Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le puissant anti-paludéen, l'artémisinine a été décrit comme inhibiteur de l'activité ATPasique de PfATP6 après son expression dans des ovocytes de Xénope. PfATP6 est l'unique ATPase Ca2+ du réticulum endo/sarcoplasmique de P. falciparum, le parasite responsable du paludisme. Quand un acide aminé de SERCA1a de lapin (E255) est muté en son équivalent dans PfATP6 (L), l'activité de ce mutant exprimé en ovocyte de Xénope est inhibée en présence d'artémisinine. Après expression de ce mutant et de PfATP6 dans S. cerevisiae puis leur purification, nous avons constaté qu'aucune de ces deux protéines n'était sensible à l'artémisinine. En parallèle, nous montrons que PfATP6 purifiée est sensible aux principaux inhibiteurs de SERCA mais elle est moins sensible à la thapsigargine que ne l'est SERCA1a. Les résultats présentés ici suggèrent que le méchanisme d'action de l'artémisinine est complexe et ne peut pas être du à une interaction directe entre l'artémisinine et PfATP6. D'autre part, la purification de PfATP6 laisse entrevoir l'opportunité de mieux caractériser cette protéine voire même de développer de nouveaux anti-paludéens en recherchant des inhibiteurs de cette protéine.

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de muscle squelettique rapide (SERCA1a) est une protéine membranaire qui permet le transport actif de deux ions calcium depuis le cytosol jusque dans la lumière du réticulum. Depuis 2000, l'obtention de nombreuses structures à résolution atomique de cette enzyme a été un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique (Toyoshima, Nakasako et al. 2000). Toutefois, avant 2007, les formes de cette enzyme cristallisées en absence de calcium avaient été obtenues en présence d'un inhibiteur fixé au domaine membranaire. Nous avons d'abord montré, notamment par des techniques de spectroscopie de fluorescence et de protéolyse ménagée, que l'interaction de la protéine avec ces inhibiteurs, qui rend l'ATPase incapable d'adopter certaines des conformations présentes au cours de son cycle catalytique, avait certainement induit des biais significatifs dans la structure de certaines des formes cristallisées avant 2007 (Montigny, Picard et al. 2007). Nos résultats ont stimulé la recherche de structures nouvelles, en absence ou en présence d'inhibiteurs, dont l'analyse a pleinement confirmé nos conclusions. L'utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la protéine solubilisée était jusque là jugée utile pour protéger celle-ci de son éventuelle inactivation irréversible en présence de détergent (Lund, Orlowski et al. 1989). Utilisant le glycérol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en évidence des conséquences inattendues de l'interaction de l'ATPase avec deux des détergents communément utilisés pour sa cristallisation, son isolement ou sa simple étude (Montigny, Arnou et al. 2008). En présence de glycérol, nous avons également pu étudier certains traits de fonctionnement de trois mutants de l'ATPase, purifiés après expression hétérologue dans la levure S. cerevisiae : un mutant d'un des sites de fixation du calcium (i.e. capable de fixer un seul des deux calciums) (Montigny, Arnou et al. 2008) et deux autres mutants bloquant l'enzyme dans des états particuliers du cycle catalytique (Marchand, Winther et al. 2008). Parallèlement à ces études, nous avons élucidé le mystère des propriétés de fluorescence anormales d'une forme particulière de l'enzyme SERCA1a marquée au FITC dans son site nucléotidique. Nous avons mis en évidence une phosphorylation imprévue du FITC lié, conduisant à une très faible fluorescence, particulièrement stable dans le temps. Les conditions de cette phosphorylation impliquent une réorganisation de l'orientation relative des domaines cytosoliques de l'ATPase lors de l'étape de relargage des ions calcium vers la lumière du réticulum (McIntosh, Montigny et al. 2008). Dans toutes nos études, il nous a fallu évidemment tenir compte de la possible chélation des cations divalents interagissant avec l'enzyme (calcium, magnésium, ...) par les anions présents. Par pH métrie et à l'aide de sondes colorées, nous avons vérifié que le magnésium n'était PAS chélaté par le tampon Mops classiquement utilisé, contrairement à ce qui était rapporté dans certaines tables de constantes d'association (Montigny and Champeil 2007). A cette occasion, mettant notre savoir-faire au service de collègues du laboratoire, nous avons également précisé les différents complexes formés par association entre le cadmium (Cd2+) et le glutathion réduit (GSH-) (Leverrier, Montigny et al. 2007), afin de mieux comprendre lesquels de ces complexes étaient le plus susceptibles de se former au cours de la détoxication cellulaire du Cd2+. Abréviations : ATPase, AdénosineTriPhosphatase ; SERCA1a, Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase, isoforme 1a ; FITC, fluorescéine isothiocyanate ; Mops, acide 4-morpholinopropanesulfonique.

