Malgré leur domestication il y a plus de 7000 ans, gérer la réponse défensive des abeilles, en particulier contre l'Homme, reste un défi. Cet état de fait est dû en partie à la complexité de cette réponse, qui commence par la détection du danger par quelques individus spécialisés et culmine dans une attaque collective, déclenchée par une phéromone d'alarme. Le comportement agressif des abeilles a fait l'objet de nombreuses études à la fois en laboratoire et sur le terrain, qui ont permis d'identifier les éléments déclencheurs et régulateurs de ce comportement. Cependant les mécanismes neuronaux et moléculaires qui sous-tendent cette réponse agressive sont toujours inconnus. Durant ma thèse, j'ai étudié le rôle des signaux olfactifs et des amines biogènes dans la régulation de l'agressivité des abeilles, en intégrant des approches comportementales, physiologiques et moléculaires. En utilisant un nouveau test pour mesurer la réponse agressive d'abeilles individuelles en conditions contrôlées, j'ai pu déterminer si certaines odeurs de plantes modulent l'agressivité des abeilles, en particulier en interagissant avec la phéromone d'alarme. J'ai identifié deux composés floraux, le linalol et le 2-phenylethanol, qui bloquent la réponse agressive déclenchée par la phéromone d'alarme. Ces odeurs n'empêchent pas les abeilles de sentir la phéromone d'alarme, mais ont une valeur appétitive importante pour les abeilles. Ces résultats suggèrent qu'une intégration sensorielle complexe a lieu lorsque les abeilles décident de participer ou non à la défense de la colonie. De plus, un test de terrain a montré que le linalol peut aussi être utilisé pour diminuer l'agressivité d'une colonie entière, ouvrant la voie pour des applications pratiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes neuronaux responsables de cette modulation par des odeurs florales, j'ai ensuite regardé comment ces odeurs affectent la représentation de la phéromone d'alarme dans le centre olfactif primaire du cerveau de l'abeille, le lobe antennaire. J'ai ainsi utilisé l'imagerie calcique in vivo pour visualiser l'activité des neurones de cette région. Les lobes antennaires sont structurés en unités fonctionnelles appelées glomérules, et l'identité d'une odeur est codée par le patron d'activation des glomérules. Notre hypothèse était que la représentation d'un mélange entre une odeur de plante appétitive et la phéromone d'alarme ne peut pas être obtenu linéairement à partir de la représentation de chaque composé, révélant ainsi les mécanismes neuronaux à l'origine de l'effet de ces odeurs florales. Cependant l'analyse des données n'a pas mis en évidence ce phénomène, ce qui suggère que l'intégration de la valeur appétitive des odeurs a lieu dans des centres supérieurs. Finalement, j'ai examiné le rôle des amines biogènes dans le comportement agressif de l'abeille. Les amines biogènes sont d'importants neuromodulateurs qui ont été impliqués dans le contrôle de l'agressivité de nombreuses espèces, mais leur rôle chez l'abeille n'avait pas été démontré. Les abeilles de colonies agressives ont plus de sérotonine dans leur cerveau central que celles provenant de colonies dociles. / Although honeybees were domesticated over 7000 years ago, finding ways to manage their defensive responses against intruders, including humans, is still a current challenge. This is in part due to the complexity of this behaviour, which starts with the detection of the threat by a few specialized individuals and culminates into a generalized, collective attack triggered by the release of an alarm pheromone. Numerous studies have investigated honeybee aggression and stinging behaviour both in the laboratory and field, including the sensory triggers and the potential regulatory mechanisms. However the specific neural and molecular mechanisms regulating this behaviour are still unknown. In my PhD thesis, I investigated the role of olfactory signals and brain biogenic amines in modulating aggression in honeybees, integrating behavioural, physiological, and pharmacological experiments. Using a novel assay to measure the stinging behaviour of individual bees under controlled conditions, I first explored whether a range of plant odours could modulate aggression, in particular by interacting with the alarm pheromone released by aroused bees. I identified two floral compounds, linalool and 2-phenylethanol, that block the recruitment elicited by the alarm pheromone. These odours do not prevent the bees from perceiving the alarm pheromone. Instead, this blocking effect appears to correlate with the appetitive value of these odours. This suggests that a complex sensory integration takes place when honeybees are faced with the decision of engaging or not into defensive tasks. Furthermore, a field test demonstrated that linalool could also be used to manage aggressive colonies, highlighting the practical application of these findings. To gain a better understanding of the neuronal mechanism underlying this effect of floral odours on honeybee aggression, I next investigated how these floral compounds affect the representation of the alarm pheromone in the primary olfactory center of the honeybee brain, the antennal lobe, using in vivo calcium-imaging to monitor the activity of neurons in this area. The antennal lobes are structured into functional units called glomeruli, and an odour identity and concentration is encoded within the pattern and intensity of activated glomeruli. We expected that the representation of the mixture of an appetitive floral odour with the alarm pheromone may not be linearly obtained from the representation of each compound, thus revealing the neuronal mechanisms at play during our previous aggression assays. However, analysis of the data suggests no such mechanism, which could be a clue that this processing is happening in higher brain centers. Finally, I investigated the role of brain biogenic amines in honeybee aggression. Biogenic amines are important neuromodulators and have been implicated in the regulation of the aggressive behavior of a number of species.

