L'hydrolyse pepsique de l’hémoglobine bovine purifiée ou à partir d'un coproduit des abattoirs : le cruor, peut être considérée comme une voie importante d'obtention de peptides antibactériens. Une étude cinétique nous a permis de maîtriser cette hydrolyse et de déterminer un modèle mathématique capable de prédire la concentration de chaque peptides antibactériens des deux familles de peptides α 1-32 et α 107-141 et ceux pour un intervalle de température de 15-37°C, de pH de 3,5-5,5 et de rapport enzyme/substrat de 1/5-1/20. Le calcul des énergies d'activation pour les différentes réactions impliquées dans le mécanisme était effectué grâce à l’équation d’Arrhenius qui a permis d’étudier l’effet de la température sur les différents coefficients cinétiques. L’effet du pH et du rapport E/S était également étudié et le modèle trouvé a démontré une augmentation linéaire de la vitesse d’hydrolyse en diminuant le pH (entre 3,5 et 5,5) et une vitesse invariable avec le rapport E/S (1/5-1/20). L'étude de la relation structure-fonction des peptides antibactériens α 1-32 et α 137-141 a été effectuée grâce à un suivie de la cinétique de K+ extracellulaire en présence de Lisrea innocua et le déterminant antibactérien minimal a été déterminé pour le peptide α 137-141. La possibilité de valoriser les peptides antibactérien α 1-32 et α 137-141 dans un emballage bioactif pour la conservation des aliments contre le développement de bactéries pathogènes a été étudiée par l'adsorption de ces peptides en surface d'un film de polyéthylène basse densité, traité avec le plasma froid. / The pepsin hydrolysis of purified bovine hemoglobin or from a co-product of slaughterhouses: cruor, can be considered as an important route for obtaining antibacterial peptides. A kinetic study has allowed us to control the hydrolysis and to determine a mathematical model able to predict the concentration of each antibacterial peptides of two families of peptides α 1-32 and α 107-141 and those of an interval of temperature 15-37°C, of pH 3,5-5,5 and ratio enzyme/substrate of 1/5-1/20 . The calculation of activation energies for the different reactions involved in the mechanism was made by the Arrhenius equation, which was used to study the effect of temperature on the various kinetic coefficients. The effect of pH and ratio E / S was also studied and the model found showed a linear increase in the rate of hydrolysis decreasing the pH ( between 3,5 and 5,5 ) and an invariable speed with the ratio E / S ( 1/5-1/20 ). The study of the structure-function relationship of antibacterial peptides α 1-32 and α 137-141 was carried out thanks to a followed the kinetics of extracellular K + in the presence of Lisrea innocua and the minimal determinant antibacterial was determined for the peptide α 137-141. The possibility to recovery the antibacterial peptides α 1-32 and α 137-141 in to a bioactive food packaging against the growth of pathogenic bacteria has been studied by the adsorption of these peptides on the surface of a low density polyethylene film treated with cold plasma.

À l'intérieur des voies de sécrétion, la famille des pro-protéines convertases (PCs) clive des précurseurs protéiques inactifs à une paire d'acides aminés basiques, ce qui résulte en la génération d'une multitude de peptides biologiquement actifs. Parmi la famille des PCs, PC1/3 et PC2 sont bien connues pour leur expression préférentielle chez les cellules neuro-endocriniennes. Cependant, de nombreuses données obtenues par le laboratoire démontrent l'expression basale de toutes les PCs, incluant PC1/3 et PC2, dans les ganglions lymphatiques, la rate et le thymus. Le but du projet était d'analyser l'expression des PCs, en mettant l'emphase sur PC1/3 et PC2 dans des conditions qui miment une infection bactérienne en utilisant le lipopolysaccharide (LPS), connu pour activer les cellules immunitaires via les récepteurs de type Toll. Une analyse spatiale et temporelle des tissus de rats contrôles et traités au LPS a été menée en utilisant l'hybridation in situ, le buvardage de type Northern, la spectrométrie de masse et des tests antibactériens. Concentrant l'étude sur la rate, l'expression basale de PC1/3 a été retrouvée dans la pulpe rouge et la zone marginale, ce qui suggère une expression par les macrophages. Le traitement au LPS a provoqué des changements significatifs dans l'expression de PC1/3 dont une induction chez les lymphocytes B des centres germinatifs. L'expression de PC2, indétectable dans la rate d'animaux contrôles, a été également induite dans les centres germinatifs suite à l'injection de LPS. La proenképhaline, un substrat connu de PC1/3 et PC2, a été induite dans la zone marginale suivant le traitement au LPS. L'analyse en spectrométrie de masse des extraits de rate a démontré la présence du peptide antibactérien enkélytine. L'utilisation de lignées cellulaires immunitaires a permis d'identifier un modèle exprimant PC1/3, soit la lignée de macrophage alvéolaire NR8383. Les expériences in vivo effectuées avec des souris knock-out (KO) pour PC1/3 ou PC2 exposées au LPS ont démontré des différences significatives au niveau de leur survie et de la variation de leur pression artérielle moyenne comparé aux souris de type sauvage. Notre étude confirme que l'expression de PC1/3 et PC2 n'est pas restreinte aux neurones et aux cellules endocriniennes, mais se retrouve aussi chez des macrophages et des lymphocytes. De plus, une plasticité de l'expression des PCs dans les cellules immunitaires a été observée dans des conditions simulant une infection bactérienne. L'ensemble de ces données implique clairement les convertases PC1/2 et PC2 dans la réponse immunitaire.

