcylation is a dynamic posttranslational modification of cytoplasmic and nuclear proteins which can compete directly with phosphorylation for the same or nearby Ser/Thr residues. Alterations of the GlcNAcylation profile are observed in different pathologies and in case of breast cancer a close relationship between GlcNAcylation and tumorigenesis may exist. Down-regulated in breast cancer, delta-lactoferrin is a potential tumor suppressor the expression of which leads to cell cycle arrest. We demonstrated that delta-lactoferrin is a transcription factor which controls the expression of different proteins involved in the regulation of cell cycle actors (Skp1), apoptosis induction (Bax) or mRNA turnover (DcpS). Therefore, delta-lactoferrin should be highly regulated and our investigations have shown that GlcNAcylation inhibits its transcriptional activity while phosphorylation activates it. The directed mutagenesis of the four GlcNAcylation sites leads to a constitutively active delta-lactoferrin isoform with increased pro-apoptotic effects compared to wild type. Using a series of different mutants in which only one glycosylation site is preserved, we showed that Ser 10 is crucial and regulates delta-lactoferrin activity. We also mapped a functional PEST sequence and the lysine residues which are the ubiquitin ligase targets and we demonstrated that GlcNAcylation of Ser 10 inhibits polyubiquitination of delta-lactoferrin and increases its half-live. Moreover, we showed that delta-lactoferrin transcriptional complex binds to ΔLfRE as a phosphorylated and ubiquinated isoform suggesting that delta-lactoferrin transcriptional activity and degradation are concomitant events.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 109-112. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

La deltalactoferrine (ΔLf) est un facteur de transcription qui possède des propriétés anti-tumorales. Son activité et sa stabilité sont hautement contrôlées par des modifications post-traductionnelles comme la O-GlcNAcylation et la phosphorylation. Au cours de ma thèse, nous avons pu montrer que la ΔLf était modifiée par SUMO-1 et mettre en évidence 5 sites de SUMOylation. Nous avons produit un ensemble de mutants pour lesquels un seul site était préservé et un mutant M5S invalidé pour les cinq sites de SUMOylation. Nous avons pu montrer que cinq lysines étaient la cible de la machinerie de SUMOylation et que K13, K308 et K379 étaient les sites accepteurs majeurs. Nous avons ensuite étudié l’activité transcriptionnelle des différents mutants et montré que la SUMOylation réprime l’activité transcriptionnelle de la ΔLf. Dans un second temps nous avons étudié le dialogue entre différentes modifications post-traductionnelles. Nous avons pu démontrer qu’une compétition SUMO/ubiquitine existait et que sous la forme SUMOylée le mutant K379 avait une durée de ½ vie plus longue confirmant que la SUMOylation protégeait la ΔLf de la dégradation protéasomale. Nous avons également pu montrer que la ΔLf était acétylée principalement sur la lysine K13. En modulant le niveau de SUMOylation ou d’acétylation du mutant K13 nous avons pu montrer que la compétition SUMO/acétylation était impliquée dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de la ΔLf. En effet, l’acétylation régule positivement l’activité transactivatrice de la ΔLf alors que la SUMOylation l’inhibe. En résumé, nous avons pu montrer que la ΔLf était multi-SUMOylée et que la SUMOylation était un nouveau mécanisme de régulation à la fois de l’activité transcriptionnelle et de la stabilité de la ΔLf. En parallèle, nous avons montré que la ΔLf transactivait le gène Bax déclenchant l’apoptose et que la balance O-GlcNAc/Phosphate modulait la transactivation de Bax. / Deltalactoferrin (ΔLf) is a transcription factor which possesses antitumoral activities. Posttranslational modifications such as O-GlcNAcylation and phosphorylation, efficiently modulate