Les peptides lasso sont des peptides bioactifs bactériens issus de la voie de biosynthèse ribosomale et subissant des modifications post-traductionnelles, caractérisés par une structure entrelacée dite en lasso. Ils possèdent un cycle macrolactame en position N-terminale, traversé par la queue C-terminale. Cette topologie de type rotaxane, maintenue par piégeage de la queue C-terminale dans le cycle via des acides aminés encombrant et/ou des ponts disulfure, confère à ces peptides une structure compacte et stable. Les actinobactéries recèlent la plus grande diversité et gamme d'activités biologiques parmi les peptides lasso (antibactériens, anti-VIH, antagonistes de récepteurs..), et l'exploration de génomes suggère une diversité encore plus grande, puisque certains clusters portent des gènes codant des enzymes de modifications post-traductionnelles jamais observées auparavant. Cependant, l'expression de ces peptides semble être rigoureusement contrôlée, rendant leur production en laboratoire difficile à partir de la bactérie productrice. Le rôle écologique et les mécanismes de régulation des peptides lasso ne sont pas très documentés. Leur compréhension permettrait d'améliorer la production et de mieux exploiter les activités biologiques des peptides lasso. / Lasso peptides are ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides produced by bacteria, characterized by a remarkable mechanically-interlocked structure. The lasso topology, reminiscent to a rotaxane, consists in an N-terminal macrolactam ring threaded by a C-terminal tail. This compact and stable structure is stabilized by steric entrapping of the tail in the ring, through bulky amino acid(s) and/or disulphide bonds. Lasso peptides produced by Actinobacteria display the greatest chemical diversity and a range of biological activities (antibacterial, anti-HIV, receptor antagonist…), therefore are of high pharmaceutical interest. Genome mining revealed that Actinobacteria have enormous potential to biosynthesize novel lasso peptides, e.g. harbouring new post-translational modifications. However, the expression of these peptides is generally controlled by complex regulatory systems, making their production under laboratory conditions difficult. Understanding the ecological role and regulation mechanisms of lasso peptides would help to improve production and better exploit the biotechnological potential of these molecules. The first part of my work deals with the identification of new lasso peptides from Actinobacteria, using heterologous expression in Streptomyces hosts. The second part of my work deals with the regulation mechanism and ecological role of lasso peptides using sviceucin, a lasso peptide produced by Streptomyces sviceus, as the model for study.

La conception de nouveaux produits laitiers fermentés fonctionnalisés avec les peptides bioactifs est l'une des stratégies prometteuses pour le développement d'aliments fonctionnels. L'objectif de cette thèse s'inscrit ainsi dans une démarche de production d'un lait fermenté contenant un peptide anxiolytique, l'alpha-casozépine (alpha-CZP ; f91-100 de la CN-alpha s1 bovine) ou du fragment plus court (f91-97). Dans un premier temps, nous avons étudié la stabilité des peptides bioactifs vis-à-vis des souches ayant le phénotype PrtS+ (LMD-9) et PrtS- (CNRZ1066) de S. thermophilus. Il s'est avéré que les deux souches sont capables d'hydrolyser le peptide en fragments plus courts par l'activité peptidasique de surface. Il a été vérifié que l'hydrolyse n'est due ni aux peptidases intracellulaires issues d'une éventuelle lyse cellulaire ni à la protéase chaperonne HtrA. Les activités de type amino-, X-prolyl dipeptidyl-, carboxy-peptidases et peptidyl dipeptidase de surface ont été mises en évidence. L'ajout de peptides bioactifs dans des laits fermentés nécessite donc la caractérisation préalable du potentiel protéolytique des bactéries lactiques. Afin de n'ajouter qu'un type de peptides et non pas une fraction peptidique, nous avons exprimé de manière hétérologue l'alpha-CZP sous forme multimérique chez L. lactis en utilisant le système d'induction NICE. Il a été révélé par le test ELISA qu'une petite quantité d'alpha-CZP multimérique a été produite par les cellules induites mais également non induites par la nisine. Le ralentissement important de la croissance des cellules de L. lactis recombinante induites par la nisine suggère que le multimère peptidique a des effets toxiques sur les cellules / The designing of novel fermented milk products functionalized with bioactive peptides is one of the promising strategies to develop functional foods. The objective