Le virus Zika est un pathogène qui a récemment retenu l’attention de la communauté scientifique suite à une importante éclosion en Amérique du Sud. Ce virus, peu étudié auparavant, peut causer des pathologies parfois graves chez les personnes infectées. Nous avons démontré que le virus Zika peut infecter les macrophages dérivés de monocytes. Plusieurs souches virales peuvent infecter les macrophages, mais certaines différences existent entre ces souches quant au taux d’infection et la cinétique de réplication. La réplication virale serait localisée autour du noyau de la cellule, comme ce qui est connu des autres membres de la famille des Flaviviridae. Les macrophages sont résistants aux effets cytopathiques du virus et peuvent donc jouer un rôle de réservoir viral à long terme. L’autophagie est un mécanisme nécessaire et important à la complétion du cycle viral du virus Zika dans les macrophages. Lors d’une co-infection entre le virus Zika et le VIH-1 dans les macrophages, il n’y a pas d’effet observé sur le taux d’infection et la réplication virale du VIH-1. Cependant, il y a une diminution de la réplication virale du virus Zika lors de ces co-infections. L’ajout de B18R, un inhibiteur de la réponse interféron de type I vient contrecarrer cette modulation, démontrant le mécanisme d’action de cette modulation. L’ajout d’un inhibiteur de la signalisation de la voie de l’interféron permet d’augmenter le taux d’infection des macrophages par le virus Zika. En résumé, le virus Zika peut infecter les macrophages et ces cellules pourraient être un réservoir viral à long terme, le virus a besoin de l’autophagie pour se répliquer et la production d’interféron de type I par les cellules qui sont infectées par un autre virus a un effet important sur la diminution de la réplication du virus Zika. / Zika virus is a pathogenic agent who recently gathered attention from the scientific community following a major outbreak in South America. This virus, who received little attention prior to this outbreak, can induce major pathologies in infected individuals. Our results indicate that Zika virus can infect monocyte-derived macrophages. Many viral strains can infect macrophages, but some differences were put in evidence, particularly regarding the infection rate and replication kinetic of the different strains. Viral replication occurs around the nucleus, which is expected and known from other viruses of the Flaviviridae family. Macrophages are resistant to the cytopathic effect of the virus, and can produce virus for many days. Autophagy is a necessary, and important cellular mechanism in completion of the virus life cycle. In the context of confections with Zika virus and HIV1, there is no effect observed in the infection rate and replication level of HIV-1. However, there is a decrease observed in the overall replication of Zika virus. The presence of B18R, a type I interferon inhibitor, restores a normal viral replication, demonstrating the mechanism behind this modulation. Addition of an inhibitor targeting the interferonmediated signalling pathway increases the infection rate of macrophages by Zika virus. In summary, Zika virus can infect macrophages, requires the autophagy signalling pathway to successfully replicate in macrophages, and is negatively impacted by interferon produced by its host cells infected by another virus.

Ma thèse porte sur l'étude des rôles régulateurs des GTPases Rho et de leurs effecteurs ROCK sur l'expression de ligands du système immunitaire, sur des cellules de mélanomes murins et humains ainsi que les conséquences sur le développement tumoral de modulateurs de la voie RhoA/ROCK. A l'heure actuelle, les traitements du mélanome métastatique ont une efficacité limitée, c'est pourquoi les nouvelles stratégies s'orientent vers l'immunothérapie notamment en recherchant de nouvelles molécules pharmacologiques capables d'amplifier les réponses immunes anti mélanome. Mon travail a porté sur l'étude de trois ligands de l'immunité modulés par la voie RhoA/ROCK : - Nous avons étudié la régulation du ligand MICA qui est exprimé sur des mélanomes humains, mais qui est reconnu par les cellules NK humaines et murines du système immun inné. En utilisant des statines, qui sont des inhibiteurs de l'activité des Rho, nous avons induit une surexpression membranaire de MICA sans toxicité cellulaire. Cette surexpression s'accompagne d'une sensibilisation des mélanomes à la lyse par les cellules NK. Elle induit également un ralentissement de leur croissance tumorale sous-cutanée en souris NMRI nu/nu et une diminution de l'implantation des métastases pulmonaires. Nous avons aussi montré que cette régulation de MICA induite