Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans le contrôle de la majorité des processus physiologiques. Dans le modèle classique, la signalisation par les RCPGs se résumait à l'activation de protéines G hétérotrimériques capables de moduler l'activité d'effecteurs, qui, à leur tour, contrôlent la concentration intracellulaire de seconds messagers tels que l'AMPc ou le calcium. Cette vision classique de la signalisation s'est par contre complexifiée au fil des années et l'on sait maintenant que les RCPGs interagissent avec une multitude d'autres protéines afin de transmettre de façon spécifique les signaux extracellulaires. Ainsi, pour bien comprendre comment est régulé un RCPG, il devient primordial de connaître les protéines interagissant avec celui-ci. Nous avons donc entrepris d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour les récepteurs DP (récepteur de la prostaglandine D[indice inférieur 2]), TP[bêta] (récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2]) et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, puis, de déterminer le rôle de ces complexes protéiques dans la fonction des récepteurs. Lors d'un criblage par double-hybride visant à identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour DP, nous avons identifié la protéine ankyrin repeat domain-containing protein 13C (ANKRD13C), une protéine n'ayant pas encore été caractérisée jusqu'à maintenant. Des études de localisation ont montré qu'ANKRD13C est associée à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), où elle interagit avec DP. Cette interaction facilite d'abord la biogenèse du récepteur en ralentissant la dégradation des récepteurs nouvellement synthétisés. Elle régule aussi le transport de DP vers la membrane plasmique en induisant la rétention dans le RE des formes immatures du récepteur. Elle facilite finalement la dégradation par le protéasome des formes de récepteurs retenues dans le RE. Ces expériences suggèrent donc un rôle de chaperonne pour ANKRD13C dans la biogenèse du récepteur DP. La protéine adaptatrice RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) a ensuite été identifiée comme nouveau partenaire d'interaction pour l'isoforme [bêta] du récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2] (TP[bêta]).Les résultats présentés dans cette étude montrent que les deux protéines interagissent directement et qu'elles forment un complexe au niveau du RE. L'interaction entre TP[bêta] et RACK1 s'est d'ailleurs avérée essentielle pour que le récepteur puisse être exporté du RE vers la membrane plasmique. Ces travaux ont donc révélé un rôle majeur de RACK1 dans la fonction de TP[bêta], plus précisément au niveau de son transport vers la surface cellulaire. Finalement, une nouvelle interaction entre le récepteur [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique ([bêta][indice inférieur2]-AR) et la petite protéine G Rab11 a été caractérisée.Les expériences réalisées démontrent que les deux protéines s'associent en cellules via une interaction directe. Une construction du [bêta][indice inférieur 2]-AR où les sites d'interaction avec Rab11 sont mutés a été générée. La mise en évidence d'un défaut de recyclage de ce mutant suite à une stimulation avec un agoniste spécifique a permis d'établir que l'interaction directe avec Rab11 est essentielle pour que le [bêta][indice inférieur 2]-AR puisse recycler de façon adéquate.Les résultats présentés dans cette thèse illustrent le rôle joué par trois nouveaux complexes protéiques dans la synthèse, l'export et le recyclage de RCPGs. L'identification et la caractérisation de ces nouvelles interactions permettra de mieux comprendre comment sont régulés les récepteurs DP, TP[bêta] et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, et permettra éventuellement d'améliorer les connaissances quant à la régulation de l'ensemble des récepteurs couplés aux protéines G.