La souche Carnobacterium maltaromaticum LMA 28, isolée d’un fromage à pâte molle, possède des propriétés physiologiques non conventionnelles pour une bactérie lactique. Sa croissance en TSB-YE et en lait traduisent son exigence nutritionnelle en facteurs de croissance facilement assimilables et sa faible vitesse de production d’acide lactique à partir de glucose, lactose, fructose et saccharose. Le galactose n’est pas métabolisé et lors de l’hydrolyse du lactose n’est pas excrété dans le milieu de culture. Les caillés lactiques sont obtenus après des durées d’incubation non compatibles avec les cadences industrielles. De plus, ils présentent une texture très friable. La numération et l’identification de cette souche, en vue de suivre son comportement dans une matrice fromagère, ont été optimisées par la mise au point du milieu de culture sélectif CM, à l’aide de plan d’expériences, et par la technique de PCR. Le comportement de C. maltaromaticum LMA 28 a été comparé à ceux de deux souches lactiques d’intérêt technologique Lc. lactis DSM 20481 et S. thermophilus INRA 302, dans une large gamme de températures (3 à 37 °C) et de pH (5,2- 8,0). Des essais en co-culture, associant cette souche avec Lc. lactis DSM 20481 ou avec S. thermophilus INRA 302, ont montré que la production d’acide lactique était due à la croissance de la souche lactique traditionnelle. Cependant C. maltaromaticum LMA 28, souche lente, n’est pas inhibée par cette acidification. L’aptitude fromagère de C. maltaromaticum LMA 28 a été testée lors de deux fabrications de fromages à pâte molle. Inoculée à différents niveaux de population, elle a été mise en évidence à tous les stades de la fabrication. Présente à une concentration très faible dans le lait de fabrication, elle devient une flore lactique dominante après l’affinage et le stockage en réfrigération. Cette aptitude technologique est en relation avec son caractère psychrotrophe et sa faculté à se développer activement à des pH alcalins. Son « alimentarité », testée par la production d’amines biogènes, a montré des niveaux nuls ou très faibles en tyramine et en histamine, comme avec S. thermophilus INRA 302 et avec Lc. lactis DSM 20481. L’optimisation de sa production de flaveurs maltées a été abordée sur milieu TSB-YE et sur lait, supplémentés avec de la leucine, de l’isoleucine ou de la valine. La production de 3-méthylbutanal est la plus importante. Les analyses sensorielles des fromages contenant des niveaux de population importants (108-109 ufc.g-1) de C. maltaromaticum LMA 28 n’ont pas permis de mettre en évidence cet arôme. Présente dans de nombreux fromages français AOC ou non AOC, cette espèce opportuniste, de statut GRAS, pourrait être considérée comme un auxiliaire de fabrication intéressant, car elle permet un ralentissement du vieillissement des fromages, en évitant notamment l’apparition de flaveurs désagréables. Cette flore lactique psychrotrophe pourrait être retenue comme flore bactérienne d’affinage / The C. maltaromaticum LMA 28 bacteria strain, isolated from soft cheese, was observed to possess non conventional lactic bacteria physiological properties. Its growth in TSB YE medium and milk was found to be characterised by the requirements for easily assimilated growth nutrients and a low kinetic rate of lactic acid production from glucose, lactose, fructose and sucrose. In addition, it was found to not metabolise galactose or not excrete it during the hydrolysis of lactose. In the process of milk fermentation, it not only took an unusually long duration but produced products of fragile texture. In order to eventually determine the behaviour of this strain in the process of cheese-making, a selective culture medium CM was developed using an experimental design and PCR techniques for its isolation and identification. The behaviour of C. maltaromaticum LMA 28 was compared with that of two strains of lactic bacteria of technological interest namely Lc. lactis DSM 20481 and S. thermophilus INRA 302, within a wide temperature range (3 to 37°C) and of pH (5.2 – 8.0). Tests carried out in co-culture associating this strain with Lc. lactis DSM 20481 or with S. thermophilus INRA 302 showed that the lactic acid production was due mainly to the growth of the traditional lactic