par les statines ne dépendait pas de l'inhibition des GTPases Ras ou Rho mais de la voie de PPAR?. - Nous avons ensuite étudié la régulation de la molécule de costimulation CD70 par les GTPases Rho sur des mélanomes humains et son rôle dans ces tumeurs. Nous avons montré que les mélanomes primitifs expriment CD70, que cette expression diminue au cours de la maladie et que la GTPase RhoA et la voie des MAPK contrôlent positivement l'expression de CD70 sur nos lignées de mélanome humain. De façon surprenante, nous avons aussi montré que CD70 possède une fonction non immunologique dans ces tumeurs. En effet, la trimérisation de CD70 favorise l'invasion tumorale et l'apparition de métastases en activant la voie de signalisation BRAF/MEK/ERK/RhoE et en inhibant les fibres de stress d'actine et des points focaux d'adhésion. - Enfin, nous nous sommes intéressés aux conséquences de la modulation de FasL sur le développement tumoral du mélanome murin B16F10. Des travaux précédents de l'équipe ont montré que la protéine RhoA et ses effecteurs ROCK régulent de façon négative l'expression de FasL à la membrane des cellules B16F10. Nous avons étudié le rôle in vivo de la surexpression de FasL induite par l'inhibition de ROCK par le H1152. Nous avons mis en évidence un ralentissement de la croissance tumorale in vivo chez les souris immunocompétentes. Ce contrôle du développement tumoral est dépendant de la voie Fas/FasL et de l'activité des lymphocytes TCD8+ et de l'IFN-?. De plus, l'inhibition de ROCK réduit le nombre de métastases pulmonaires sans intervention de la réponse immune adaptative. L'ensemble de mes travaux montre que le ciblage de la voie des GTPases Rho et de leurs effecteurs ROCK constitue une approche nouvelle pour amplifier les réponses immunes protectrices innées et adaptatives anti mélanome, suggérant que des inhibiteurs de cette voie pourraient être envisagés dans de nouveaux protocoles d'immunothérapie du mélanome / My thesis focuses on the study of the regulatory roles of Rho GTPases and their effectors ROCK on the expression of immune system ligands in murine and human melanoma cell lines and the impact on tumor development of modulators of the RhoA/ROCK pathway. Current therapies for metastatic melanoma have poor efficiency. It is the reason why new immunotherapeutic strategies are developed for to find new pharmacological molecules that could improve anti-melanoma immune responses. My work is based on the study of three immune ligands: - We studied the regulation by Rho GTPases of MICA ligand expression in human melanoma cell lines and their recognition by NK cells. Using statins, inhibitors of Rho GTPases activity, we have induced MICA over-expression without any cell toxicity. This MICA over-expression enhanced melanoma cells sensitivity to NK cells lysis, then reduced subcutaneous tumor growth in NMRI nu/nu mice and also decreased pulmonary metastases implantation. We also showed that statins-induced MICA over-expression was not linked to Ras or Rho GTPases inhibition but to PPAR? pathway. - Then, we studied the expression and the function of a co-stimulatory molecule, CD70, and its regulation by the Rho pathway in human melanomas. We demonstrated that the RhoA GTPase and MAPK pathway positively regulate CD70 expression in our melanoma cell lines. Surprisingly, we observed a non-immunological function of CD70 in melanoma. Indeed, CD70 trimerization enhanced melanomas invasion and metastatic capacities through an activation of BRAF/MEK/ERK/RhoE pathway, which inhibited stress fibers and focal adhesions. - Finally, we analyzed the consequences of FasL over-expression on B16F10 murine melanoma development in vivo. Our previous studies have showed that RhoA/ROCK pathway negatively regulates membrane FasL expression on B16F10 cells. We studied in vivo the role of this FasL over-expression induced by ROCK inhibitor H1152, on melanoma cells. We showed tumor growth shrinkage in immunocompetent mice, when B16F10 cells were pretreated with H1152. The Fas/FasL pathway and the activity of TCD8+ cells and IFN- ? induced this tumor slowing down. Moreover, ROCK inhibition induced a reduction of pulmonary metastases implantation independently of T lymphocytes response. Altogether, my work showed that targeting Rho GTPases/ROCK pathway could be interesting in order to improve innate and adaptative anti melanoma immune responses, suggesting that inhibitors of this pathway could be envisaged in new melanoma immunotherapy protocols