of the thesis is thus the development of fermented milks comprising of an anxiolytic peptide, alpha-casozepine (f91-100 of bovine alpha s1 CN) or its shorter fragment (f91 97). Firstly, we studied the stability of different bioactive peptides towards two strains, with PrtS+ (LMD¬9) and PrtS- (CNRZ1066) phenotypes, of S. thermophilus, a starter bacterium widely used for the manufacture of yogurt. It was revealed that both strains hydrolysed the peptides into shorter fragments by surface peptidases. The hydrolysis was neither due to intracellular peptidases eventually released from cell lysis nor to extracellular chaperone protease HtrA, since mutant LMD-9-deltahtrA also showed the same type of hydrolysis. Aminopeptidase, X-prolyl dipeptidyl peptidase, peptidyl dipeptidase and carboxypeptidase activities associated to the cell-surface of both strains were observed. Therefore, addition of bioactive peptides in fermented milks requires well prior characterization of the proteolytic potential of lactic acid bacteria. Finally, in order to add only one type of peptides instead of a peptide fraction, we expressed heterologously alpha-CZP in multimeric form in L. lactis using NICE system. It was revealed by ELISA test that a small quantity of recombinant alpha-CZP multimer was produced by both nisin-induced as well as non-induced cells. The significant decrease in the growth of nisin-induced recombinant L. lactis suggests that the peptide multimer has toxic effects on the cells

Les cyanobactéries ont développé des mécanismes de photo-protection pour se prémunir des dommages causés par un excès de lumière. L’un d’eux repose sur l’activité de l’Orange Caroténoïde Protéine (OCP), protéine soluble qui attache un kéto-caroténoïde, l’hydroxy-echinenone. Sous illumination, l’OCP se photo-convertit en forme active et interagit avec les phycobilisomes pour dissiper l’énergie collectée sous forme de chaleur. En conséquence, l’énergie d’excitation reçue par les centres réactionnels et la fluorescence du complexe photosynthétique diminuent. L’OCP a aussi la faculté de neutraliser l’oxygène singulet pour lutter contre la photo-oxydation. J’ai développé un système d’expression hétérologue pour reconstituer la voie de biosynthèse de cette protéine dans E.coli. Ce système permet l’obtention d’une grande quantité d’OCP liant son caroténoïde in vivo. Grâce à ce système robuste et rapide, les OCPs de trois cyanobactéries : Synechocystis, Arthrospira et Anabaena ont été produites, liant différents caroténoïdes. Toutes les OCPs recombinantes sont photo-actives et capables de quencher la fluorescence des phycobilisomes in vitro. Elles possèdent toutes la faculté de neutraliser l'oxygène singulet quel que soit le caroténoïde lié. Ce système d'expression hétérologue nous a permis d’élucider les déterminants structurels impliqués dans la photo-activation et la structure de la forme active de l’OCP. Il constitue une avancée fondamentale dans l'étude des protéines à caroténoïde et dans la production d'antioxydants solubles qui présentent un grand intérêt pour l’industrie de la santé. / Cyanobacteria have developed some photo-protective mechanisms to protect themselves from stress caused by excess light. One of them relies on the activity of the soluble Orange Carotenoid Protein (OCP) that binds a keto-carotenoid, the hydroxyechinenone. Under illumination, the OCP gets photo-converted to an active form and can interact with phycobilisomes to dissipate the collected energy as heat. Consequently, the excitation energy arriving at the photosynthetic reaction centers and the phycobilisome fluorescence emission decrease. The OCP can also quench the singlet oxygen to fight against photo-oxidation. I developed a heterologous expression system in which the biosynthetic pathway of the OCP is built in E.coli. The expression system allows the production of a large amount of OCP binding its carotenoid in vivo. Thanks to this robust and fast expression system, OCPs from three different cyanobacteria: Synechocystis, Anabaena and Arthrospira were produced, binding different carotenoids. All recombinant OCPs are photoactive and able to induce a large phycobilisome fluorescence quenching. Moreover, they all have the ability to quench the singlet oxygen, whatever the bound carotenoid. This heterologous expression system allowed us to elucidate the structural determinants involved in the photo-activation and structure of the active form of the OCP. This work represents a fundamental advance in the study of caroteno-proteins and in the production of others soluble antioxidants that are of great interest to the health industry.

