Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’objectif de cette thèse était d’isoler de nouvelles glycoside-hydrolases à partir d’une souche de Bacillus issue d’un Biotope sud-tunisien. Cette souche a montré des potentialités à produire une amylase et une lichenase à 45°C et à pH 9. La production de ces deux hydrolases a été optimisée en fermentation solide sur millet, une agro-ressource de faible coût. Cette optimisation a été conduite en adoptant la méthodologie des plans d’expériences. Nous avons ainsi obtenu des niveaux de production de l’ordre de 540 Unités d’activités amylase par gramme de substrat solide et 503 U/g d’activité lichenase. Ces deux protéines ont été par la suite purifiées et caractérisées biochimiquement. L’amylase présente un pH et une température d’activité optimaux de 5 et 70°C, respectivement. La lichenase a montré une thermoactivité et une thermostabilité remarquables qui la distinguent des lichenases précédemment décrites. En effet, l’enzyme conserve plus de 20% de son activité à 100°C, et plus de 60% de son activité après une incubation de 30 min à 90°C. Le gène codant pour cette protéine a été isolé par la construction d’une banque fosmidique dans E. coli. La comparaison de sa séquence avec la banque de données NCBI a montré que le gène de la lichenase UEB-S possède une très forte homologie avec celle de Bacillus subtilis 168, avec les positions de deux acides aminés seulement qui divergent. Un modèle de la lichenase construit au cours de cette étude laisse supposer que l’un de ces deux acides aminés (Val 69) pourrait être impliqué dans sa thermostabilité, et ce en modifiant la géométrie du site de fixation au calcium / The aim of this thesis was to isolate new glycoside hydrolases from a Bacillus strain isolated from a Biotope in the south of Tunisia. This strain was able to produce a lichenase and an amylase at 45 ° C and pH 9. The production of these two hydrolases was optimized in solid state fermentaion using millet, a low cost. agro-resource as solid substrate. This optimization was carried out using response surface methodology (RSM) based on Doehlert design. We obtained production levels of around 540 units of amylase activity per gram of solid substrate and 503 U / g of lichenase activity.Both proteins were subsequently purified and characterized biochemically. The amylase has a pH and a temperature optimum of activity of 5 and 70 ° C, respectively. The lichenase showed a remarkable thermostability which distinguish it from described lichenases. Indeed, the enzyme retained more than 20% of its activity at 100 ° C, and more than 60% of its activity after incubation for 30 min at 90 ° C. The gene encoding this protein was isolated by the construction of genomic a library in E. coli. Comparison of its sequence with the NCBI database showed that the gene coding for UEB-S lichenase has a very high homology with that of Bacillus subtilis 168, with a difference in the position of only two amino acids A model for UEB-S lichenase built during this study suggests that one of these two amino acids (Val 69) could be involved in its thermostability probabely by changing the geometry of the calcium binding site

Le but de mon projet de doctorat est la recherche de chitosanases thermostables qui peuvent mener la réaction d'hydrolyse du chitosane à de hautes températures. La procédure mise au point pour isoler ces chitosanases était planifiée pour moduler l'effet antimicrobien du chitosane qui augmente avec son poids moléculaire. Les objectifs spécifiques de ce projet sont, mettre au point un nouveau dosage de Csn, purifier, caractériser et cloner le gène des chitosanases les plus thermostables sélectionnées et mettre au point un milieu de production de chitosanase. La première étape du projet est la recherche de nouvelles chitosanases thermostables, via un criblage ciblé de bactéries productrices de chitosanases. En effet, une nouvelle méthode d'enrichissement était utilisée par l'ajout de chitosane de différents poids moléculaires à notre source bactérienne, soit les composts. La deuxième étape, est la réalisation d'un dosage de l'activité chitosanase en utilisant le soluble-dyed Remazol Brillant Bleu-Chitosane (sRBB-C) qui a été mise au point pour détecter à grande échelle une activité chitosanase de manière facile et rapide. Enfin, la troisième étape est un test de thermostabilité en présence de substrat, appliqué à des chitosanases choisies, pour sélectionner les plus performantes à l'étape de la purification. Parmi le lot de chitosanases testées, la chitosanase notée Csn1794 s'est distinguée par sa thermostabilité à 70 degrés C, ainsi elle a été retenue pour des études plus approfondies. Les études biochimiques réalisées sur la Csn1794 après purification ont révélé qu'elle a un poids moléculaire de 40 kDa, un pH optimal de 4.8 et des K[indice inférieur m] et k[indices inférieurs cat] de 0.042 mg/ml et 7588 min[indices supérieurs -1] respectivement. Le temps de demi-vie de la Csn1794 en présence de chitosane est plus de 20 heures à 70 degrés C. L'activité de la Csn1794 varie légèrement avec le degré d'acétylation du chitosane, elle hydrolyse la carboxyméthyl-cellulose, mais pas la chitine. Le clonage du gène de la Csn1794 par génétique inverse a permis de déterminer sa séquence. Ce gène codé pour une protéine de 441 acides aminés. La Csn1794 appartient à la famille 8 des glycosides hydrolases (GH8). Le rang taxonomique de l'isolat produisant la Csn1794 a été déterminé par des méthodes classiques ainsi que par des tests de biologie moléculaire. Les résultats obtenus indiquent qu'il s'agit d'un isolat appartenant à