Le Rovabio Excel ™ est un cocktail enzymatique complexe sécrété par le champignon filamenteux Penicillium funiculosum. La société ADISSEO commercialise cet additif alimentaire destiné à la nutrition animale car les principales enzymes qui le constituent dégradent les polymères contenus dans les céréales, tels que les polysaccharides non amylacés. Ainsi, le Rovabio Excel™ permet d’améliorer la digestibilité et d’augmenter la valeur nutritionnelle des matières premières agricoles en réduisant la viscosité du bol alimentaire des animaux. Dans le but d’augmenter sa compétitivité, ADISSEO a fait conduire des études sur cette solution pour la caractériser biochimiquement et optimiser son potentiel xylanolytique.Ces travaux de thèse s’inscrivent dans ces projets industriels et ont poursuivi deux objectifs distincts. Le premier correspondait à l’augmentation de la thermostabilité de la protéine XynB du Rovabio Excel™, pour lui permettre de résister à la granulation. Le second concernait XynA, la protéine majoritaire de la solution multienzymatique, qui a été caractérisée biochimiquement. Les premiers résultats de caractérisation biochimique de XynA ont montré que la protéine était 100 fois plus active sur β-1,4-glucane que sur xylane. Des tests complémentaires sur pNP-cellobiose et pNP-β-D-Lactopyranose ont révélé que XynA était 5,2 fois plus active sur pNP-cellobiose et possédait une activité « exo ». Enfin, l’analyse des produits d’hydrolyse d’oligosaccharides composés de 2 à 5 unités de glucose a confirmé que la protéine XynA était une cellobiohydrolase de type I, très sensible à l’inhibition par le cellobiose (IC50 - C2 = 17,7 µM). L’étude la thermostabilité de XynB a confirmé que cette protéine n’était pas naturellement thermostable. Les résultats des travaux d’ingénierie avec l’ajout d’un pont disulfure pour rigidifier la structure 3D de la protéine n’ont pas été probants. En revanche, la création de protéines chimères à partir de protéines plus thermostables (TfxA de Thermomonospora fusca et XynII de Trichoderma reesei) a permis d’améliorer la stabilité thermodynamique de XynB avec des Tm augmentés de plus de 10°C / The Rovabio Excel™ is a complex enzymatic cocktail secreted by the filamentous fungus Penicillium funiculosum. The ADISSEO company sells it as food additive for animal feed because the main enzymes degrade polymers contained in grains, such as non-starch polysaccharides. Thus, the Rovabio Excel™ improves the digestibility and increases the nutritional value of agricultural raw materials by reducing the viscosity of the diet of animals. In order to increase its competitiveness, ADISSEO did conduct studies on this solution to characterize it biochemically and maximize its xylanolytic potential.This thesis takes part of this industrial project and have pursued two distinct objectives. The first corresponds to the increase in the thermostability of the protein XynB from the Rovabio Excel™, to enable it to resist at the granulation process. The second was XynA, the major protein of the multienzyme solution, which was characterized biochemically.Initial results of biochemical characterization of XynA showed that the protein was 100 times more active on β-1,4-glucan on xylan. Additional tests on pNP-cellobiose and pNP-β-D-Lactopyranose revealed that XynA was 5.2 times more active on pNP-cellobiose and possess an "exo-acting" activity. Finally, the analysis of products from oligosaccharides hydrolysis, composed of 2 to 5 units of glucose, confirmed that the protein XynA was a type I cellobiohydrolase, very sensitive to inhibition by cellobiose (IC50-C2 = 17.7 µM).The thermostability of XynB study has confirmed that this protein was not thermostable naturally. The results of the engineering work with the addition of a disulfide bridge to rigidify the 3D structure of the protein were not conclusive. However, the creation of chimeric proteins with more thermostable proteins (TfxA from Thermomonospora fusca and XynII from Trichoderma reesei) has improved the thermodynamic stability of XynB with Tm increased by more than 10°C