La maladie d’Alzheimer (MA) est un désordre neurologique progressif et irréversible caractérisé par l’accumulation de peptides β-amyloïdes, de plaques amyloïdes et de dégénérescence neurofibrillaires. L’inflammation et des altérations du système immunitaire ont été reliées à la MA, suggérant que le système immunitaire périphérique pourrait jouer un rôle pendant la phase asymptomatique de la maladie. Les lymphocytes natural killer et les neutrophiles (PMN) participent à la surveillance immune innée et leurs rôles demeurent controversés dans la MA. Nous avons étudié les changements phénotypiques et fonctionnels des cellules NK et des PMN du sang périphérique dans une cohorte de patients composée de personnes âgées en bonne santé, de patients amnestic mild cognitive impairment (aMCI) et de personnes atteintes de la MA à un stade léger (mMA). L’analyse phénotypique des lymphocytes NK a révélé des différences d’expression de CD16 (augmenté chez les patients mMA), de NKG2A (diminué chez les patients aMCI), et des TLR2 et TLR9 (tous deux diminués chez les patients mMA). Les tests fonctionnels ont révélé que l’activité cytotoxique des lymphocytes NK ainsi que leur capacité de dégranulation étaient inchangés dans les 3 groupes de patients. Au contraire, l’expression du récepteur CD95 était augmentée chez les aMCI et mMA et l’expression de granzyme B et la production de cytokines telles que TNFα et IFNγ étaient augmentées chez les aMCI mais pas chez les patients mMA. Le chimiotactisme induit par la chimiokine CCL19 et non par CC21 était diminué chez les aMCI et mMA, malgré l’augmentation de l’expression du CCR7 chez les patients aMCI. L’analyse des PMN révèle une augmentation spécifique de l’expression de CD177 chez les patients mMA. La stimulation à l’IL-8 entraine l’augmentation attendue de l’intégrine CD11b à la surface des PMN des patients âgés contrôles, mais les patients aMCI et mMA ne répondent pas. La baisse de l’expression des récepteurs CD14 et CD16 a été observée sur les PMN des patients mMA uniquement. Au contraire, seul les PMN des patients aMCI présentent une baisse de l’expression du marqueur CD88 et du TLR2. La phagocytose est différentiellement diminuée dans les PMN des patients aMCI et mMA tandis que l’ingestion de particules de Dextran est absente uniquement chez les patients mMA. Le killing contre Candida albicans est sévèrement diminué dans les groupes aMCI et mMA, alors que la production de radicaux libres est seulement diminuée au stade mMA. La production de cytokines inflammatoires (TNFα, IL-6, IL-1β, IL-12p70) et de chimiokines (MIP-1α, MIP-1β, IL-8) en réponse à une stimulation au LPS est très basse chez les patients aMCI et absente chez les mMA. Ces résultats suggèrent un état d’activation des cellules NK chez les patients aMCI qui pourrait refléter une réponse immunitaire active dirigée contre une agression encore non identifiée. L’altération différentielle des capacités de réponse à des agressions pathologiques des PMN des patients aMCI et mMA pourrait se traduire par une baisse progressive de la réponse immune associée au développement de la MA.

L'immunité antitumorale induite par les cellules dendritiques intratumorales contribue à l'efficacité de la chimiothérapie à base d'anthracycline dans le cancer. Nous avons identifié un allèle de perte de fonction du gène codant pour le récepteur formyl peptide 1 (FPR1) qui était associé à une faible survie sans métastases et à une survie globale chez les patientes atteintes d'un cancer du sein et colorectal recevant une chimiothérapie adjuvante.Les effets thérapeutiques des anthracyclines ont été abrogés chez les souris Fpr1 (-/-) porteuses de tumeurs en raison d'une immunité antitumorale altérée. Les cellules dendritiques déficientes en Fpr1 ne parvenaient pas à s'approcher des cellules cancéreuses mourantes et, en conséquence, ne pouvaient pas déclencher l'immunité des cellules T antitumorales.Des expériences réalisées dans un dispositif microfluidique ont confirmé que FPR1 et son ligand, l'annexine-1, favorisaient des interactions stables entre les cellules cancéreuses mourantes et les leucocytes humains ou murins.Nous avons également étudié la contribution possible de FPR1 à l'efficacité d'une combinaison de mitoxantrone (MTX) et cyclophosphamide (CTX) pour le traitement du cancer du sein induit par l'hormone.Le cancer du sein induit par une combinaison d'acétate de médroxyprogestérone (MPA) et de 7,12-diméthylbenz [a] anthracène (DMBA) a pu être traité avec succès avec MTX plus CTX dans la mesure où la croissance tumorale était retardée et la survie globale augmentée (par rapport à commandes traitées uniquement avec un véhicule).Toutefois, l'efficacité thérapeutique de la thérapie combinée a été complètement abolie lorsque les récepteurs FPR1 ont été bloqués au moyen de la cyclosporine H (CSH). Des études génétiques futures sur les cancers