une espèce non caractérisée appartenant au genre Paenibacillus qu'on a appelé Paenibacillus sp. 1794. Enfin, la méthode de plan d'expériences était utilisée pour mettre au point le milieu de production de la Csn1794. Les essais réalisés par les plans d'expériences Plackett-Burman ont permis non seulement de définir un milieu de base pour la production de la Csn1794, mais aussi les oligosaccharides et le sucrose se sont distingués comme facteurs à effet nettement positif sur la production de la Csn1794. Les essais par plans d'expérience Box-Hunter ont permis l'étude d'interactions entre les différents facteurs dont le niveau était déterminé par les plans Taguchi. Les résultats obtenus indiquent qu'en plus de milieu de base, l'ajout de 10g/l de glucosamine, 7g/l d'oligosaccharide et 4g/l de sucrose constitue la meilleure combinaison pour un milieu qui permet de produire une moyenne de 7U/ml de Csn1794 d'une manière constante. En conclusion, nous disposons d'une nouvelle chitosanase thermostable, facile à produire et à purifier, qui sera un outil adéquat pour l'application au niveau industriel. Ceci va non seulement permettre de mener le processus d'hydrolyse de chitosane à haute température, mais aussi d'utiliser de grandes concentrations de substrat sans que la viscosité ne devienne excessive. Au niveau de la recherche fondamentale, la Csn1794 peut nous apporter plus d'informations d'une part, sur la thermostabilité des enzymes et d'autre part, sur les enzymes de la famille GH8, notamment les chitosanases.

L'activité cellulolytique est recherchée chez des champignons filamenteux microscopiques isolés de sols environnant les sources thermales des régions Guelma (Hammam Debagh) et de Mila (Hammam Grouz-Atmania et Hammam Safsaf-Teleghma). 88 souches fongiques sont isolées, appartenant à six genres différents : Aspergillus, Alternaria, Emericella, Fusarium, Penicillium et Trichoderma. Leur sélection (test au papier filtre et le test des plaques à trous), montre que seule la souche J2 possède une activité cellulolytique importante, comparable à celle de la souche T. reesei Rut C-30. Cet isolat appartient à l'espèce Trichoderma longibrachiatum Rifai. A 35°C, notre isolat ne montre pas de différences significatives des activités papier filtre et endoglucanase par rapport à T. reesei Rut C-30, mais l'activité β-glucosidase produite par notre isolat est deux fois plus que celle produite par cette dernière. Avec un taux d'ensemencement de 106spores/ml, la souche est en activité maximale. Un bon rendement en enzyme est obtenu avec des spores âgées de 6 jours. La souche D choisie du sous-clonage, est cultivée en fermenteur de 4 litres sur le milieu minéral Mandel Avicel 1%, et produit un maximum d'activité papier filtre 1.88UI/ml, d'activité endoglucanase 11.22UI/ml et d'activité β-glucosidase 0.64UI/ml après 128 heures, 144 heures et 120 heures d'incubation, respectivement. Les enzymes papier filtre et endoglucanase sont optimalement active à 60°C et 55°C, respectivement. Un pH optimum de 4.0 et 5.0 pour l'activité papier filtre, alors que l'activité endoglucanase à un pH optimum de 4.0. L'activité endoglucanase est thermostable, elle résiste à un traitement thermique pendant 5 heures à 70°C, 80% de son activité originale est maintenue. La demi-vie de l'activité papier filtre est de 3 heures à 60°C. Le substrat CMC améliore la stabilité thermique de ces enzymes. Ces enzymes sont stables à 50°C pendant 5 heures dans une gamme de pH de 3.0 à 6.0 et 4.0 à 6.0, respectivement. L'EDTA (5 mM), provoque une forte diminution des enzymes, alors que, le β-mercaptoethanol (5 mM) conduit à leur activation. Les cations divalents calcium (Ca2+) et zinc (Zn2+), provoquent une augmentation et une amélioration des activités enzymatiques en présence de l'EDTA. L'extrait enzymatique brut est capable d'hydrolyser les substrats cellulosiques insolubles, cette enzyme peut ainsi être classée comme un type endo et exo de la cellulase. Par ces caractéristiques, production de l'enzyme, thermostabilité et pH acide, notre souche sauvage Trichoderma longibrachiatum peut être attractive en industrie pour la production de la cellulase.Mots clés : Moisissures, isolement, écosystèmes extrêmes, cellulase, thermostabilité. / Filamentous fungi found in soils surrounding the hydrothermal stations of regions in the east of Algeria: Guelma (Hammam Debagh) and Mila (Hammam Grouz-Atmania, Hammam Safsaf-Teleghma), are screened for the presence of cellulase activity. 88 fungal strains were isolated and identified from six kinds: Aspergillus, Alternaria, Emericella, Fusarium, Penicillium and Trichoderma. Their selection (filter paper test and test of perforated plates) shows that only the strain J2 has a significant cellulolytic activity. This isolate belongs to the species of Trichoderma longibrachiatum Rifai. At 35°C, our isolate shows equivalent activities filter paper and endoglucanase than T. reesei. On the other hand the β-glucosidase activity of our isolate was until twice more important than T. reseei one. With an inoculum size of 106 spores/ml the strain produces the maximum enzyme activities. A good yield of enzyme is obtained with spores aged of six days. The strain D allowed from subcloning cultivated in 4 liter fermenter on Mandels medium with cellulose Avicel (1%) produces maximum activities of filter paper (1.88UI/ml), endoglucanase (11.22UI/ml) and β-glucosidase (0.66UI/ml) after 128 hours, 144 hours and 120 hours, respectively. The optimum temperatures were 55°C and 60°C for endoglucanase and FPA, respectively. The endoglucanase was optimally active at pH 4.0, and the FPA was optimal at