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Le but principal de mon projet de thèse était de développer un instrument de mélange en vol de microgouttes pour jets d'encre synchronisés. Les microgouttes balistiques passent voir l'air peut être pensé comme des navires de réaction avec des volumes en bas à la pl-gamme. Les réactifs restent limités dans les microgouttes pendant leur trajectoire. Les effets de tondage induits de la présence murale ne jouent pas de rôle; bien que la compression mécanique de la solution pendant le processus d'éjection puisse influencer l'intégrité structurelle de protéines fragiles. J'ai exploré dans ma thèse pour la première fois la combinaison de microgouttes balistiques avec des techniques de microdiffusion stroboscopique. L'effort instrumental principal était donc de développer une installation stable avec deux jets d'encre pour étudier mélange de microgouttes en vol à ligne de lumière ID13, ESRF utilisant expériences de diffusion centrale et de diffraction de rayons X stroboscopique. J'ai utilisé ces techniques pour étudier la paraffine liquide en vol et des microgouttes de cytochrome C et la coalescence de microgouttes de cytochrome C avec des microgouttes de tampon de Na-acetate. J'ai également exécuté des expériences exploratoires de diffraction de rayons X à la ligne de lumière ID13 sur des microgouttes de paraffine solide déposés sur des surfaces et la diffraction dépendante de la température sur le solide de paraffine pour calibrer les données stroboscopiques. Des expériences statiques de diffusion centrale ont été exécutées à la ligne de lumière ID02 pour obtenir des courbes de la référence pour les états de conformation de solutions du cytochrome C .

La question de savoir comment les protéines se replient dans leur propre structure tridimentionnelle offre un défi passionnant pour les biophysiciens de nos jours. L'utilisation d'un saut de température rapide est une technique très puissante pour l'étude du processus de dénaturation des protéines. Toutefois, sonder la structure secondaire est un défi difficile et on obtient rarement des valeurs quantitatives. Le but principal de ce projet de thèse est de développer une mise en œuvre technique de dichroïsme circulaire dans l'UV extrême dans une expérience de saut de température nanoseconde. Notre expérience permet de suivre quantitativement l'évolution de la fraction hélicoïdale d'un peptide poly(acide glutamique) au cours de sa dénaturation thermique avec une résolution de 12 ns de temps.

L'objet de ce travail de thèse est l'étude de la photodissociation de la carboxymyoglobine (MbCO) par dichroïsme circulaire résolu temporellement (TRCD). La myoglobine (Mb) est une protéine responsable du stockage de l'oxygène dans les muscles de l'organisme. Lorsque le complexe MbCO absorbe un photon visible, il y a photodissociation, le CO se détache et quitte la protéine. Il s'agit donc de mesurer le dichroïsme circulaire de la myoglobine juste après la photodissociation, afin de pouvoir remonter aux changements de structure ultra rapides de la protéine. D'un point de vue expérimental, la difficulté de ce travail résidait dans la maîtrise des nombreux artefacts d'une telle expérience. D'un point de vue théorique, un calcul basé sur la théorie de la polarisabilité a permis de montre! r que le CD était sensible essentiellement aux mouvements de l'histidine proximale, résidu clef dans la compréhension de l'effet allostérique. Le résultat marquant de cette étude a donc été la mise en évidence d'une dynamique temporelle de 100 ps, attribuée à un mouvement de l'histidine proximale. Une nouvelle source laser a également été développée dans le but de faire des expériences de TRCD dans l'ultraviolet. L'objectif est de pouvoir suivre à terme la dynamique de repliement des protéines. Des résultats préliminaires ont été obtenus.