Le site d’action des bactériocines de la sous-classe IIa est la membrane cytoplasmique des bactéries à Gram positif. Le mécanisme d’action se décompose en trois étapes : (i) adsorption de la bactériocine sur la membrane ; (ii) structuration du peptide et insertion dans la bicouche lipidique ; (iii) formation de pores. La présence de pores provoque des fuites de composés vitaux aboutissant soit à un arrêt de la croissance soit à la mort de la bactérie. Le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane a été mesuré grâce à l’anisotropie de fluorescence de deux sondes, le TMA-DPH et le DPH, respectivement localisées à la surface et en profondeur de la bicouche lipidique. Des résultats différents ont été obtenus avec deux espèces bactériennes appartenant au genre Listeria. Dans un cas, le peptide s’insère partiellement dans la membrane et dans l’autre en profondeur. Ces résultats suggèrent que la mésentérocine 52A peut suivre deux mécanismes distincts aboutissant à une bactériostase. Pour mieux comprendre les interactions entre la bactériocine et la cellule cible, le degré de pénétration de la mésentérocine 52A dans la membrane de trois souches de Leuconostoc, la première sensible, la seconde naturellement insensible et la dernière rendue résistante, a été caractérisé. Il semblerait que le phénotype de résistance soit corrélé avec les propriétés physico-chimiques de l’enveloppe cellulaire. Afin de pouvoir généraliser les résultats observés avec la mésentérocine 52A, d’autres bactériocines de la sous-classe IIa, les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2, produites par la souche Carnobacterium maltaromaticum CP5, ont été étudiées. Dans un premier temps, ces bactériocines ont été produites et purifiées à partir d’une souche d’Escherichia coli recombinante. L’étape de production en fermenteur a été optimisée, des quantités de l’ordre de 300 mg de peptides ont été produites. Le mode d’action des carnobactériocines, seules ou en combinaison, a été déterminé vis-à-vis de cellules procaryotes ou eucaryotes. Les carnobactériocines Cbn BM1 et Cbn B2 ont un mode d’action synergique contre les bactéries sensibles et ne présentent pas de cytotoxicité vis-à-vis des cellules de la lignée Caco-2 / The action site of sub-class IIa bacteriocins is the cytoplasmic membrane of Gram-positive bacteria. The current view of the mechanism of action is divided into three steps: (i) adsorption of bacteriocins on the membrane; (ii) apparition of the structures of peptide and integration into the lipid double layer (iii) formation of pores. The presence of pores leads to efflux of vital cell compounds. They cause growth stop or bacterial death. The degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane was measured by fluorescence anisotropy of two probes, TMA-DPH and the DPH, which target the surface or the depth of the membrane, respectively. Different results were obtained with two bacterial species of the genus Listeria. In the first hand, the peptide is partially inserted into the membrane and in the second hand in depth. These results suggest that mesenterocin 52A can exhibit two different mechanisms leading to the same antibacterial effect. To better understand the interactions between bacteriocins and the target cell, the degree of penetration of mesenterocin 52A into the membrane of three Leuconostoc strains, the first sensitive, the second naturally resistant and last induced resistant, was characterized. It seems that the resistance phenotype is correlated with physical and chemical properties of the cell envelope. To generalize the results observed with mesenterocin 52A, other bacteriocins of sub-class IIa, the carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2, produced by Carnobacterium maltaromaticum CP5 strain, were studied. These bacteriocins were produced in E. coli and subsequently purified. The optimization of the production process in a reactor led to purify up to 300 mg of peptides for 1.5 liter of culture. The mode of action of carnobacteriocins, alone or in combination, was determined with prokaryotic or eukaryotic cells as targets. The carnobacteriocins Cbn BM1 and Cbn B2 have a synergistic mode of action against sensitive bacteria and are not cytotoxic against Caco-2 cell line