du sein traités par chimiothérapie néoadjuvante sont nécessaires pour valider ces résultats au niveau clinique.L'ensemble de ces résultats mettent en évidence l'importance de FPR1 dans les réponses immunitaires anti-cancéreux induites par la chimiothérapie. / Antitumor immunity driven by intratumoral dendritic cells contributes to the efficacy of anthracycline-based chemotherapy in cancer. We identified a loss-of-function allele of the gene coding for formyl peptide receptor 1 (FPR1) that was associated with poor metastasis-free and overall survival in breast and colorectal cancer patients receiving adjuvant chemotherapy.The therapeutic effects of anthracyclines were abrogated in tumor-bearing Fpr1(-/-) mice due to impaired antitumor immunity. Fpr1-deficient dendritic cells failed to approach dying cancer cells and, as a result, could not elicit antitumor T cell immunity.Experiments performed in a microfluidic device confirmed that FPR1 and its ligand, annexin-1, promoted stable interactions between dying cancer cells and human or murine leukocytes.We investigated also the possible contribution of FPR1 to the efficacy of a combination of mitoxantrone (MTX) and cyclophosphamide (CTX) for the treatment of hormone-induced breast cancer.Breast cancer induced by a combination of medroxyprogesterone acetate (MPA) and 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) could be successfully treated with MTX plus CTX in thus far that tumor growth was retarded and overall survival was extended (as compared to vehicle-only treated controls).However, the therapeutic efficacy of the combination therapy was completely abolished when FPR1 receptors were blocked by means of cyclosporin H (CsH). Future genetic studies on neoadjuvant chemotherapy-treated breast cancers are warranted to validate these findings at the clinical level.Altogether, these results highlight the importance of FPR1 in chemotherapy-induced anticancer immune responses.

L’interaction entre les cellules souches neuronales et les cellules du système immunitaire lors d’une condition pathologique n’est pas bien caractérisée. D’ailleurs, la communauté scientifique s’interroge sur l’implication des cellules du système immunitaire inné sur la régénérescence du système nerveux central à la suite d’un accident aigu ou d’une maladie neurodégénérative. L’objectif de cette thèse est d’investiguer l’implication d’un récepteur de type Toll, plus précisément le récepteur TLR2, sur la modulation de la neurogenèse lors d’un accident aigu et dans le cadre d’une maladie neurodégénérative. Les récepteurs de type Toll font partie du groupe de récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR), activés à la suite d’une infection ou d’une blessure. D’ailleurs après une ischémie cérébrale, on peut observer par bioimagerie in-vivo une forte induction du récepteur TLR2. L’expression du récepteur de type TLR2 dans les neurones est principalement associée à deux régions : la région sous-ventriculaire du cerveau antérieur (SVZ) et la région sous-granulaire de l’hippocampe (SGZ). Nestin, une protéine impliquée dans la formation des filaments intermédiaires, est aussi fortement exprimée dans cette région par les cellules souches neuronales. C’est pourquoi nestin est utilisé comme marqueur de neurogenèse. Pour le premier chapitre de ma thèse, nous avons généré un nouveau modèle murin afin d’étudier la neurogenèse avec l’imagerie par bioluminescence. En effet, la souris Nestin-luc/GFP s’avère un excellent modèle qui permet de suivre l’expression de nestin dans les cellules progénitrices neuronales (NPCs) après une ischémie cérébrale en temps réelle. Une forte expression de nestin fut observée par imagerie à 1, 3 et 7 jours suivant l’ischémie cérébrale. Pour le deuxième chapitre de ma thèse, nous avons estimé la population des cellules progénitrices neuronales chez les souris TLR2 KO à la suite d’une ischémie cérébrale. Chez ces souris, nous avons pu observer par immunofluorescence une baisse significative du nombre de cellules progénitrices neuronales dans la région du SVZ et du SGZ. Ceci suggère que la présence du récepteur TLR2 est nécessaire afin de maintenir la survie des NPCs suite à une ischémie cérébrale. Pour le troisième chapitre de ma thèse, nous avons caractérisé un modèle murin de démence fronto-temporale (FTLD), la souris TDP-43A315T. Afin de mieux comprendre le rôle du récepteur TLR2 lors de la neurodégénérescence nous avons croisé la souris TLR2-luc/GFP à la souris TDP-43A315T. Dans ce modèle murin de FTLD, les symptômes cognitifs apparaissent vers l’âge de 7 à 8 mois et sont associés à une forte activation du récepteur TLR2. De plus, toujours grâce à l’imagerie in-vivo