Le genre Pneumocystis regroupe des microchampignons atypiques qui colonisent par voie respiratoire les alvéoles pulmonaires de nombreux mammifères. C’est un pathogène opportuniste qui s’avère particulièrement dangereux lorsque le système immunitaire de l’hôte est déficient (VIH, greffés) et dans ce cas il provoque une pneumonie, la pneumocytsose, fatale en absence de traitement. Du fait que les Pneumocystis spp restent des microchampignons non cultivables, il est alors impossible de manipuler directement ses gènes et la seule solution pour étudier leurs fonctions et leurs localisations, demeure leur expression en système hétérologue. Situé dans l'espace alvéolaire, Pneumocystis spp. sont exposés au stress oxydatif générés par les macrophages alvéolaires, les granulocytes neutrophiles ainsi que par les espèces réactives de l'oxygène (EROs) produits par le métabolisme respiratoire. Pour se protéger, ces micro-organismes ont développé un système spécifique de détoxification des EROs incluant les SuperOxyde Dismutases (SOD). Dans notre étude, la carence en MnSOD d'une souche de Saccharomyces cerevisiae (EG110) dépourvue du gène Scsod2 a été complétée par l'introduction d'un plasmide portant une version inductible du gène Sod2 de P. carinii (Pcsod2). Une fois exprimée la PcMnSOD était capable de complémenter le défaut de croissance de la souche EG110 qui a été exposés à la ménadione. En bref, notre étude a montré une bonne complémentation du gène Sod2 de P. carinii chez une levure déficiente en MnSOD à savoir (i) la reprise de la culture en conditions de stress oxydant, (ii) la mise en évidence de la protéine traduite (Western Blot) et (iii) l’adressage mitochondriale de la protéine hétérologue. Selon le degré d’altération du système immunitaire, les infections à P. jirovecii peuvent présenter des tableaux cliniques variés allant de la colonisation à la pneumocystose. Ces infections semblent être en grande partie liées à des déficits majeurs de l’immunité cellulaire se traduisant plus précisément par une diminution du nombre des lymphocytes TCD4 (LTCD4). Notre deuxième objectif était de parvenir à une appréciation quantitative du risque de contamination par P. carinii en fonction du degré d’immunodépression (ID) des rats exposés. Nous avons ainsi développé un modèle animal de transmission naturelle de P. carinii où des rats nude développant une pneumocystose (« rats donneurs ») sont mis en contact direct avec des rats Sprague Dawley Pneumocystis-free (« rats receveurs ») présentant différents niveaux d’ID (dexamethasone). Après 2 semaines de contact, le niveau de colonisation des rats graduellement ID est déterminé soit par comptage après coloration au Bleu de Toluidine O, soit par qPCR. Cette étude a permis tout d’abord de valider notre modèle d’ID graduelle chez le rat ; mais surtout, et pour la première fois dans un modèle expérimentale chez le rat, nous avons montré une relation inverse entre le niveau de colonisation par P. carinii et le taux de LTCD4 ou LTCD8 circulants. Enfin, nous avons réalisé la première étude épidémiologique portant sur Pneumocystis au Liban. Ce projet franco-libanais a été mis en place au vue de l’importance majeure de la colonisation par Pneumocystis chez les patients immunocompétents, en particulier chez les patients atteints de pathologies pulmonaires chroniques obstructives tels que la BPCO où la colonisation par Pneumocystis est considérée comme un facteur aggravant de la maladie. Nos résultats montrent une faible prévalence de colonisation (5.2%) et une prédominance du génotype mtLSU2 chez les patients atteints de pathologies respiratoires au Liban. De plus, dans notre cohorte de patient présentant des pathologies respiratoires variées, la BPCO semble être la seule maladie respiratoire associée à un facteur de risque de colonisation par P. jirovecii. / Pneumocystis is an opportunistic pulmonary fungal pathogen that causes Pneumocystis pneumonia (PcP) in immunocompromised individuals such as patients with HIV infection as well as those without HIV infection who are undergoing immunosuppression as a consequence of chemotherapy or organ transplantation. Pneumocystis colonization in immunocompetent individuals has recently been described by the detection of fungal DNA without signs or symptoms of pneumonia, and accumulating evidences underline its clinical importance. Pneumocystis organisms are airborne transmitted and represent a large group of species of atypical fungi that cannot be continuously grown in culture. Consequently, it is impossible to directly manipulate genes in Pneumocystis species. Located in the alveolar space, Pneumocystis organisms are exposed to oxidative burst from phagocytic alveolar macrophages and neutrophils as well as to reactive