strain. In the process, the C. maltaromaticum LMA 28 slow strain was observed not to be inhibited by acidification. The cheese-making potential of C. maltaromaticum LMA 28 was evaluated in the process of two soft cheese manufactures. Inoculated at various levels of population, it was observed to be present at all manufacturing stages. Generally present at very weak concentrations in the starting milk, it becomes a dominant lactic flora following ripening and refrigeration storage. This technological aptitude is in relation with its psychrotrophic character and its ability to actively develop in alkaline medium. Its “alimentarity”, tested by its ability to produce biogenic amines, showed zero or very low levels in tyramine and histamine, as in the case of S. thermophilus INRA 302 and Lc. lactis DSM 20481. The optimization of its malted flavour production capacity was carried out on a TSB-YE medium and on milk supplemented with leucine, isoleucine or valine. In this process the production of 3-méthylbutanal was observed to be the most abundant product while cheese containing high levels (108-109 ufc.g-1) of C. maltaromaticum LMA 28 did not exhibit this flavour. This notwithstanding, the presence of this species of GRAS status in many French AOC and non AOC cheeses could be considered as an interesting auxiliary in cheese manufacturing process since it tends to slow down the aging process and thereby retard the development of unpleasant flavours. In this respect this strain of psychotrophic lactic bacteria could be retained as a flora for cheese ripening process

Les amines biogènes sont des composés allergènes, notamment rencontrés dans les produits fermentés tel que le vin. Les bactéries lactiques du vin, dont Oenococcus oeni, le principal acteur de la fermentation malolactique, sont capables de produire ces molécules, à partir de précurseurs azotés. Afin de réduire la teneur en amines biogènes, il est nécessaire de comprendre le rôle de cette production, chez les souches impliquées dans la synthèse de ces métabolites. Le projet européen BiamFood FP7 (n°211441) a été mis en place pour répondre à cette problématique. Au cours de mon travail de thèse, des outils moléculaires ont été développés afin de muter de manière ciblée les gènes de O. oeni et d’exprimer des gènes d’intérêt. Ainsi, les clusters hdc de Lactobacillus hilgardii et odc de O. oeni, responsables respectivement de la synthèse de l’histamine et de la putrescine, ont été clonés dans le vecteur pGID052 et transférés dans la souche de laboratoire O. oeni ATCC BAA-1163, déficiente pour la production d’amines biogènes. Cette stratégie n’ayant pas donnée lieu à la production d’amine biogène, mon travail de recherche s’est orienté vers la caractérisation biochimique de l’ornithine décarboxylase de O. oeni. L’ornithine décarboxylase de O. oeni BR14/97 a été sur-produite chez E. coli via le système pET. Après purification de l’enzyme, le pH optimal et la température optimale de fonctionnement, 5,5 et 35°C respectivement, ont été caractérisés. Les constantes cinétiques Km = 1 mM et Vmax = 0,57 U. mg-1 ont également été déterminées en mesurant la putrescine produite par HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). De plus, l’ODC de O. oeni BR14/97 est spécifique de la L-ornithine et ne peut pas dégrader la L-lysine en cadavérine, ce qui implique la présence d’une voie métabolique propre à la production de cadavérine chez cette souche. Dans un second axe du projet, l’influence de la source azotée et notamment des peptides versus acides aminés libres, a été étudiée chez une souche de Lactobacillus plantarum, isolée du vin et productrice de tyramine. Les peptides contenant de la tyrosine, sont utilisés par cette souche pour former de la tyramine. La production augmente en phase stationnaire de croissance, et est corrélée à l’expression du transporteur tyrP. L’analyse de la tyrosine présente dans le milieu de culture montre que ces peptides seraient dégradés dans le milieu extracellulaire chez L. plantarum. / Biogenic amines are indesirable compounds found in fermented products like wine. Lactic acid bacteria from wine, including Oenococcus oeni, the main actor of malolactic fermentation, are able to produce these molecules from nitrogenous precursors. In