effectuée durant les 36 premiers mois de leur vie, on a pu observer des niveaux supérieurs d’activation du récepteur TLR2 durant la phase pré-symptomatique de la maladie comparée à la phase post-symptomatique. Par la suite, à l’aide de marqueurs de neurogenèse (Nestin, DCX et Ki-67) un nombre de NPCs plus élevé fut observé par immunofluorescence chez les souris plus jeunes ce qui suggère une corrélation entre le niveau d’activation du récepteur TLR2 et la neurogenèse. En se basant sur ces évidences, je peux conclure que ma thèse a démontré l’importance de la voie signalétique du récepteur TLR2 après un accident cérébrale aigu et lors de troubles neurodégénératifs. / Interaction between neural progenitors and immune cells under pathological conditions is not well understood. Still now researchers debate role of innate immune cells in the regeneration of central nervous system following acute injury and neurodegeneration. Our aim is to investigate the role of Toll-like receptors in the modulation of neurogenesis followed by acute and chronic neurodegeneration. Nestin, an intermediate filament protein, is expressed by neural stem and progenitor cells. Nestin is considered as a potential marker for neurogenesis. The two neurogenic niches of the brain, sub ventricular zone (SVZ) and sub granular zone (SGZ) produce neural stem cells throught the life. We have characterized transgenic mice to study neurogenesis by in vivo bioluminescence imaging. Our mouse model Nestin-luc/GFP mouse is an excellent tool to track the neural progenitors expression after stroke. In vivo bioluminescence imaging revealed that robust expression of nestin signal at 1 day, 3 days and 7 days following stroke. Toll like receptors are the member of pattern recognition receptors, they activated upon infection and injury. In recent years, expression of toll like receptors in neuronal cells is well established in the two neurogenic regions of the brain. Activation of TLR-2 signal has been observed previously by in vivo imaging followed by stroke. Stroke induced neurogenesis is well characterised in these two neurogenic regions. Secondly, we have studied the role of TLRs in the modulation of neurogenesis followed by ischemia. In the TLR2KO transgenic mice, following cerebral ischemia, neural progenitors population were declined in both neurogenic regions compared to the wild type mice indicating TLR2 is necessary for the survival of neural progenitors in the ischemic brain. TDP-43A315T is a transgenic mouse is valid mouse model of Fronto temporal dementia. The onset of symptom will start at the age of 7-8 months. In this mouse, we have seen the higher expression of TLR2 in comparison to the wild type mice. Regarding the pivotal role of TLR2 signalling in neurodegeneration, we have studied their impact on neurogenesis in the FTLD mouse model. In TLR-2 GFP/luc X TDP- 43A315T mice mouse model, TLR-2 expression was studied by in vivo imaging from 3months to 36 months. Longitudinal in vivo imaging showed an elevation of TLR2 signal in the pre-symptomatic phase of disease when compared to the post symptomatic transgenic mice. Next we have done an immunofluorescence analysis to estimate the NPGs population in the young and old mice. Up regulation of neurogenesis markers such as nestin, DCX and Ki-67 were observed in the young transgenic mice compared to the old mice which suggesting that TLR2 mediates the modulation of neurogenesis. In this thesis work first, we have developed a mouse model to study neurogenesis by in vivo imaging. Secondly we have showed the importance of TLR2 in the regulation of neurogenesis after ischemia induction. Finally, mediation of TLR2 in the neurodegeneration and neurogenesis was observed. Our results showed the importance of TLR2 signalling in the brain following acute and chronic neurodegenerative conditions.

La flore intestinale, composée de l’ensemble des microorganismes retrouvés dans le tractus digestif, joue un rôle essentiel dans le développement et l’homéostasie du système immunitaire. Son altération est associée à de multiples maladies inflammatoires ayant des répercussions non seulement à l’intestin, mais bien dans l’ensemble de l’organisme. Les causes de cette dérégulation restent toutefois méconnues. Parmi les multiples facteurs susceptibles de moduler sa composition, on retrouve plusieurs enzymes bactéricides produites à l’intestin. L’une de ces protéines, la phospholipase A2-IIA sécrétée (sPLA2-IIA), est fortement surexprimée en condition inflammatoire. Nous avons émis l’hypothèse que la surexpression de la sPLA2-IIA à l’intestin au cours de maladies inflammatoires pourrait altérer la composition de la flore