pH 4.0 and 5.0. The endoglucanase was thermostable at 70°C after 5 hours incubation, preserved 80% of the original activity. The half-life of the filter paper activity appeared to be 3 hours at 60°C. These activities were stable at 50°C after 5 hours incubation in a pH range of 3.0 to 6.0 and 4.0 to 6.0, respectively. The EDTA (5mM) causes a significant diminution of the enzymes, while the β-mercaptoethanol (5mM) leading to their activation. Divalent cations calcium (Ca2+) and zinc (Zn2+) cause an increase and improvement of enzymes activities in the presence of EDTA (5mM). The crude enzyme extract is able to hydrolyse insoluble cellulosic substrates. This enzyme can be classified as an endo and exo type of the cellulase. These results suggested that the no-mutated strain Trichoderma longibrachiatum should be an attractive producer for cellulases production.Keywords: Fungi; isolation; extreme ecosystems; cellulase; thermostability.

Cette thèse de doctorat s’inscrit dans le cadre de l’étude in silico des relations qui lient la séquence d’une protéine à sa structure, sa stabilité et sa fonction. Elle a pour objectif de permettre à terme la conception rationnelle de protéines modifiées qui restent actives dans des conditions physico chimiques non physiologiques. Nous nous sommes plus particulièrement penchés sur la stabilité thermique des protéines, qui est définie par leur température de fusion Tm au delà de laquelle leur structure n’est thermodynamiquement plus stable. Notre travail s’articule en trois grandes parties : la recherche de facteurs favorisant la thermostabilité des protéines parmi des familles de protéines homologues, la mise sur pied d’une base de données de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, de laquelle sont dérivés des potentiels statistiques dépendant de la température, et enfin la mise au point de deux outils bioinformatiques visant à prédire d’une part la Tm d’une protéine à partir de la Tm de protéines homologues et d’autre part les changements de thermostabilité d’une protéine (Tm) engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle. La première partie a pour objectif l’identification des facteurs de séquence et de structure (e.g. fréquence de ponts salins, d’interactions cation-{pi}) responsables des différentes stabilités thermiques de protéines homologues au sein de huit familles (chapitre 2). La spécificité de chaque famille ne nous a pas permis de généraliser l’impact de ces différents facteurs sur la stabilité thermique des protéines. Cependant, cette approche nous a permis de constater la multitude de stratégies différentes suivies par les protéines pour atteindre une plus grande thermostabilité. La deuxième partie concerne le développement d’une approche originale pour évaluer l’influence de la température sur la contribution de différents types d’interactions à l’énergie libre de repliement des protéines (chapitres 3 et 4). Cette approche repose sur la dérivation de potentiels statistiques à partir d’ensembles de protéines de thermostabilité moyenne distincte. Nous avons d’une part collecté le plus grand nombre possible de protéines de structure et de Tm déterminées expérimentalement, et d’autre part développé des potentiels tenant compte de l’adaptation des protéines aux températures extrêmes au cours de leur évolution. Cette méthode originale a mis en évidence la dépendance en la température d’interactions protéiques tels les ponts salins, les interactions cation-{pi}, certains empilements hydrophobes ... Elle nous a en outre permis de mettre le doigt sur l’importance de considérer la dépendance en la température non seulement des interactions attractives mais également des interactions répulsives, ainsi que sur l’importance de décrire la résistance thermique par la Tm plutôt que la Tenv, température de l’environnement de l’organisme dont elle provient (chapitre 5). La dernière partie de cette thèse concerne l’utilisation des profils énergétiques dans un but prédictif. Tout d’abord, nous avons développé un logiciel bioinformatique pour prédire la thermostabilité d’une protéine sur la base de la thermostabilité de protéines homologues. Cet outil s’est avéré prometteur après l’avoir testé sur huit familles de protéines homologues. Nous avons également développé un deuxième outil bioinformatique pour prédire les changements de thermostabilité d’une protéine engendrés par l’introduction d’une mutation ponctuelle, en s’inspirant d’un logiciel de prédiction des changements de stabilité thermodynamique des protéines développé au sein de notre équipe de recherche. Ce deuxième algorithme de prédiction repose sur le développement d’une grande base de données de mutants caractérisés expérimentalement, d’une combinaison linéaire de potentiels pour évaluer la Tm, et d’un réseau de neurones pour identifier les coefficients de la combinaison. Les prédictions générées par notre logiciel ont été comparées à celles obtenues via la corrélation qui existe entre stabilités thermique et thermodynamique, et se sont avérées plus fiables. Les travaux décrits dans notre thèse, et en particulier le développement de potentiels statistiques dépendant de la température, constituent une nouvelle approche très prometteuse pour comprendre et prédire la thermostabilité des protéines. En outre, nos travaux de recherche ont permis de développer une méthodologie qui pourra être adaptée à l’étude et à la prédiction d’autres propriétés physico chimiques des protéines comme leur solubilité, leur stabilité vis à vis de l’acidité, de la pression, de la salinité ... lorsque suffisamment de données expérimentales seront disponibles.