Les premiers stades larvaires chez l’huitre creuse, nommée Magallana gigas, constituent une étape clé du bondéroulement du parcours zootechnique et également pour la pérennisation de la production en écloserie. Dans l’objectifde réduire les mortalités observées en écloserie, nous avons recherché de nouveaux peptides antimicrobiens. Larecherche de ces PAM a été réalisée à partir de deux organismes marins, le poisson-lion invasif en mer des caraïbes,Pterois volitans, et la seiche commune présente sur les zones ostréicoles, Sepia officinalis. La recherche de PAM a étéréalisée préférentiellement à partir de transcriptomes de novo obtenus chez ces deux animaux. Chez le poisson lion, àpartir de BLAST, 7 transcrits codant pour des PAM ont été identifiés. Quatre de ces PAM partagent de fortes homologiesde séquences (>90% d’identité) avec des PAM riches en cystéines proches de l’hepcidine, la LEAP-2, la NK-lysine et la bdéfensineidentifiées chez d’autres poissons. Les 3 autres transcrits annotés pteroicidines A, B et C codent pour despeptides apparentés aux piscidines. La présence de la b-défensine et de la pteroicidine a codée par la pteroicidine A a puêtre confirmée dans les extrait de peau du poisson lion par spectrométrie de masse. Une étude approfondie a été menéesur deux formes amidée et non amidée de la ptéroicidine a ainsi que sur plusieurs peptides de différentes tailles issusdes pteroicidines B et C. Les résultats ont permis de mettre en évidence une relation entre la structure, l’amidation et lesactivités antibactériennes et hémolytiques de ces différentes ptéroicidines. Sur le modèle Sepia officinalis, par lesapproches classiques couplant la purification et les tests antibactériens ou par des approches utilisant les BlAST, aucunPAM n’a été mis en évidence. Nous avons donc développé une approche plus originale qui repose sur le « design » depeptides à partir du transcriptome. A partir de 811 petits peptides sans cystéines issus de la base de données APD, nousavons déterminé des critères récurrents concernant la charge, l’hydrophobicité et la composition en acides aminés. Surla base de ces critères et en s’appuyant sur les outils de prédiction de CAMP, douze peptides ont fait l’objet d’une synthèse.Cinq de ces peptides ont révélé un large spectre d’activités antibactériennes. Les peptides antibactériens issus de la seicheayant une activité non hémolytique ont fait l’objet d’un transfert en écloserie. Ce transfert a été optimisé à partir d’uneétude préliminaire sur le peptide de novo K4, particulièrement actif sur les vibrios. Cette étude a mis en évidencel’importance de l’innocuité du peptide antibactérien sur les différents maillons de la chaine trophique, notamment del’huitre, et sur l’importance du stade de développement ciblé. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au devenir despeptides antibactériens de manière à s’assurer de leur biodégradabilité. L’ensemble de ces travaux a permis nonseulement d’identifier de nouveaux PAMs mais également d’apporter les premières données portant sur le potentiel del’utilisation de ces peptides comme alternative aux antibiotiques. / The first larval stages of oyster (Magallana gigas) are key steps in the smooth running of the zootechnical course and inthe sustainability of hatcheries, where mortality levels can be high. That is why we searched for new antimicrobialpeptides (AMPs) on two marine organisms, i.e. lionfish (Pterois volitans), which is invasive in the Caribbean Sea, and thecommon cuttlefish (Sepia officinalis), which is present in French oyster production areas. The search for AMPs wascarried out preferentially from de novo transcriptomes from these two animals. In lionfish, BLAST analyses allowed forthe identification of 7 transcripts encoding AMPs. Four of them shared strong sequence homology (> 90% identity) withAMPs rich in cysteines and close to hepcidin, LEAP-2, NK-lysin and b-defensin identified in other fish. The other 3transcripts, annotated pteroicidins A, B and C, coded for piscidin-related peptides. The presence of b-defensin andpteroicidin a encoded by pteroicidin A was confirmed in lionfish skin extracts by mass spectrometry. An in-depth studywas conducted on two amide and non-amide forms of pteroicidin a, as well as on several peptides of different sizesderived from pteroicidins B and C. The results highlighted a relationship between structure, amidation, and theantibacterial and hemolytic activities of these different pteroicidins. On the other hand, no AMP was highlighted in theSepia officinalis model using conventional approaches coupling purification and antibacterial tests or BLAST approaches.We therefore developed a more original approach that relies on the design of peptides starting from the transcriptome.Starting from 811 small cysteine-free peptides from the APD database, we determined recurring criteria for charge,hydrophobicity, and amino acid composition. Based on these criteria and on CAMP prediction tools, twelve peptides weresynthesized. Five of them revealed a broad spectrum of antibacterial activities. Non-hemolytic antibacterial peptidesderived from cuttlefish were transferred to the hatchery. This transfer was optimized thanks to a preliminary study onthe de novo K4 peptide, which is particularly active on vibrios. The study highlighted the importance of antibacterialpeptide safety on the various links of the trophic chain including oyster, and the importance of the targeted stage ofdevelopment. In addition, we addressed the fate of antibacterial peptides to ensure their biodegradability. Altogether,this work not only helped to identify new AMPs but also to provide the first data on the potential use of these peptidesas an alternative to antibiotics.