oxygen species (ROS) produced by the mitochondrial oxygen metabolism. To counteract this, microorganisms have developed a ROS detoxifying system. This includes superoxide dismutases (SOD). In the present study, the MnSOD deficiency of a Saccharomyces cerevisiae mutant strain was complemented by introducing a plasmid carrying an inducible version of the P. carinii Sod2 gene (Pcsod2). Expression of Pcsod2 revealed that the corresponding MnSOD recombinant protein could complement the growth defect in the mutant yeast strain when cells were exposed to menadione. The mitochondrial localization was confirmed by immuno-colocalization of the P. carinii recombinant MnSOD with the yeast mitochondrial Cox4 protein. These results suggest that Pcsod2 encodes an active MnSOD that is targeted to the mitochondrion. This work increases our understanding of the antioxidant defense mechanisms deployed by the Pneumocystis organisms.The adaptive host response to Pneumocystis infection involves humoral and cellular immune responses working in concert to promote the clearance of infection. Depending on the degree of alteration of the immune system, Pneumocystis infections may have various clinical presentations going from colonization to the most severe form (PcP).These infections appear to be largely related to major deficits in cellular immunity and are more closely reflecting a decrease in the number of CD4 T lymphocytes (LTCD4). Our objective was to achieve a quantitative assessment of the risk of contamination by Pneumocystis depending on the degree of immunosuppression (ID) of the exposed host. Thus, we developed an animal model of natural transmission of P. carinii where rats undergoing gradual ID (dexamethasone) named receivers, are cohoused with nude rats developing PcP, named donors. Following contact between receiver and donor rats, the level of colonization by Pneumocystis of receiver rats is determined by toluidine blue O staining or by qPCR. This study allowed us to validate our gradual ID rat model, in the sense that we were able to maintain the level of circulating LTCD4 and LTCD8 stable. Finally, and for the first time in an experimental rat model, we observed an inverse relationship between the level of colonization by P. carinii and the level of circulating LTCD4 and LTCD8.Finally, we aimed to acquire the first data concerning the prevalence of P. jirovecii in the Lebanese population. This Franco-Lebanese project was set up because the colonization by Pneumocystis is probably of major importance in the public health, especially in susceptible patients such as patients with chronic obstructive pulmonary diseases (COPD) where Pneumocystis is considered as a worsening prognosis factor. Our results show a low prevalence of P. jirovecii colonization (5.2%) and the predominance of mtLSU genotype 2 in patients with respiratory diseases in Lebanon. Moreover, in our cohort of patients with various respiratory diseases, COPD was the only respiratory disease associated with a significant increased risk of P. jirovecii colonization.

La mésentéricine Y105 est une bactériocine de sous-classe IIa produite par Leuconostoc mesenteroides Y105. Pour comprendre le mécanisme de l'activité anti-Listeria de ce peptide et plus généralement des bactériocines de classe IIa, l'étude des relations existant entre la structure et la fonction de ce peptide a été envisagée. Dans ce but, une collection de mésentéricines Y105 modifiées au niveau d'un résidu a été produite. Afin d'obtenir ces dérivés de bactériocine, une méthode de mutagenèse aléatoire par PCR a été mise en place pour générer des séquences d'ADN, codant la bactériocine mature, modifiées sur un seul codon. Dans un deuxième temps, une méthode de production hétérologue de ces peptides mutés a été développée en utilisant d'une part un vecteur portant les gènes de structure des bactériocines, et d'autre part, un vecteur permettant l'expression de l'immunité et du transport de ces peptides. Un outil de production universelle de peptide a été élaboré. L'étude de l'impact des mutations sur l'activité antagoniste, la structure secondaire (analysée par dichroïsme circulaire en présence de trifluoroéthanol ou de micelles de lysophosphatidylcholine), la structure tridimensionnelle (prédite) et l'interaction de la mésentéricine Y105 avec des environnements mimant les membranes cibles (méthode d'extinction de la fluorescence intrinsèque du tryptophane) a été réalisée. Enfin, une analyse par résonance magnétique nucléaire (RMN) a été effectuée sur la bactériocine sauvage pour déterminer sa structure tridimensionnelle. De l'ensemble de ces données, un modèle d'action est proposé pour la mésentéricine Y105, ce modèle peut être étendu aux bactériocines de structure proche.