Chez la bactérie Escherichia coli, SecB appartient au réseau de chaperons moléculaires qui assistent le repliement et l'adressage des protéines nouvellement synthétisées. SecB est connu pour faciliter l'export en interagissant avec les pré-protéines sous forme non-native et les adressant au translocon Sec via une interaction directe avec le moteur ATPase SecA. SecB possède aussi une activité de chaperon générique et est capable d'assister le repliement de certaines protéines cytosoliques en absence des chaperons majeurs DnaK et Trigger factor. Alors que le translocon Sec est universellement conservé, le chaperon SecB est retrouvé principalement chez les protéobactéries. Cependant, de plus en plus de séquences de type SecB sont retrouvées dans d'autres groupes de la taxonomie bactérienne, comme par exemple chez le pathogène humain majeur Mycobacterium tuberculosis. Chez cette bactérie, une séquence de type SecB appelée Rv1957 est présente en association avec un système toxine-antitoxin (TA) appartenant à la famille HigBA. Généralement, les TA sont des systèmes à deux composants qui modulent la croissance en réponse à des conditions de stress spécifiques, favorisant ainsi l'adaptation et la persistance. Dans le cas de ce système atypique toxine-antitoxine-chaperon (TAC), Rv1957 interagit avec l'antitoxine HigA et la protège à la fois de l'agrégation et de la dégradation, et est donc strictement requis pour permettre l'inactivation de la toxine par l'antitoxine. La première partie de ce travail avait pour but de reconstruire l'histoire évolutive de ce nouveau système TAC. Pour cela nous avons procédé à une recherche de systèmes similaires dans l'ensemble des génomes disponibles qui a révélé que la présence de systèmes TAC n'est pas limitée aux mycobactéries et que ces systèmes semblent s'être répandus dans la taxonomie par le biais de transferts horizontaux de gènes. Nos résultats suggèrent que les chaperons des systèmes TAC sont évolutivement apparentés au chaperon d'export solitaire SecB et ont divergé pour devenir spécialisés vis-à-vis de leurs antitoxines partenaires. Nous avons ensuite étudié ce phénomène de spécialisation par une approche d'évolution dirigée du chaperon d'export SecB d'E. coli. Nous avons mis en évidence que des substitutions uniques dans SecB sont suffisantes pour améliorer sa capacité à contrôler spécifiquement HigBA du système TAC, et que ces mutations résultaient généralement en une meilleure interaction avec l'antitoxine HigA. Remarquablement, environ la moitié des mutants identifiés sont affectés dans leur activité de chaperon générique en l'absence des chaperons DnaK et Trigger factor, suggérant un conflit entre spécialisation du chaperon et ses fonctions génériques. La plupart des résidus identifiés se trouvent dans une région de SecB non caractérisée et proche du site proposé d'interaction avec le substrat. Des expériences de cross-link à des positions spécifiques ont révélé que cette région interagit directement avec l'antitoxine HigA. Enfin, nous avons montré que HigA est capable d'entrer en compétition avec la fonction d'export d'un SecB spécialisé plus efficacement que pour la version sauvage de SecB, illustrant la potentielle connexion entre les fonctions de type SecB dans l'export et le contrôle d'un système TA. / SecB is part of the intricate network of chaperones that assist folding and targeting of newly synthesized polypeptides in Escherichia coli. SecB is known to interact with nonnative precursor proteins and address them to the Sec translocon via direct interaction with the SecA motor component, thus facilitating their export. SecB is also able to act as a generic chaperone, by assisting the folding of certain cytosolic proteins when the major DnaK/Trigger Factor chaperone pathway is disrupted. While the Sec translocon is universally conserved, the SecB chaperone is mainly found in proteobacteria. However, an increasing number of SecB-like sequences have been found in unusual groups of bacteria and especially in the major human pathogen Mycobacterium tuberculosis. In this bacterium, a SecB-like sequence, Rv1957, is present in association with a toxin-antitoxin (TA) system belonging to the HigBA family. Usually, TA modules are two-component systems that modulate growth in response to specific stress conditions, thus promoting adaptation and persistence. In the case of this atypical toxin-antitoxin-chaperone (TAC) system, Rv1957 interacts with the HigA antitoxin and protects it from both aggregation and degradation, and is thus strictly required for neutralization of the toxin by the antitoxin. The first aim of this work was to reconstruct the evolutionary history of the newly discovered TAC system. We performed a large-scale genome screening and found that TAC is not restricted to mycobacteria and seems to have disseminated in the taxonomy by horizontal gene transfer. Our results suggest that TAC chaperones are evolutionarily related to the solitary export chaperone SecB and have diverged to become specialized towards their cognate antitoxins. Next, we investigated such chaperone specialization event through directed evolution of the E. coli export chaperone SecB. We found that single amino-acid substitutions within SecB were sufficient to improve its ability to specifically control HigBA from TAC, and that these mutations mainly resulted in an increased binding to the HigA antitoxin. Strikingly, about half of the mutants identified were affected in their ability to perform SecB generic chaperone functions in the absence of both DnaK and TF chaperones, suggesting a conflict between specialization and generic chaperone functions. Most of the residues identified are located within a previously uncharacterized region of SecB which is close to the proposed substrate binding site. Further in vitro site-specific cross-linking experiments revealed that this region directly interacts with the HigA antitoxin. Finally, we show that the HigA antitoxin can compete with the export function of specialized SecB more efficiently than it does with wild type SecB, thus illustrating the potential interplay between SecB-like chaperone export functions and TA activation.