Les amines biogènes sont des composés allergènes, notamment rencontrés dans les produits fermentés tel que le vin. Les bactéries lactiques du vin, dont Oenococcus oeni, le principal acteur de la fermentation malolactique, sont capables de produire ces molécules, à partir de précurseurs azotés. Afin de réduire la teneur en amines biogènes, il est nécessaire de comprendre le rôle de cette production, chez les souches impliquées dans la synthèse de ces métabolites. Le projet européen BiamFood FP7 (n°211441) a été mis en place pour répondre à cette problématique. Au cours de mon travail de thèse, des outils moléculaires ont été développés afin de muter de manière ciblée les gènes de O. oeni et d'exprimer des gènes d'intérêt. Ainsi, les clusters hdc de Lactobacillus hilgardii et odc de O. oeni, responsables respectivement de la synthèse de l'histamine et de la putrescine, ont été clonés dans le vecteur pGID052 et transférés dans la souche de laboratoire O. oeni ATCC BAA-1163, déficiente pour la production d'amines biogènes. Cette stratégie n'ayant pas donnée lieu à la production d'amine biogène, mon travail de recherche s'est orienté vers la caractérisation biochimique de l'ornithine décarboxylase de O. oeni. L'ornithine décarboxylase de O. oeni BR14/97 a été sur-produite chez E. coli via le système pET. Après purification de l'enzyme, le pH optimal et la température optimale de fonctionnement, 5,5 et 35°C respectivement, ont été caractérisés. Les constantes cinétiques Km = 1 mM et Vmax = 0,57 U. mg-1 ont également été déterminées en mesurant la putrescine produite par HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). De plus, l'ODC de O. oeni BR14/97 est spécifique de la L-ornithine et ne peut pas dégrader la L-lysine en cadavérine, ce qui implique la présence d'une voie métabolique propre à la production de cadavérine chez cette souche. Dans un second axe du projet, l'influence de la source azotée et notamment des peptides versus acides aminés libres, a été étudiée chez une souche de Lactobacillus plantarum, isolée du vin et productrice de tyramine. Les peptides contenant de la tyrosine, sont utilisés par cette souche pour former de la tyramine. La production augmente en phase stationnaire de croissance, et est corrélée à l'expression du transporteur tyrP. L'analyse de la tyrosine présente dans le milieu de culture montre que ces peptides seraient dégradés dans le milieu extracellulaire chez L. plantarum.

Les anticoagulants antivitamine K (AVK) sont destinées à limiter la coagulation du sang. Ils sont donc susceptibles de provoquer des saignements. Les AVK ralentissent le cycle de la vitamine K qui est indispensable à la gamma-carboxylation de certaines protéines (PVKD). Les AVK inhibent l'activité vitamine K époxide reductase (VKOR), principalement catalysée par VKORC1. Ce sont des médicaments anticoagulants utilisés chez l'homme. Chez les rongeurs, ils servent de rodonticides. Une résistance aux AVK est observé tant chez l'homme que chez le rongeur.Chez des patients résistants aux AVK, 26 mutations ont été décrites dans la zone codante de VKORC1. L'expression hétérologue de ces enzymes mutées n'a permis de trouver que 6 mutations impliquées dans la résistance. Repérer ces mutations avant le début d'un traitement permettra une mise en place du traitement plus rapide. Les autres mutations ne seraient pas responsables du phénotype observé.La VKORC1L1 a été décrite comme une protéine agissant contre le stress oxydatif. Notre travail confirme que l'enzyme catalyse la réaction VKOR. Si sa participation dans la réduction de la vitamine K époxide est insignifiante dans le foie, il en est tout autrement dans les autres tissus testés. De plus, la VKORC1L1 apparait plus résistante aux AVK par rapport à la VKORC1. Ces propriétés catalytiques de la VKORC1L1 permettent d'expliquer l'absence d'effets des AVK sur les PVKD d'origine extra-hépatiques.Enfin, un travail de mutagénèse dirigée a permis d'abaisser ou d'augmenter considérablement la sensibilité de VKORC1L1 aux AVK. Ces résultats nous permettent de décrire l'implication de différents acides aminés dans l'interaction avec les AVK / Anticoagulant vitamin K antagonists (VKA) are molecules designed to prevent or delay blood clotting. They cause bleeding by slowing the recycling of vitamin K, an essential micronutrient for posttranslational modification