L’aquaporine-2 (AQP2) est le canal responsable de la réabsorption finale d’eau au niveau du tubule collecteur du rein. À la base, contenue dans des vésicules internes, l’AQP2 est acheminée à la membrane apicale des cellules principales du tubule collecteur suite à une stimulation par l’hormone antidiurétique (ADH). L’incapacité à accomplir cette fonction entraîne le diabète insipide néphrogénique (DIN), une maladie caractérisée par l’inhabileté du rein à concentrer l’urine, entraînant une production de volumes urinaires élevés. Alors que les mutations récessives génèrent des protéines mal structurées et incapables de former des tétramères, les mutations dominantes sont capables de s’associer à leurs homologues sauvages, engendrant ainsi un DIN même chez les patients hétérozygotes. Ce mémoire présente l’analyse biochimique et fonctionnelle d’une nouvelle mutation naturelle de l’AQP2, la mutation T179N, aussi responsable du DIN. Cette dernière est particulièrement intéressante de par son génotype qui implique un caractère dominant, et sa position extracellulaire habituellement réservée aux mutations récessives. Les études comparatives de T179N à deux modèles de mutation récessive et dominante démontrent, tant en ovocytes de Xenopus laevis qu’en lignée cellulaire mpkCCDc14, le caractère récessif de cette nouvelle mutation. Les tests d’immunobuvardage de lysats d’ovocytes en membranes totales et membranes plasmiques purifiées ont révélé que seule la forme sauvage atteint la membrane plasmique alors que le mutant T179N est séquestré dans la cellule. En accord avec ce résultat, les analyses de perméabilité fonctionnelle démontrent aussi une absence d’activité pour T179N. En cellule mpkCCDc14, le mutant T179N exprimé seul n’atteint pas la membrane plasmique suite à l’action de la forskoline, contrairement à la forme sauvage. Cependant, ce mutant peut s’associer à son homologue sauvage en coexpression tant dans les ovocytes qu’en lignée mpkCCDc14 sans toutefois engendrer l’effet typique de dominance négative. En fait, dans ce contexte de coexpression, on remarque une augmentation de la Pf de 83±7 % et une récupération d’adressage à la membrane plasmique en cellule (immunofluorescence). En conclusion, T179N serait un mutant récessif fonctionnellement récupérable lorsqu’en présence de l’AQP2 sauvage. / Aquaporin-2 (AQP2) is the channel responsible for the final reabsorption of water in the collecting duct of the kidney. Basically, contained in internal vesicles, the AQP2 is delivered to the apical membrane of the principal cells of the collecting tubule after stimulation by the antidiuretic hormone (ADH). The failure to perform this function causes nephrogenic diabetes insipidus (NDI); a disease characterized by the inability of the kidney to concentrate urine and induces the production of high urinary volumes. While recessive mutations generate poorly structured proteins unable to form tetramers, dominant mutations are capable of associating with their wild counterparts, thus generating a NDI even in heterozygous patients. This paper presents the biochemical and functional analysis of T179N, a new NDI-causing mutation of the human AQP2. The mutant is particularly interesting because of its dominant genotype, despite its extracellular position usually restricted to recessive mutations. Here, we compare T179N against archetypal recessive and dominant mutations using both Xenopus laevis oocytes and in mpkCCDc14 cell model, and show the recessive nature of the mutation. The immunoblot tests on oocytes lysates in purified total and plasma membranes revealed that only the wild type protein reaches the plasma membrane while the T179N mutant is sequestered within cellular stores. Accordingly, functional analyzes indicate that T179N is inactive. In mpkCCDc14 cells, T179N expressed alone does not reach the plasma membrane in response to forskolin stimulation, unlike the wild-type. However, T179N does show the capacity to associate with its wild-type counterpart in both oocytes and in mpkCCDc14 cells, although without displaying the typical dominant negative effect. In fact, when coexpressed along wild-type, T179N gains back the functionality, with a Pf increase of 83±7 % and adequate plasma membrane targeting in cells (immunofluorescence). In conclusion, the mutant T179N is a mild recessive mutation that is susceptible to functional recovery when in presence of wild type AQP2.

La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.