La levure Saccharomyces cerevisiae est capable d’utiliser une grande variété de sucres comme source de carbone et d’énergie. La plupart des enzymes impliquées dans l’utilisation de ces sucres sont codées par des gènes issus de familles multigéniques. C’est le cas de la famille IMA identifiée comme impliquée dans l’utilisation de l’isomaltose. Cette famille comprend cinq gènes qui codent pour quatre isomaltases partageant une forte identité de séquence (de 65% à 100 %). Dans ce travail , la diversitéfonctionnelle de la famille IMA a été étudiée, en caractérisant de façon exhaustive in vitro leurs propriétés biochimiques et enzymologiques. Ima1p et Ima2p possèdent des propriétés biochimiques identiques (pH, température, et thermostabilité) mais Ima3p se distingue par rapport à ces deux protéines bien que n’ayant que trois acides de différence avec Ima2p (thermostabilité plus faible). Ima5p quant à elle, est la protéine la plus dissemblable (température optimale plus faible et demi-vie basse dès 37°C). Les quatre isomaltases sont cependant très sensibles au Tris et aux ions Fe3+. Les quatre isoenzymes présentent une préférence pour les disaccharides liés en α-1,6 (isomaltose et palatinose), avec une cinétique de type Michaëlis-Menten et une inhibition par le substrat à une concentration élevée. Les isomaltases Imap sont cependant aussi capables d'hydrolyser les disaccharides α-1,2, α-1,3 et α-1,5 ainsi que les trisaccharides portant une liaison α-1,6, ce qui met en évidence leur ambiguïté de substrat .Nos résultats ont toutefois montré de nombreuses singularités dans cette famille de protéines. Alors que Ima1p et Ima2p présentent des propriétés très semblables, l’activité catalytique de Ima3p est globalement très faible malgré sa forte ressemblance avec Ima2p. Le variant Ima3p_R279Q retrouve des niveaux d'activité proches de ceux d’Ima2p, tandis que la substitution d’une leucine par une proline à la position 240 a permis d’augmenter de manière significative la stabilité d’Ima3p confirmant le rôle des prolines dans la thermostabilité des protéines. L’hydrolyse de l’isomaltose par Ima5p réfute lesconclusions précédemment publiées sur l'exigence d'acides aminés spécifiques pour déterminer la spécificité de α-1,6 puisque le variant IMA5-MQH ne permet pas de restaurer une activité semblable à Ima1p malgré la présence des trois résidus MQH. Nous avons également trouvé qu’Ima5p est inhibé par le maltose suivant une inhibition mixte tandis qu’Ima1p est inhibée de façon compétitive à faible concentration et de manière incompétitive à forte concentration en isomaltose / Most enzymatic systems for sugar uptake and assimilation rely on multigene families in theyeast Saccharomyces cerevisiae. The IMA / MAL family has been used as a model system to study themolecular mechanisms that govern evolution of duplicated genes. The five IMA multigene familymembers encode four isomaltases sharing high sequence identity from 65% to 99%, of which IMA3and IMA4 are 100% identical to encode the same isomaltase. In this work, the functional diversity ofIMA family was further explored, with exhaustive in-vitro characterization of their biochemical andenzymological properties.Ima1p and Ima2p were similar to biochemical properties; Ima3p showed some differences fromthe two proteins; amongst them, Ima5p was the most distant protein. The four isomaltases were highlysensitive to Tris and Fe3+, but were unaffected by the addition or the removal of Ca2+ despiteconservation of the calcium binding site. Besides, four isoenzymes exhibited a preference for the α-(1,6)disaccharides isomaltose and palatinose, with Michaelis-Menten kinetics and inhibition at highsubstrates concentration. They were also able to hydrolyse trisaccharides bearing an α-(1,6) linkage,but also α-(1,2), α-(1,3) and α-(1,5) disaccharides including sucrose, highlighting their substrateambiguity. While Ima1p and Ima2p presented almost identical characteristics, the results neverthelessshowed many singularities within this protein family. In particular, Ima3p presented lower activitiesthan Ima2p despite only 3 different amino acids between these two isoforms. The Ima3p_R279Qvariant recovered activity levels of Ima2p, while the Leu-to-Pro substitution at position 240significantly increased the stability of Ima3p and supported the role of prolines inthermostability.Ima5p presented the lower optimal temperature and was also extremely sensitive to temperature. Isomaltose hydrolysis by Ima5p challenged previous conclusions about the requirement of specificamino acids for determining the specificity for α-(1,6) substrates. We finally found a mixed inhibitionby maltose for Ima5p while, contrary to a previous work, Ima1p inhibition by maltose was competitiveat very low isomaltose concentrations and uncompetitive as the substrate concentration increased.The presented Ph.D’s work provided preliminary insights into determining structural factorswithin this family, exemplifying for example the role of proline residues for thermosability. Moreover,it was illustrated that a gene family encoding proteins with strong sequence similarities can lead toenzyme with notable differences in biochemical and enzymological properties.