its transcription factor activity and stability. During my PhD thesis we first showed that ΔLf is modified by SUMO-1 and mapped the five SUMO sites. We produced a series of mutants for which only one site was preserved and a null-mutant in which all five SUMO sites were invalidated. We showed that all lysine residues were SUMO acceptors and that K13, K308 and K379 were the main SUMO sites. We next studied the impact of SUMOylation on ΔLf activity and showed that SUMOylation negatively regulated the transactivation function of ΔLf. During the second part of my PhD, we investigated the crosstalk between different posttranslational modifications. We showed that K379 which is either ubiquitinated or SUMOylated, is a pivotal site for the control of ΔLf stability. We also showed that SUMOylation competes with ubiquitination and protects ΔLf from proteosomal degradation by positively regulating its stability. We demonstrated that K13 is the main acetylation site and that favoring acetylation at K13 reduced SUMOylation and increased ΔLf transcriptional activity. Collectively, our results indicate that multi-SUMOylation occurs on ΔLf to repress its transcriptional activity. Reciprocal occupancy of K13 by either SUMO-1 or an acetyl group may contribute to the establishment of finely regulated mechanisms to control ΔLf transcriptional activity. Moreover, competition between SUMOylation and ubiquitination at K379 coordinately regulates the stability of ΔLf toward proteolysis. Therefore SUMOylation of ΔLf is a novel mechanism controlling both its activity and stability. In parallel, we demonstrated that ΔLf transactivates the Bax promoter leading to the triggering of apoptosis and that the O-GlcNAc/Phosphate interplay controls Bax transactivation. Lf) is a transcription factor which possesses antitumoral activities. Posttranslational modifications such as O-GlcNAcylation and phosphorylation, efficiently modulate its transcription factor activity and stability. During my PhD thesis we first showed that ΔLf is modified by SUMO-1 and mapped the five SUMO sites. We produced a series of mutants for which only one site was preserved and a null-mutant in which all five SUMO sites were invalidated. We showed that all lysine residues were SUMO acceptors and that K13, K308 and K379 were the main SUMO sites. We next studied the impact of SUMOylation on ΔLf activity and showed that SUMOylation negatively regulated the transactivation function of ΔLf. During the second part of my PhD, we investigated the crosstalk between different posttranslational modifications. We showed that K379 which is either ubiquitinated or SUMOylated, is a pivotal site for the control of ΔLf stability. We also showed that SUMOylation competes with ubiquitination and protects ΔLf from proteosomal degradation by positively regulating its stability. We demonstrated that K13 is the main acetylation site and that favoring acetylation at K13 reduced SUMOylation and increased ΔLf transcriptional activity. Collectively, our results indicate that multi-SUMOylation occurs on ΔLf to repress its transcriptional activity. Reciprocal occupancy of K13 by either SUMO-1 or an acetyl group may contribute to the establishment of finely regulated mechanisms to control ΔLf transcriptional activity. Moreover, competition between SUMOylation and ubiquitination at K379 coordinately regulates the stability of ΔLf toward proteolysis. Therefore SUMOylation of ΔLf is a novel mechanism controlling both its activity and stability. In parallel, we demonstrated that ΔLf transactivates the Bax promoter leading to the triggering of apoptosis and that the O-GlcNAc/Phosphate interplay controls Bax transactivation.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 75-88. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Freddy Troost. Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met lit. opg., bibliogr. - Met samenvatting in het Nederlands.