Les protéines sont des objets biologiques conçus pour résister aux perturbations et, àen même temps, s'adapter à des nouveaux environnements et des nouveaux besoins. Que sont lespropriétés structurelles des protéines permettant une telle plasticité? Pour taclercette question, nous modélisons d'abord la structure des protéines comme un réseau d'acides aminés et atomes en interaction. Compte tenu de la conformation structurelle 3Dd'une mutation obtenue In Silico, une approche réseaupermet la quantification de son changement structurel. En utilisant des grands ensemblesde mutations, nous avons conclu que le changement structurel est indépendant du type d'acide aminé remplacé ou du remplacement après mutation. En regardantà la composition des voisinages d'acides aminés, nous avons remarqué que lela localisation d'un type d'acide aminé dans la structure 3D est arbitraire:ce qui signifie que les contraintes d'interactions d'acides aminés dans une protéinemontre être indépendantes de la position de l'acide aminé en question. Menant à laobservation que la position de l'acide aminé dans la séquence est lapropriété unique modulant la plasticité structurelle.Le fait que les acides aminés peuvent se remplacer les uns les autres danstoutes les positions parce que la contrainte d'interaction ne dépend pas dutype d'acide aminé,est basé sur la personnalisation des voisins viamutations altérnatives compensatoires. Même s'il y a une grandetolérance pour les mutations basée sur la robustesse structurelle, les mutations peuvent avoir un impact surla plasticité structurelle en raison de la modification de la force des interactions êntre acides aminéset la distribution des atomes et des voisins entourant les résidus.La conséquence directe d'une telle variabilité de l'emballage atomique,est dû à une différence de vide (espace vide,pas d'atomes) sur la surface des résidus identifiés par certaines de mes données / résultats.Cela soulève la possibilité que la plasticité structurelle n'est pas seulementrégulée par les acides aminés et les contacts atomiques, mais aussi en sculptantdes vides locales dans la structure de la protéine pour permettre des mouvements atomiquesnécessaires pour la fonction de la protéine. Enfin, pour tester cette hypothèse, nous avonsmis en œuvre trois algorithmes pour mesurer l'espace vide autour desacides aminés pour regarder la relation entre cet espace vide et la plasticité structurelle. / Proteins are biological objects made to resist perturbations and, atthe same time, adapt to new environments and new needs. What are thestructural properties of proteins allowing such plasticity? To tacklethis question we first model protein structure as a network of aminoacids and atoms in interaction. Given the 3D structural conformationof a mutation obtained In Silico, a network approachallows the quantification of its structural change. Using large setsof mutations, we concluded that structural change is independent fromthe type of amino acid replaced, or replacing after mutation. Lookingat the composition of amino acid neighborhoods, we noticed that thelocation of a type of amino acid in the 3D structure is arbitrary:meaning that constraints of amino acid interactions in a proteinshow to be position independent. Leading to theobservation that the position of the amino acid in the sequence is thesingle property modulating structural plasticity.The fact that amino acids can replace each other atany position because the interaction constraint is not dependent on thetype of amino acid,is based on the customization of neighbors via alternative amino acidmutations or compensatory mutations. Even if there is a large mutationtolerance based on structural robustness, mutations can have an impact onthe structural plasticity because of the change in strength of pairwsie interactionsand the distribution of atoms and neihgbors surrounding residues.The direct consequence of such a variable atomic packingdistribution, is a difference of void (empty space,no atoms) on the surface of residues as identified by some of my data/results.This raises the possibility that structural plasticity is not onlyregulated by amino acid and atomic contacts but also by carving localvoids within the protein structure to allow atomic motionsrequired for the function of the protein. Finally, to test this hypothesis, we haveimplemented three algorithms to measure the empty space around aminoacids to look at the relation between this empty space and structural plasticity.