order to limited biogenic amines accumulation, it is necessary to understand the role of this production by strains responsible for the synthesis of these metabolites in food. That is why the European BiamFood project was put in place. Along my thesis, molecular tools were developed in order to mutate O. oeni genes (encoding decarboxylases), and to express genes of interest. Genetic clusters hdc from L. higardii and odc from O. oeni, responsible for histamine and putrescine synthesis respectively, were cloned into the pGID052 vector and transferred into the laboratory strain O. oeni ATCC BAA-1163, which is not able to produce any biogenic amines. However no biogenic amines production was observed. My work thesis was then redirected in the in vitro biochemical characterization of the ODC from O. oeni. The odc from O. oeni BR14/97 was overproduced in E. coli BL21 via the pET system. Optima pH and temperature were determined with the purified enzyme obtained. Kinetic constants Km = 1 mM and Vmax = 0,57 U.mg-1 were also determined by measuring putrescine production by HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). Furthermore, ODC from O. oeni BR14/97 is specific for the L-ornithine and can not decarboxylated the L-lysine into cadaverine. In a second part of the BiamFood project, the impact of nitrogen sources, especially peptides compared to free amino acids, was studied in a Lactobacillus plantarum strain, isolated from wine and able to produce tyramine. Peptides containing tyrosine residues are used by this strain to produce tyramine. Tyramine production increases during the growth and reaches a maximum at stationary phase. The production is correlated with tyrP expression. The tyrosine measured in culture media shows that peptides may be hydrolyzed in the extracellular medium in L. plantarum.

Les amines biogènes sont des composés allergènes, notamment rencontrés dans les produits fermentés tel que le vin. Les bactéries lactiques du vin, dont Oenococcus oeni, le principal acteur de la fermentation malolactique, sont capables de produire ces molécules, à partir de précurseurs azotés. Afin de réduire la teneur en amines biogènes, il est nécessaire de comprendre le rôle de cette production, chez les souches impliquées dans la synthèse de ces métabolites. Le projet européen BiamFood FP7 (n°211441) a été mis en place pour répondre à cette problématique. Au cours de mon travail de thèse, des outils moléculaires ont été développés afin de muter de manière ciblée les gènes de O. oeni et d'exprimer des gènes d'intérêt. Ainsi, les clusters hdc de Lactobacillus hilgardii et odc de O. oeni, responsables respectivement de la synthèse de l'histamine et de la putrescine, ont été clonés dans le vecteur pGID052 et transférés dans la souche de laboratoire O. oeni ATCC BAA-1163, déficiente pour la production d'amines biogènes. Cette stratégie n'ayant pas donnée lieu à la production d'amine biogène, mon travail de recherche s'est orienté vers la caractérisation biochimique de l'ornithine décarboxylase de O. oeni. L'ornithine décarboxylase de O. oeni BR14/97 a été sur-produite chez E. coli via le système pET. Après purification de l'enzyme, le pH optimal et la température optimale de fonctionnement, 5,5 et 35°C respectivement, ont été caractérisés. Les constantes cinétiques Km = 1 mM et Vmax = 0,57 U. mg-1 ont également été déterminées en mesurant la putrescine produite par HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). De plus, l'ODC de O. oeni BR14/97 est spécifique de la L-ornithine et ne peut pas dégrader la L-lysine en cadavérine, ce qui implique la présence d'une voie métabolique propre à la production de cadavérine chez cette souche. Dans un second axe du projet, l'influence de la source azotée et notamment des peptides versus acides aminés libres, a été étudiée chez une souche de Lactobacillus plantarum, isolée du vin et productrice de tyramine. Les peptides contenant de la tyrosine, sont utilisés par cette souche pour former de la tyramine. La production augmente en phase stationnaire de croissance, et est corrélée à l'expression du transporteur tyrP. L'analyse de la tyrosine présente dans le milieu de culture montre que ces peptides seraient dégradés dans le milieu extracellulaire chez L. plantarum.