Le site d’action des bactériocines de la sous-classe IIa est la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif. Le mécanisme d’action se décompose en trois étapes : (i) adsorption de la bactériocine sur la membrane ; (ii) structuration du peptide et insertion dans la bicouche lipidique ; (iii) formation de pores. La présence de pores provoque des fuites de composés vitaux aboutissant soit à un arrêt de la croissance soit à la mort de la bactérie. Le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane a été mesuré grâce à l’anisotropie de fluorescence de deux sondes, le TMA-DPH et le DPH, respectivement localisées à la surface et en profondeur de la bicouche lipidique. Des résultats différents ont été obtenus avec deux espèces bactériennes appartenant au genre Listeria. Dans un cas, le peptide s’insère partiellement dans la membrane et dans l’autre en profondeur. Ces résultats suggèrent que la mésentérocine 52A peut suivre deux mécanismes distincts aboutissant à une bactériostase. Pour mieux comprendre les interactions entre la bactériocine et la cellule cible, le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane de trois souches de Leuconostoc, la première sensible, la seconde naturellement insensible et la dernière rendue résistante, a été caractérisé. Il semblerait que le phénotype de résistance soit corrélé avec les propriétés physico-chimiques de l’enveloppe cellulaire. Afin de pouvoir généraliser les résultats observés avec la mésentérocine 52A, d’autres bactériocines de la sous-classe IIa, les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2, produites par la souche Carnobacterium maltaromaticum CP5, ont été étudiées. Dans un premier temps, ces bactériocines ont été produites et purifiées à partir d’une souche d’Escherichia coli recombinante. L’étape de production en fermenteur a été optimisée, des quantités de l’ordre de 300 mg de peptides ont été produites. Le mode d’action des carnobactériocines, seules ou en combinaison, a été déterminé vis-à-vis de cellules procaryotes ou eucaryotes. Les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 ont un mode d’action synergique contre les bactéries sensibles et ne présentent pas de cytotoxicité vis-à-vis des cellules de la lignée Caco-2 / The action site of sub-class IIa bacteriocins is the cytoplasmic membrane of Gram-positive bacteria. The current view of the mechanism of action is divided into three steps: (i) adsorption of bacteriocins on the membrane; (ii) apparition of the structures of peptide and integration into the lipid double layer (iii) formation of pores. The presence of pores leads to efflux of vital cell compounds. They cause growth stop or bacterial death. The degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane was measured by fluorescence anisotropy of two probes, TMA-DPH and the DPH, which target the surface or the depth of the membrane, respectively. Different results were obtained with two bacterial species of the genus Listeria. In the first hand, the peptide is partially inserted into the membrane and in the second hand in depth. These results suggest that mesenterocin 52A can exhibit two different mechanisms leading to the same antibacterial effect. To better understand the interactions between bacteriocins and the target cell, the degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane of three Leuconostoc strains, the first sensitive, the second naturally resistant and last induced resistant, was characterized. It seems that the resistance phenotype is correlated with physical and chemical properties of the cell envelope. To generalize the results observed with mesenterocin 52A, other bacteriocins of sub-class IIa, the carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2, produced by Carnobacterium maltaromaticum CP5 strain, were studied. These bacteriocins were produced in E. coli and subsequently purified. The optimization of the production process in a reactor led to purify up to 300 mg of peptides for 1.5 liter of culture. The mode of action of carnobacteriocins, alone or in combination, was determined with prokaryotic or eukaryotic cells as targets. The carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2 have a synergistic mode of action against sensitive bacteria and are not cytotoxic against Caco-2 cell line