intestinale, contribuant ainsi à la physiopathologie de ces maladies. L’utilisation de souris surexprimant la sPLA2-IIA humaine (sPLA2-IIATGN) nous a permis d’observer l’apparition spontanée d’un désordre immunitaire encore jamais caractérisé dans ce modèle. En nous intéressant à l’impact de cette enzyme sur la flore intestinale, nous avons pu identifier plusieurs altérations dans le microbiome de ces souris. Nos résultats suggèrent également que l’environnement, et plus spécifiquement le microbiote intestinal, joue un important rôle dans le développement de ce désordre immunitaire. Nos résultats suggèrent que la modulation de l’inflammation systémique par la sPLA2-IIA est dépendante de la flore intestinale. / The mammalian digestive tract harbors trillions of microorganisms that collectively form the intestinal microbiota. This flora has been shown to play a prominent role in the development and homeostasis of the immune system. As such, its alteration was associated with a wide array of inflammatory diseases with intestinal and systemic afflictions. However, the cause of this unbalance remains poorly understood. While the intestinal flora may be regulated by a large number of environmental factors, multiple endogenous intestinal enzymes have been shown or proposed to play an important part in the shaping of its composition. One of those enzymes, the secreted phospholipase A2-IIA (sPLA2-IIA), possesses great bactericidal properties and is overexpressed during multiple inflammatory disorders. We hypothesized that the overexpression of sPLA2-IIA in the intestine during inflammatory processes could alter the composition of the intestinal microbiota, thereby contributing to the pathophysiology of those diseases. To verify this hypothesis, we used transgenic mice overexpressing the human sPLA2- IIA (sPLA2-IIATGN) and observed a yet uncharacterized spontaneous immune disorder in this model. We aimed to evaluate the impact of sPLA2-IIA on the intestinal flora in this model. We identified multiple alterations in the microbiome of sPLA2-IIATGN mice. Our results also suggest that the environment, and more specifically the intestinal microbiota, play a prominent role in the development of this immune disorder. Our results suggest that the modulation of systemic inflammation by sPLA2-IIA is dependent upon the intestinal flora.

Le système immunitaire végétal se base sur la présence de récepteurs intracellulaires de type NB-LRR afin de se défendre contre les pathogènes. Un NB-LRR active la réponse immunitaire suite à la détection de protéines d’origine pathogénique nommées effecteurs. Les NB-LRR se divisent en différents groupes selon le domaine N-terminal qu’ils possèdent soit un CC, un TIR ou un CC[indice inférieur R]. Les CC[indice inférieur R]-NB-LRR forment une famille atypique de NB-LRR qui se divise elle-même en deux groupes, les ADR1-like et les NRG1-like. Contrairement aux NB-LRR dits classiques, les CC[indice inférieur R]-NB-LRR ne détectent pas d’effecteurs provenant des pathogènes. En fait, les CC[indice inférieur R]-NB-LRR seraient des NB-LRR auxiliaires nécessaires à la cascade de signalisation de la réponse immune, enclenchée suite à la détection d’un effecteur par un NB-LRR classique. Les CC[indice inférieur R]-NB-LRR se distinguent également des NB-LRR classiques de par leur niveau de conservation chez les végétaux : chaque plante possède au minimum un type de CC[indice inférieur R]-NB-LRR. Alors qu’ADR1-like est ubiquitaire chez les monocotylédones et les dicotylédones, NRG1-like est absent du génome des monocotylédones et de quelques dicotylédones. L’absence de NRG1-like corrèle avec l’absence de TIR-NB-LRR dans ces génomes et propose un lien fonctionnel exclusif entre les NRG1-like et les TIR-NB-LRR. L’omniprésence du groupe ADR1-like et des CC-NB-LRR suggère aussi un lien fonctionnel entre ces deux groupes. Il est toutefois possible que la fonction de NB-LRR auxiliaire des groupes ADR1-like et NRG1-like soient partiellement redondante, ou additive, pour la réponse immune. Afin de confirmer la nécessité des CC[indice inférieur R]-NB-LRR pour les réponses de défenses médiées par les NB-LRR et pour en plus discriminer les besoins entre les groupes ADR1-like et NRG1-like, des mutants adr1 ou nrg1 ont été testés quant à leur capacité à compléter la réponse de défense initiée par différents NB-LRR classiques. Les résultats préliminaires suggèrent que le groupe ADR1-like n’est pas nécessaire pour les réponses de défense médiée par les TIR-NB-LRR RPS6 chez Arabidopsis thaliana et N chez Nicotiana benthamiana. L’absence de l’un des deux représentants NRG1-like d’Arabidopsis thaliana, soit NRG1.1 ou NRG1.2, n’affecte aucune