Les phytases hydrolysent les phytates représentant la forme majeure de stockage du P dans les céréales. Ces phytates sont aussi des facteurs anti-nutritionnels qui chélatent les cations réduisant leur absorption. Dans le premier volet de cette thèse, une nouvelle souche bactérienne produisant une phytase extracellulaire a été isolée et identifiée comme Bacillus amyloliquefaciens US573. L’enzyme «PHY US573» a été purifiée et caractérisée en comparaison avec deux phytases commerciales Ronozyme PL et Natuphos. PHY US573 se distingue par sa forte thermostabilité en présence de calcium. En outre, PHY US573 se caractérise aussi par une tolérance remarquable aux sels comme le NaCl et LiCl. L’ensemble de ces propriétés montre que PHY US573 pourrait être une candidate intéressante pour des applications en alimentation animale ou en agriculture pour améliorer la biodisponibilité du P-phytique pour les plantes. Dans le deuxième volet, la souche Streptomyces sp. US42 produisant une activité phytase extracellulaire a été sélectionnée. L’enzyme «PHY US42» a été purifiée et caractérisée. PHY US42 est calcium dépendante également une grande stabilité en présence de sels biliaires et des protéases digestives. La modélisation moléculaire de PHY US42 indique qu'elle appartient au groupe des β-propeller phytases qui sont généralement calcium-dépendantes. Vu ses propriétés biochimiques intéressantes, PHY US42 constitue une bonne candidate comme additif dans les aliments pour animaux monogastriques en combinaison avec une histidine acide phytase. Enfin dans un troisième volet, nous nous sommes intéressés à l’étude de la régulation de l'expression du gène phytase de S. coelicolor M145 (sco7697) chez S. coelicolor M145, S. lividans TK24 ainsi que chez ses deux mutants ppk et phoP. Ainsi, en plus des boites pho localisées en amont de la région promotrice -35 siège de la régulation positive PhoP-dépendante, nous avons révélé pour la première fois que la RD localisée en aval de la région promotrice -10 est le siège d’une forte régulation négative par un répresseur inconnu. Ce dernier empêcherait l’activation PhoP-dépendante de l’expression du gène phytase. / Phytases hydrolyse phytate representing the major storage form of P in cereal. phytates are also anti-nutritional factors that chelate cations such as Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Z²⁺ reducing their absorption. The low bioavailability of phytic phosphorus in monogastric animals require their food supplementation with Pi to meet the needs of the animal in P. This creates an extra cost and increases the environmental pollution by the manure excretion highly charged phosphate. In the first part of this thesis, from soil samples taken near hot hydrothermal waters of the region Elhamma in southern Tunisian, a new bacterial strain producing extracellular phytase was isolated and identified as Bacillus amyloliquefaciens US573. The enzyme referred "PHY US573" was purified and characterized in comparison with two commercial acid histidine phytases Ronozyme PL and Natuphos. PHY US573 is calcium dependent and has an optimum activity at pH 7.5 (5 for Ronozyme and 5.5 for Natuphos) and 70°C (55°C for Ronozyme and Natuphos). PHY US573 is distinguished by its high thermostability, in fact, it keeps 93% of its activity after incubation for 10 min at 75°C in the presence of calcium while Ronozyme and Natuphos keep only 45% and 53% of their activity, respectively. This enzyme is specific for phytic acid and also has a very good stability at pH 3 to 9 and a perfect stability in presence of bile salts. In addition, PHY US573 is also characterized by a remarkable salt tolerance because it retains 80 to 95% of its activity in the presence of 20 g/l of NaCl and LiCl, respectively. All these properties shows that PHY US573 could be an interesting candidate for applications in feed industry alone or in combination with an histidine acid phytase. In a second part of this thesis, from the Streptomyces collection of LMB-CBS, a strain producing extracellular phytase activity was selected and identified as Streptomyces sp. US42. The enzyme "PHY US42" was purified and characterized. PHY US42 has a calcium-dependent activity (such as Bacillus phytases), optimally active at pH 7 and 65°C. PHY US42 is perfectly stable at pHs ranging from 5 to 10 and its thermal stability is greatly increased in the presence of calcium. Indeed, PHY US42 maintains 80% of its activity after 10 min of incubation at 75 °C in the presence of calcium. PHY US42 has also a high stability in the presence of bile salts and digestive proteases. Molecular modeling of PHY US42 indicates that it belongs to the β-propeller phytase group which are usually calcium-dependent. Given its interesting biochemical properties, PHY US42 which would operate mainly in the intestine, is a good candidate for use as an additive in agastriques fish food or in combination with an histidine acid phytase in feed industry. Finally in a third part, we are interested in studying the regulation of the expression of the phytase gene of S. coelicolor M145 (sco7697) in S.coelicolor M145, S.lividans TK24 and among its two mutants ppk and phoP. To do this, we merged the wild promoter regions (phyWT) or mutated (phym1, phym2, phym1+2) of sco7697 gene with the GUS reporter gene encoding ß-glucuronidase activity. Thus as expected, we demonstrated that the deletion of the PHO box located upstream of the -35 reduces the level of induction of sco7697 in conditions of Pi limitation. Moreover, we have revealed for the first time that the alteration of RD located downstream of -10 correlates with a dramatic increase of GUS expression when PhoP is present. Our results demonstrate that this RD is the seat of a strong negative regulation by an unknown repressor. This would prevent the PhoP-dependent activation of expression of the phytase gene.