of specific proteins (VKDP). It has been shown that VKA specifically inhibit VKORC1 enzyme which catalyze the VKOR reaction. VKA are used as rodenticides to control the proliferation of populations of pest rodents. In humans, they are used in the treatment and prevention of the occurrence of thromboembolic events. Due to the widespread use of these VKA, it was observed a phenomenon of resistance which is essential to better understand for economic, ecological or public health interests. In humans, 25 of 26 mutations were characterized. While these changes have been observed in patients resistant to VKA, the causality of these mutations has been demonstrated for 6 mutations. The ability to detect these changes before the start of treatment will allow the future implementation of the much faster and less expensive. Other mutations are not responsible for the observed phenotype.Moreover, VKORC1L1 has been described as an enzyme whose function is to act against oxidative stress. This study confirms that the enzyme catalyzes the VKOR reaction. If it appears that the liver in its participation in the reduction of vitamin K epoxide is insignificant, it is quite different in other tissues tested. In addition, VKORC1L1 appears more resistant to VKA over the VKORC1. Finally, directed mutagenesis of these residues lead to the decrease or the increase of VKORC1L1 sensitivity to VKA. These data result to the implication of residues in their interaction with VKA

La bactérie lactique Oenococcus oeni qui fait partie de la flore d’intérêt du vin, est responsable de la fermentation malolactique. Au cours de son développement dans le vin, Oenococcus oeni est confronté à des conditions physicochimiques drastiques (présence d’éthanol, pH 3,5, basse température, présence de composés soufrés, …). Sa capacité à s’adapter à ces conditions défavorables en fait un bon modèle d’étude de la réponse à de multiples stress chez les bactéries lactiques (Guzzo et al., 2000). L’un des mécanismes de résistance d’O. oeni fait intervenir une protéine de choc thermique de faible masse moléculaire ou sHsp (small Heat shock protein) nommée Lo18. La protéine Lo18 possède une activité de chaperon ATP-indépendante. C'est-à-dire que son association avec une protéine en cours de dénaturation permet de protéger la protéine et d’empêcher son agrégation. De plus elle est capable de s’associer avec les bicouches lipidiques et de stabiliser la structure lipidique.Les sHsp se caractérisent par la présence d’une région d’environ 90 acides aminés appelée α-cristallin impliquée dans l’activité de chaperon moléculaire in vitro. En général, les extrémités N- et C- terminales jouent un rôle essentiel dans le processus d’oligomérisation qui est nécessaire à l’activité chaperon. Dans l’optique d’étudier la relation entre la structure et la fonction de la sHsp Lo18, son activité et son oligomérisation ont été caractérisées à différents pH. Les résultats ont montré que le pH influe sur l’oligomérisation de Lo18 et également son activité de chaperon moléculaire. Des protéines Lo18 modifiées dans le domaine α-cristallin ont également été caractérisées. Elles ont permis de démontrer qu’une substitution d’acide aminé dans ce domaine altère l’activité de Lo18. Enfin des formes tronquées de Lo18 pour ses deux portions N- et C- terminales ont été construites, surproduites chez Escherichia coli, puis purifiées par chromatographie d’affinité hydrophobe.La capacité de Lo18 à empêcher l’agrégation des protéines et à stabiliser les membranes lipidiques nous a conduit à tester l’impact de Lo18 d’une part sur la surproduction in vivo chez Escherichia coli de protéines hétérologues d’intérêt, et d’autre part sur la formation d’un caillé laitier riche en caséine et lipides.La surproduction hétérologue de protéines chez E. coli est utilisée pour produire de grandes quantités de protéines à faibles couts. Cependant cette production n’est pas toujours efficace car l’accumulation d’une même protéine dans la cellule de la bactérie conduit souvent à son agrégation et à sa dégradation. Il apparait nécessaire de développer des systèmes permettant d’améliorer la solubilité des protéines surproduites chez E. coli. Nous avons donc testé les potentialités de Lo18 