réponse de défense médiée par un TIR-NB-LRR ou un CC-NB-LRR. L’homologie élevée de 73% entre ces deux protéines indique possiblement une fonction redondante. Un double mutant nrg1 a été produit afin de poursuivre l’investigation de la fonction du groupe NRG1-like dans les réponses de défense. Puisque les gènes NRG1.1 et NRG1.2 sont arrangés en tandem dans le génome d’Arabidopsis thaliana, une méthode optimisée permettant de sélectionner un événement de recombinaison méiotique rare entre deux allèles mutantes nrg1.1 et nrg1.2 a été choisie pour produire le double mutant. Avec une méthode indirecte, il a été démontrée que la lignée AB possède un évènement de recombinaison entre ces deux allèles mutantes puisqu’une plante double mutant nrg1 homozygote a été récupérée dans sa progéniture. Les résultats préliminaires obtenus avec cette plante double mutant nrg1 homozygote suggèrent que le groupe NRG1-like serait nécessaire pour la réponse de défense médiée par le TIR-NB-LRR RPS4 et suggèrent également qu’une plante dépourvue de NRG1-like aurait un phénotype de croissance retardée ou ralentie, en plus d’une morphologie foliaire distincte. Il est également connu que le domaine N-terminal CC[indice inférieur R] des CC[indice inférieur R]-NB-LRR d’Arabidopsis thaliana peut à lui seul induire une réponse de défense lorsque surexprimé chez N.benthamiana. Afin de trouver des protéines interagissant avec ce domaine et de caractériser sa localisation cellulaire, des plantes d’Arabidopsis thaliana transgéniques surexprimant le domaine CC[indice inférieur R] de NRG1.1 couplé à la eYFP:HA ont été produites. Le matériel obtenu permettra spécialement de poursuivre la caractérisation du groupe NRG1-like sur lequel peu d’information est disponible à ce jour. Il sera également possible de déterminer le niveau de redondance entre les deux groupes de CC[indice inférieur R]-NB-LRR quant à leur nécessité pour les réponses de défenses médiées par les NB-LRR suite à la production d’un quintuple mutant adr1/nrg1 d’Arabidopsis ne possédant plus aucun CC[indice inférieur R]-NB-LRR.

À l'intérieur des voies de sécrétion, la famille des pro-protéines convertases (PCs) clive des précurseurs protéiques inactifs à une paire d'acides aminés basiques, ce qui résulte en la génération d'une multitude de peptides biologiquement actifs. Parmi la famille des PCs, PC1/3 et PC2 sont bien connues pour leur expression préférentielle chez les cellules neuro-endocriniennes. Cependant, de nombreuses données obtenues par le laboratoire démontrent l'expression basale de toutes les PCs, incluant PC1/3 et PC2, dans les ganglions lymphatiques, la rate et le thymus. Le but du projet était d'analyser l'expression des PCs, en mettant l'emphase sur PC1/3 et PC2 dans des conditions qui miment une infection bactérienne en utilisant le lipopolysaccharide (LPS), connu pour activer les cellules immunitaires via les récepteurs de type Toll. Une analyse spatiale et temporelle des tissus de rats contrôles et traités au LPS a été menée en utilisant l'hybridation in situ, le buvardage de type Northern, la spectrométrie de masse et des tests antibactériens. Concentrant l'étude sur la rate, l'expression basale de PC1/3 a été retrouvée dans la pulpe rouge et la zone marginale, ce qui suggère une expression par les macrophages. Le traitement au LPS a provoqué des changements significatifs dans l'expression de PC1/3 dont une induction chez les lymphocytes B des centres germinatifs. L'expression de PC2, indétectable dans la rate d'animaux contrôles, a été également induite dans les centres germinatifs suite à l'injection de LPS. La proenképhaline, un substrat connu de PC1/3 et PC2, a été induite dans la zone marginale suivant le traitement au LPS. L'analyse en spectrométrie de masse des extraits de rate a démontré la présence du peptide antibactérien enkélytine. L'utilisation de lignées cellulaires immunitaires a permis d'identifier un modèle exprimant PC1/3, soit la lignée de macrophage alvéolaire NR8383. Les expériences in vivo effectuées avec des souris knock-out (KO) pour PC1/3 ou PC2 exposées au LPS ont démontré des différences significatives au niveau de leur survie et de la variation de leur pression artérielle moyenne comparé aux souris de type sauvage. Notre étude confirme que l'expression de PC1/3 et PC2 n'est pas restreinte aux neurones et aux cellules endocriniennes, mais se retrouve aussi chez des macrophages et des lymphocytes. De plus, une plasticité de l'expression des PCs dans les cellules immunitaires a été observée dans des conditions simulant une infection bactérienne. L'ensemble de ces données implique clairement les convertases PC1/2 et PC2 dans la réponse immunitaire.