L’usage excessif d’antibiotiques a provoqué l’émergence de résistance, constituant un problème sanitaire mondial. L’antibiotique triméthoprime (TMP) inhibe l’enzyme dihydrofolate réductase (FolA) des bactéries, interrompant la production d’un précurseur essentiel dans la synthèse des purines et empêchant ainsi la croissance bactérienne. Cependant, certaines bactéries produisent une seconde dihydrofolate réductase : une DfrB, appartenant à une famille d’enzymes hautement résistantes au TMP. Actuellement, dix membres de la famille DfrB ont été identifiés, qui partagent une identité de séquence élevée (74 – 98 %). Les enzymes DfrB sont constituées de domaines identiques de 78 acides aminés, de type ‘SH3-like’, qui s’homotétramérisent afin de former l’enzyme active. Les DfrB ne partagent aucune homologie de séquence ou de structure avec les FolA et aucun antibiotique n’a encore été développé pour contourner la résistance au TMP causée par les DfrB. Afin de mieux comprendre le domaine SH3-like, des homologues (DfrB-H) partageant 10 à 80 % d’identité avec la DfrB1 ont été identifiés et caractérisés. Ils possèdent une activité dihydrofolate réductase (Dfr) et confèrent de la résistance au TMP. De plus, afin de vérifier si les gènes dfrB se retrouvent dans divers environnements, une recherche dans une base de données métagénomiques a été entreprise, permettant de caractériser 10 nouvelles séquences homologues aux DfrB connues. En 2012, le groupe Pelletier a rapporté le premier inhibiteur spécifique d’une DfrB, et plusieurs autres depuis. Seule la DfrB1 a été caractérisée concernant son profil d’inhibition ainsi que sa thermostabilité inhabituelle. Ici, une méthode semi-automatisée sera développée pour caractériser les profils d’inhibition, de thermostabilité, de résistance au TMP et d’activité enzymatique de toutes les DfrB et des homologues identifiés, afin de les comparer à ceux de la DfrB1. Pour atteindre ces objectifs, des nouvelles méthodes à haut débit de détermination d’activité ainsi que des tests de concentration minimale inhibitrice (CMI) furent développés. Ces méthodes ont permis de déterminer que les profils de thermostabilité et d’inhibition de plusieurs DfrB et DfrB-H sont comparables aux profils de la DfrB1. De plus, le criblage de dizaines de composés potentiellement inhibiteurs a été effectué afin de poursuivre la recherche d’inhibiteurs spécifiques aux DfrB. En outre, nous signalons 10 nouvelles séquences homologues de DfrB qui confèrent une résistance élevée au TMP et possèdent une activité Dfr. La caractérisation de tous les membres DfrB et les homologues nous permettra d’acquérir une meilleure connaissance de leur mécanisme de résistance, de leur prévalence dans divers environnements et de soutenir notre développement de nouveaux inhibiteurs des DfrB. / The intensive usage of antibiotics has provoked the emergence of antibiotic resistance, causing a worldwide health issue. The antibiotic trimethoprim (TMP) targets the microbial dihydrofolate reductase enzyme (FolA), abrogating the production of an essential precursor in the synthesis of purines and thus preventing bacterial proliferation. However, some bacteria produce an additional dihydrofolate reductase: the highly TMP-resistant DfrB. Currently, ten DfrB family members have been identified, that share high sequence identity (74 – 98 %). DfrB enzymes consist of identical, 78 amino acid-long SH3-like domains, that homotetramerize to form the active enzyme. DfrB share no sequence or structural homology with FolA and no antibiotic has yet been developed to circumvent the TMP resistance caused by DfrB. In order to gain insight into the SH3-like domain of DfrB, homologues (DfrB-H) sharing 10 to 80 % identity with DfrB1 were identified and characterized, which displayed dihydrofolate reductase (Dfr) activity and conferred high TMP resistance. Also, to investigate if dfrB genes are identified in various environments, a metagenomic database search was undertaken to characterize ten new DfrB1 homologue sequences. In 2012, the Pelletier group reported the first specific inhibitor of a DfrB, and several others since. Only DfrB1 has been characterized regarding its inhibition profile as well as its unusual thermostability. Here, semi-automated methods will be developed to compare the inhibition, thermostability, TMP-resistance and enzymatic activity profiles of all DfrB and DfrB homologues to those of DfrB1. To address this objective, new high-throughput activity assays as well as Minimal Inhibitory Concentration (MIC) assays were developed. Using those methods, we determined that thermostability and inhibition profiles of several DfrB and DfrB-H were comparable to those of DfrB1. Also, a screen of several dozen potential inhibitory compounds was performed, to attempt to identify further specific DfrB inhibitors. In addition, we report 10 new DfrB homologues that confer high TMP resistance and possess Dfr activity. The characterization of all DfrB members and DfrB homologues will allow us to acquire greater knowledge on their antimicrobial resistance mechanism, their prevalence in different environments and support our development of new DfrB-specific inhibitors.