dans ce système, et montré une augmentation de la solubilité de protéines d’intérêt coproduites avec la sHsp Lo18 et/ou la Hsp GroEL/ES.Le lait comporte quatre composants dominants : l’eau, les matières grasses, les protéines et le lactose. En technologie fromagère, la coagulation correspond à une déstabilisation de l’état micellaire des protéines majoritaires du lait: les caséines. La prise en gel est suivie d’une phase d'égouttage, la synérèse, qui correspond à la perte d’une partie du lactosérum hors du gel. Les propriétés de chaperon moléculaire de la protéine Lo18 ont permis d’influencer l’agrégation des caséines in vitro. Nous avons donc appliqué Lo18 au modèle caillé laitier et décelé des applications industrielles possibles. Nous avons notamment montré en laboratoire une accélération de la phase de prise en gel, et une accélération du processus de synérèse. En modèle fromager nous avons mis en évidence que Lo18 permet de diminuer le taux d’humidité dans les fromages de type « pâtes molles » / The lactic acid bacteria Oenococcus oeni is part of the flora of interest in wine. It is responsible for malolactic fermentation. During its development in the wine, Oenococcus oeni is facing drastic physicochemical conditions (presence of ethanol, pH 3.5, low temperature, presence of sulfuric compounds). Its ability to adapt to these conditions makes of it a good model to study the response to multiple stress in lactic acid bacteria (Guzzo et al., 2000). One mechanism of resistance of O. oeni involves a Heat shock protein (Hsp) of low molecular weight or sHsp (small Heat shock protein) called Lo18.Lo18 protein has a chaperone activity ATP-independent. It is to say that its association with a protein during denaturation can protect the protein and prevent its aggregation. In addition Lo18 is able to bind with lipid bilayers and stabilize the lipidic structure.The sHsp are characterized by the presence of a region of about 90 amino acids, called α-crystallin, involved in molecular chaperone activity in vitro. In most cases, the N-and C-termini regions play an essential role in the oligomerization process that is necessary for the chaperone activity.In order to study the relationship between structure and function of Lo18, its activity and oligomerization were characterized at different pH. The results showed that the pH affects the oligomerization of Lo18 and also its molecular chaperone activity. Lo18 modified proteins in their α-crystallin region was also characterized. They have shown that a single amino acid substitution alters the activity of Lo18. Finally truncated forms of Lo18 in its two portions N-and C-termini were constructed, overproduced in Escherichia coli and purified by hydrophobic affinity chromatography.The ability of Lo18 to prevent aggregation of proteins and stabilize lipid membranes led us to test the impact of Lo18 for heterologous overproduction in Escherichia coli, and also in the formation of a curd milk rich in casein and fat.Overproduction of heterologous proteins in E. coli is widely used to produce large amounts of protein at low cost. However, this production is not easy because the accumulation of a protein in bacteria’s cell often leads to its aggregation and degradation. It appears necessary to develop systems to improve the solubility of proteins overproduced in E. coli. We therefore tested the potential of Lo18 in this system, and showed an increase in the solubility of proteins of interest coproduced with the sHsp Lo18 and / or the Hsp system GroEL / ES.Milk has four dominant components: water, fat, protein and lactose. In cheese technology, coagulation is a destabilization of the micellar state of the major proteins of milk: the caseins. Jellyfication phase is followed by a dripping phase called syneresis, which corresponds to the loss of part of the whey out of the gel.The properties of the sHsp Lo18 influenced the aggregation of the caseins in vitro. So we applied Lo18 on the curd milk model and detected possible industrial applications. In particular, we showed in laboratory an acceleration of the jellyfication phase, and an acceleration of the syneresis. In cheese model we have shown that Lo18 is able to reduce the humidity rate in cheeses