La lactoferrine est une protéine du lactosérum, capable de lier le fer. Elle a des propriétés biologiques importantes lui conférant de l'intérêt comme ingrédient dans les aliments fonctionnels et les nutraceutiques. Le but de ce travail était d'étudier la capacité du procédé d'électrodialyse avec membrane d'ultrafiltration (EDUF) à séparer la lactoferrine bovine à partir du lactosérum. Pour ce faire, la mobilité électrophorétique de la lactoferrine a été étudiée en fonction du pH. La mobilité électrophorétique de la LF a été optimale à pH3. Ensuite, nous avons démontré la faisabilité de la séparation de la lactoferrine par EDUF à partir d'une solution modèle: un taux de migration de 46% a été obtenu. Finalement, l'EDUF a été appliquée sur du lactosérum enrichi, en testant les pH 3, 4 et 5. Le plus haut taux de migration de la lactoferrine a été obtenu à pH3 avec 15% de migration.

La lactoferricine bovine (LfcinB) est un peptide généré dans l'estomac lors du clivage pepsique de la lactoferrine bovine, une protéine principalement extraite du lait. La LfcinB est reconnue pour être un peptide antibactérien, antimicrobien, antiviral, et antifongique. L'aspect antibactérien de ce peptide est bien décrit dans la littérature. Le mode d'action de la LfcinB sur les membranes des cellules bactériennes reste cependant inconnu à ce jour. Nos travaux visent donc à étudier l'interaction entre la LfcinB et les membranes en utilisant des monocouches de dipalmitoylphosphatidylglycérol (DPPG) comme membrane modèle. Nous avons choisi d'utiliser un phosphatidylglycérol parce que ce phospholipide fait partie de la composition lipidique des membranes bactériennes. Nous avons étudié l'interaction entre le DPPG et la LfcinB in situ à l'interface air-eau par la technique des films de Langmuir ainsi que par microscopie à angle de Brewster et par spectroscopie infrarouge de réflexion-absorption avec modulation de la polarisation. Des monocouches ont été transférées sur des supports solides par la technique de Langmuir-Blodgett. Ces échantillons ont été caractérisés par spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée et par microscopie à force atomique. Nos résultats montrent que la LfcinB interagit différemment avec les monocouches de lipides en fonction de la pression de surface. Les calculs d'orientation effectués montrent que la présence du peptide dans les monocouches de complexes n'affecte pas l'orientation des chaînes acyle du lipide. L'orientation du peptide dans la monocouche est cependant différente à haute pression de surface. La microscopie à force atomique nous a permis de visualiser un changement de la morphologie des monocouches lipidiques en présence de LfcinB. À basse pression de surface, les lipides forment de grands domaines circulaires alors qu'à haute pression de surface le film lipidique se divise en deux phases inhomogènes. La microscopie à angle de Brewster nous a permis d'établir la pression de surface limite qui sépare les deux types de comportement de la LfcinB. Pour des pressions de surface inférieure à 20 mN/m, le peptide s'insère dans la monocouche lipidique alors qu'à des pressions de surface supérieures à 20 mN/m, la LfcinB s'adsorbe en dessous de la monocouche pour former un film plus épais. Les spectres obtenus in situ montrent également un changement de la composition des monocouches avant et après 20 mN/m.

Les variations dans la qualité des fromages affinés sont expliquées par plusieurs facteurs. Parmi ceux-ci, certains influencent la nature du microbiote des fromages, par exemple la présence de protéines antimicrobiennes natives du lait. Ce projet vise à déterminer la concentration et l'activité de la lactoferrine (Lf), de la lactopéroxydase (Lpo) et du lysozyme (Lz) au cours de la fabrication fromagère et dans différents types de fromages (Cheddar frais, Cheddar doux, Camembert et Suisse). Chaque protéine antimicrobienne fut analysée par deux méthodes. La technique de dosage d'immunoabsorption par enzyme liée (ELISA) fut employée pour chaque protéine. De plus, la Lpo fut mesurée par spectrométrie, la Lz par fluorescence et la Lf par HPLC. La mesure de Lf, Lpo et Lz dans le lait cru, le lait thermisé et le fromage frais a permis de déterminer qu'il n'y avait pas de différences significatives entre les teneurs dans le lait cru et le lait thermisé. Les résultats ont aussi démontré qu'il y a une quantité plus importante des trois antimicrobiens dans le fromage que dans le lait, et ce par un facteur de 2,78. Lors de l'étude des différents types de fromage commerciaux, diverses méthodes ont été comparées à l'ELISA. Il y a un manque de corrélation entre les valeurs obtenues par ELISA et celles obtenues par les autres méthodes. Les résultats révèlent que le fromage Camembert a une concentration moindre d'antimicrobiens que les trois autres fromages. Ceci semble être associé à une protéolyse plus avancée dans le Camembert. Les résultats ont aussi été rapportés par « gramme de protéines » et il y a tout de même des différences significatives entre les différents types de fromage. Ces résultats permettre une meilleure compréhension du passage des antimicrobiens présents dans le lait vers le fromage pour pouvoir, éventuellement, contrôler leur concentration. / Variations in cheese quality are explained by several factors. Among them, some influence the microbiota of cheeses such as native milk antimicrobial proteins. This project aims to determine the concentration and activity of lactoferrin (Lf), lactoperoxidase (Lpo) and lysozyme (Lz) during cheese making and in different cheese types (fresh Cheddar, mild Cheddar, Camembert and Suisse). Each antimicrobial protein was analyzed by two methods. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was employed the analysis of each protein. In addition, the Lpo was measured by spectrometry, the Lz by fluorescence and the Lf by HPLC. The measurement of Lf, Lpo and Lz in raw milk, thermized milk and fresh cheese revealed that there were no significant differences between level in raw milk and thermized milk. Results also showed that there is a higher quantity of the three antimicrobials in cheese than in milk by a factor of 2.78. When studying different types of commercial cheese, the various methods were compared to ELISA. There is a lack of correlation between the results obtained by ELISA and those of the other methods. Results show that Camembert cheese has lower levels of antimicrobials than the other 3 cheeses and is different from Swiss cheese for all antimicrobials. This seems linked to a higher degree of proteolysis in Camembert. The results were also reported by "grams of protein" and there are still significant differences between the different types of cheese. These results allow a better understanding of the transition of the antimicrobials present in the milk towards the cheese to be able, possibly, to control their concentration.

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