Les amylosaccharases sont des α-transglucosylases catalysant naturellement la synthèse exclusive d’α-1,4-glucanes à partir du saccharose. Ces enzymes produisent également des composés secondaires et, en particulier, des isomères du saccharose tels que le turanose et le tréhalulose.L’objectif de cette thèse a consisté à utiliser un panel de techniques biophysiques et biochimiques afin d’étudier les amylosaccharases de Deinococcus geothermalis (ASDg) et Neisseria polysaccharea (ASNp) afin de comprendre les relations unissant la structure, la flexibilité et la fonction de ces enzymes.La première étude rapporte la caractérisation structurale et biophysique de l’amylosaccharase la plus thermostable connue à ce jour, l’amylosaccharase de Deinococcus geothermalis. La structure tridimensionnelle révèle une organisation dimérique en solution, jamais rapportée pour une amylosaccharase. Grâce à l’analyse de l’interface dimérique et à des travaux d’analyse de séquences, une séquence signature de dimérisation a été identifiée. En rigidifiant la structure de l’ASDg, la structure quaternaire contribue à l’augmentation de la stabilité thermique de la protéine. La spécificité de production des isomères du saccharose par les amylosaccharases a été étudiée. Les résultats décrivent, pour la première fois, les structures de l’ASDg et de l’ASNp en complexe avec le turanose. Dans l’ASNp, les résidus clefs forcent le résidu fructosyle à adopter une conformation linéaire positionnant idéalement le O3’ pour sa glucosylation expliquant la formation préférentielle de turanose par l’enzyme. Ces résidus sont absents ou placés différemment dans l’ASDg. En conséquence, l’ASDg lie principalement les formes furanoses du fructose avec un faible réseau d’interactions. La topologie du sous-site +1 permet donc différents modes de liaison du fructose en accord avec la capacité de l’ASDg à produire une plus grande quantité de tréhalulose par rapport à l’ASNp.Dans la seconde étude, des techniques de mutagenèse à saturation et combinatoire ciblées sur les acides aminés voisins du site actif ont été utilisées pour modifier la spécificité d'accepteur de l’ASNp. Le criblage de trois bibliothèques semi-rationnelles représentant un total de 20 000 variants a permis d’isoler trois doubles mutants montrant une amélioration spectaculaire de spécificité à la fois vis-à-vis du saccharose, le substrat donneur et de l’accepteur α-allyl-N-acetyl-2-désoxy-α-D-glucopyranoside par rapport au type sauvage de l’ASNp. De tels niveaux d'amélioration d'activité n'ont jamais été signalés auparavant pour cette classe d’enzymes actives sur les sucres. L’analyse par cristallographie des rayons X de la structure des meilleures enzymes mutantes suivie par des simulations de dynamique moléculaire ont montré une rigidité locale du sous-site -1 couplée à une flexibilité des boucles impliquées dans la topologie du site actif. Ces faits pourraient être à l’origine des performances catalytiques accrues de ces enzymes mutantes. L'étude démontre l'importance, lors de la conception des bibliothèques de variants, de tenir compte de la conformation locale des résidus catalytiques ainsi que de la dynamique des protéines au cours du processus catalytique / Amylosucrases are sucrose-utilizing α-transglucosylases that naturally catalyze the synthesis of α-glucans, exclusively linked through α-1,4 linkages. Side-products and in particular sucrose isomers such as turanose and trehalulose are also produced by these enzymes.The objective of this thesis concerned the application of biophysical and biochemical techniques to study amylosucrases from Deinococcus geothermalis (DgAS) and Neisseria polysaccharea (NpAS) in order to investigate relationships between structure, flexibility and function of these enzymes.In the first study, we report the first structural and biophysical characterization of the most thermostable amylosucrase identified so far, the amylosucrase from Deinoccocus geothermalis. The 3D-structure revealed a homodimeric quaternary organization, never reported before for other amylosucrases. A sequence signature of dimerization was identified from the analysis of the dimer interface and sequence alignments. By rigidifying DgAS structure, the quaternary organization is likely to participate in the enhanced thermal stability of the protein. Amylosucrase specificity with respect to sucrose isomer formation (turanose or trehalulose) was also investigated. We report the first structures of the DgAS and NpAS in complex with turanose. In NpAS, key residues were found to force the fructosyl moiety to bind in an open state with the O3' ideally positioned to explain the preferential formation of turanose by NpAS. Such residues are either not present or not similarly placed in DgAS. As a consequence, DgAS binds the furanose tautomers of fructose through a weak network of interactions to enable turanose formation. Such topology at subsite +1 is likely favoring other possible fructose binding modes in agreement with the higher amount of trehalulose formed by DgAS.In the second study, iterative saturation mutagenesis and combinatorial active site saturation focused