The proprotein convertases (PC) are endoproteolytic enzymes essential for the generation of bioactive peptides.The production of KO mice for some of these PCs has allowed us to identify many different physiological phenotypes for these enzymes. PC1/3 is traditionally classified as a neuroendocrine enzyme. This has been supported by many studies performed in PC1/3 KO mice, as well as human subjects deficient in PC1/3, where this enzyme is responsible for the cleavage of neuroendocrine substrates, namely POMC and pro-insulin. However, very little research has been done on the potential role of PC1/3 in the immune system, despite evidence of its expression in immune cells, including macrophages. In the present study, we investigate the PC1/3 KO mouse through an immunological aspect. Our laboratory has previously reported an increase in the expression of PC1/3 in the spleen following LPS stimulation. By examining closely the spleen, we observed a splenomegaly of the organ as well as a marked disorganization of the regions of the spleen, such as an invasion of the red pulp with the marginal zone, which may affect the proper immunological response. Labeling of different immune cells demonstrated a decrease in the dendritic cells present in the PC1/3 KO mouse spleen. An interesting phenotype that was observed in the PC1/3 KO mice is their sensitivity to an LPS-induced septic shock, which was evident by an exaggerated secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-1[bêta] et TNF-[alpha]). Furthermore, the present study identifies the macrophages as major contributors to the unbalanced secretion observed in the PC1/3 KO mice since we report an increase in cytokine secretion in isolated peritoneal macrophages. We also demonstrate a link with the adaptive immune system. A massive secretion of IFN-[gamma] was measured in the PC1/3 KO mouse plasma, supporting the notion that the Th1 pro-inflammatory pathway is predominant in these mice following an LPS challenge. Taking into account these results, the study presented identifies a novel and unconventional role of PC1/3 in the regulation of the innate immune system.

La période de parturition est une période à risque pour les vaches laitières. En effet, dû à la production de lait, la vache passe en quelques heures d’une demande nutritionnelle faible à une forte demande et se retrouve en balance énergétique négative. Pour répondre à la demande, les vaches laitières mobilisent leurs réserves corporelles entrainant ainsi d’importants dysfonctionnements métaboliques. Suite à ces perturbations, la vache laitière connaît un état naturel d’immunodépression qui est associé à une susceptibilité élevée aux maladies infectieuses. L’objectif de la recherche de ce mémoire était d’évaluer l’effet de l’administration d’un inhibiteur de la sécrétion de prolactine au cours de la première semaine suivant le vêlage, sur la production laitière et sur le profil métabolique et les fonctionsimmunitaires des vaches laitières. Cette recherche s’inscrit dans un programme de recherche visant à diminuer l’incidence des problèmes de santé durant la période de transition de la gestation à la lactation. Vingt-deux vaches laitières en fin de gestation ont été réparties en 2 groupes selon leur parité et leur production laitière des 100 premiers jours de la lactation précédente. Chaque groupe a reçu 8 injections i.m. soit d’un inhibiteur de prolactine, la quinagolide, soit d’eau. La première injection a été administrée juste après le vêlage et les 7 suivantes à 12h d’intervalle. La production laitière, la consommation alimentaire, certains métabolites sanguins et hormones sanguines ainsi que quelques fonctions immunitaires ont été mesurés sur chacune des vaches. La concentration en prolactine était plus faible du jour 2 au jour 5 mais plus élevée aux jours 10 et 28 pour les vaches traitées à la quinagolide en comparaison aux vaches contrôles. La production laitière était plus faible chez les vaches traitées du jour 2 au jour 6 en comparaison aux vaches contrôles (24.3 ± 6.4 kg/j vs 34.8 ± 4.1 kg/j). Cependant aucun effet résiduel n’a été observé sur la production laitière au-delà du jour 6. Les concentrations en glucose et en calcium étaient plusélevées chez les vaches traitées à la quinagolide alors que leur concentration en β-hydroxybutyrate était plus faible que pour les vaches contrôles. Les concentrations sanguines en acides gras non-estérifiés, en urée, et en phosphore n’ont pas été influencées par les traitements. Aux jours 2 et 5, la flambée oxydative des polymorphonucléaires était plus élevée pour les vaches traitées à la quinagolide que pour les vaches contrôles. Les cellules vaches contrôles ont eu un meilleur taux de prolifération que les vaches traitées à la quinagolide. Cependant, cette différence a persisté au-delà du traitement suggérant un effet vache plutôt qu’un effet réel du traitement. Aucun effet du traitement n’a été observé concernant la phagocytose. En conclusion, la réduction de la concentration sanguine en prolactine durant la période postpartum permet de réduire la production laitière durant la première semaine de lactation, sans pour autant affecter la productivité du reste de la lactation. Cette réduction de production laitière juste après le vêlage permet une transition plus graduelle de la gestation à la lactation et conduit à une réduction du stress métabolique et à une amélioration de certains aspects du système immunitaire pendant cette période.