on vicinal amino acids were used to alter the acceptor specificity of NpAS and sort out improved variants. From the screening of three semi-rational sub-libraries accounting in total for 20,000 variants, we report here the isolation of three double-mutants displaying a spectacular specificity enhancement towards both sucrose, the donor substrate, and the α-ally-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside acceptor compared to wild-type N. polysaccharea amylosucrase. Such levels of activity improvement have never been reported before for this class of carbohydrate-active enzymes. X-ray structural analysis of the best performing enzymes followed by Molecular Dynamics simulations showed both local rigidity of the -1 subsite and flexibility of loops involved in active site topology which both account for the enhanced catalytic performances of the mutants. The study well illustrates the importance when designing enzyme libraries of taking into account the local conformation of catalytic residues as well as protein dynamics during the catalytic process

Le Rovabio Excel ™ est un cocktail enzymatique complexe sécrété par le champignon filamenteux Penicillium funiculosum. La société ADISSEO commercialise cet additif alimentaire destiné à la nutrition animale car les principales enzymes qui le constituent dégradent les polymères contenus dans les céréales, tels que les polysaccharides non amylacés. Ainsi, le Rovabio Excel™ permet d’améliorer la digestibilité et d’augmenter la valeur nutritionnelle des matières premières agricoles en réduisant la viscosité du bol alimentaire des animaux. Dans le but d’augmenter sa compétitivité, ADISSEO a fait conduire des études sur cette solution pour la caractériser biochimiquement et optimiser son potentiel xylanolytique.Ces travaux de thèse s’inscrivent dans ces projets industriels et ont poursuivi deux objectifs distincts. Le premier correspondait à l’augmentation de la thermostabilité de la protéine XynB du Rovabio Excel™, pour lui permettre de résister à la granulation. Le second concernait XynA, la protéine majoritaire de la solution multienzymatique, qui a été caractérisée biochimiquement. Les premiers résultats de caractérisation biochimique de XynA ont montré que la protéine était 100 fois plus active sur β-1,4-glucane que sur xylane. Des tests complémentaires sur pNP-cellobiose et pNP-β-D-Lactopyranose ont révélé que XynA était 5,2 fois plus active sur pNP-cellobiose et possédait une activité « exo ». Enfin, l’analyse des produits d’hydrolyse d’oligosaccharides composés de 2 à 5 unités de glucose a confirmé que la protéine XynA était une cellobiohydrolase de type I, très sensible à l’inhibition par le cellobiose (IC50 - C2 = 17,7 µM). L’étude la thermostabilité de XynB a confirmé que cette protéine n’était pas naturellement thermostable. Les résultats des travaux d’ingénierie avec l’ajout d’un pont disulfure pour rigidifier la structure 3D de la protéine n’ont pas été probants. En revanche, la création de protéines chimères à partir de protéines plus thermostables (TfxA de Thermomonospora fusca et XynII de Trichoderma reesei) a permis d’améliorer la stabilité thermodynamique de XynB avec des Tm augmentés de plus de 10°C / The Rovabio Excel™ is a complex enzymatic cocktail secreted by the filamentous fungus Penicillium funiculosum. The ADISSEO company sells it as food additive for animal feed because the main enzymes degrade polymers contained in grains, such as non-starch polysaccharides. Thus, the Rovabio Excel™ improves the digestibility and increases the nutritional value of agricultural raw materials by reducing the viscosity of the diet of animals. In order to increase its competitiveness, ADISSEO did conduct studies on this solution to characterize it biochemically and maximize its xylanolytic potential.This thesis takes part of this industrial project and have pursued two distinct objectives. The first corresponds to the increase in the thermostability of the protein XynB from the Rovabio Excel™, to enable it to resist at the granulation process. The second was XynA, the major protein of the multienzyme solution, which was characterized biochemically.Initial results of biochemical characterization of XynA showed that the protein was 100 times more active on β-1,4-glucan on xylan. Additional tests on pNP-cellobiose and pNP-β-D-Lactopyranose revealed that XynA was 5.2 times more active on pNP-cellobiose and possess an "exo-acting" activity. Finally, the analysis of products from oligosaccharides hydrolysis, composed of 2 to 5 units of glucose, confirmed that the protein XynA was a type I cellobiohydrolase, very sensitive to inhibition by cellobiose (IC50-C2 = 17.7 µM).The thermostability of XynB study has confirmed that this protein was not thermostable naturally. The results of the engineering work with the addition of a disulfide bridge to rigidify the 3D structure of the protein were not conclusive. However, the creation of chimeric proteins with more thermostable proteins (TfxA from Thermomonospora fusca and XynII from Trichoderma reesei) has improved the thermodynamic stability of XynB with Tm increased by more than 10°C