Le gène Wilms’ Tumor 1 (WT1), localisé en 11p13, code pour une protéine régulatrice de la transcription. Initialement découvert du fait de son altération dans la tumeur de Wilms, le gène WT1 s’est avéré être aussi impliqué dans les hémopathies malignes, en particulier les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Le rôle de WT1 dans les LAM a été souligné par la présence d’une surexpression de WT1 dans la majorité des LAM et de mutations de WT1 dans environ 10% des cas, mais sa contribution à la leucémogenèse reste à préciser. Evaluer la fréquence, les caractéristiques associées et l’impact pronostique des mutations de WT1 et du SNP (single nucleotide polymorphism) rs16754 de WT1 dans les LAM, et déterminer si la maladie résiduelle (minimal residual disease, MRD) utilisant l’expression de WT1 (MRD-WT1) est prédictive de l’évolution clinique. Méthodes. Les mutations des exons 7 et 9 de WT1, ainsi que le SNP rs16754, ont été recherchés sur des échantillons diagnostiques sanguins ou médullaires de 517 patients présentant une LAM de novo et traités dans les protocoles français ALFA-9801 ou ALFA-9802. L’exon 7 (incluant le SNP rs16754) et l’exon 9 de WT1 ont été amplifiés par PCR sur ADN génomique puis séquencés selon la méthode de Sanger. Les taux de transcrits de WT1 ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR) au diagnostic et au cours du suivi thérapeutique chez un total de 221 patients atteints de LAM et traités par chimiothérapie intensive. Résultats. Dans la cohorte du protocole ALFA-9802 (patients âgés de 15 à 50 ans), les mutations de WT1 ont été identifiées chez 14/268 (5%) patients. Les mutations de WT1 étaient associées à un âge plus jeune (p=0.02) et à la présence d’une duplication en tandem de FLT3 (p=0.03). Les patients mutés WT1 présentaient un risque de rechute accru (82% vs 46% à 4 ans, p<0.001) et une survie globale plus courte (22% vs 56% à 4 ans, p=0.01) que les patients non mutés. Au sein des LAM à caryotype normal (LAM-CN) (n=106), la présence d’une mutation de WT1 constituait un facteur défavorable indépendant pour le risque de rechute. Dans la cohorte du protocole ALFA-9801 (patients âgés de 50 à 70 ans), la fréquence des mutations de WT1 était seulement de 6/249 (2.5%). En raison du faible effectif de patients mutés, la valeur pronostique des mutations de WT1 n’a pas pu être étudiée dans cette tranche d’âge. L’allèle minoritaire du SNP rs16754 a été retrouvé chez 141/511 (28%) patients, à l’état hétérozygote (WT1AG) chez 123 (24%) patients et homozygote (WT1GG) chez 18 (4%) patients. Dans la cohorte globale ainsi que dans le sous-groupe de LAM-CN (n=208), le statut du SNP rs16754 n’a pas montré d’impact pronostique significatif sur l’évolution clinique. Au total, 80-90% des échantillons présentaient une surexpression de WT1 au diagnostic. Les taux de transcrits de WT1 au diagnostic étaient plus élevés dans les LAM avec cytogénétique favorable, c’est-à-dire t(15;17), t(8;21), ou inv(16)/t(16;16), et les LAM avec mutations de NPM1, et plus bas dans le sous-type FAB M5 et en cas de réarrangement du gène MLL. Le taux d’expression de WT1 au diagnostic n’était pas corrélé à l’évolution clinique. Après la chimiothérapie d’induction, un taux faible de MRD-WT1 était associé à un risque de rechute inférieur et une survie plus longue (p<0.001). La décroissance de la MRD-WT1 exprimée en log réduction était aussi significativement associée au risque de rechute, même après ajustement sur l’âge, la leucocytose initiale et la cytogénétique (p=0.004). En fin de consolidation, la MRD-WT1 était également prédictive du risque de rechute (p=0.004). Conclusion. Dans cette étude, les mutations de WT1 et la MRD-WT1, mais pas le SNP rs16754, sont significativement associées à l’évolution clinique dans les LAM. Ces résultats suggèrent que les mutations de WT1 et la MRD-WT1 pourraient contribuer à améliorer l’évaluation pronostique et la prise en charge thérapeutique des patients atteints de LAM. / Wilms’ tumor 1 (WT1) gene, located at chromosome band 11p13, encodes a transcriptional regulator. Originally named for its role in Wilms’ tumor, a pediatric kidney malignancy, WT1 has since been found to be implicated in several hematological malignancies, particularly in acute myeloid leukemia (AML). The role of WT1 in AML has been underlined by the finding of WT1 overexpression in the majority of AML and somatic WT1 mutations in approximately 10% of AML, but its contribution to leukemogenesis has still not been clarified. To assess the incidence, the main associated features and the prognostic significance of WT1 mutations and WT1 single nucleotide polymorphism (SNP) rs16754 in AML patients, and to determine whether minimal residual disease (MRD) based on WT1 expression (MRD-WT1) is predictive of clinical outcome. Diagnostic bone marrow or peripheral blood samples from 517 patients (15-70 years) with previously untreated primary AML enrolled on the French ALFA-9801 or ALFA-9802 trials were analyzed for the presence of WT1 exons 7 and 9 mutations and WT1 SNP 16754. WT1 exons 7 (including SNP 16754) and 9 were amplified by PCR from genomic DNA and directly sequenced using the Sanger method. (WT1 transcript levels were quantified by real-time quantitative PCR (RQ-PCR) at diagnosis and during follow-up in a total of 221 AML patients treated with intensive chemotherapy. In the ALFA-9802 cohort (patients aged 15-50 years), WT1 mutations were identified in 14/268 (5%) cases and were associated with a younger age (p=0.02) and the presence of a FLT3 internal tandem duplication (p=0.03). Patients with WT1 mutations were found to have a shorter overall survival (4-year OS: 22% vs 56%, p=0.01) and a higher risk of relapse (4-year RR: 82% vs 46%, p=0.0008) compared to wild-type cases. Within the subgroup of patients with cytogenetically normal (CN) AML (n=106), WT1 mutation was found to be an independent adverse prognostic factor for the risk of relapse. In the ALFA-9801 cohort (patients aged 50-70 years), WT1 mutations occurred in only 6/249 (2.5%) cases. Because of the small number of WT1 mutants in this age range, we could not investigate the prognostic significance of WT1 mutations in older patients. The minor allele of WT1 SNP rs16754 was found in 141/511 (28%) patients, at the heterozygous state (WT1AG) in 123 (24%) and homozygous state (WT1GG) in 18 (4%). In the whole patient cohort and within the subset of CN-AML (n=208), WT1 SNP rs16754 status showed no significant impact on clinical outcome. Overall, WT1 overexpression was found in 80-90% of diagnostic samples. WT1 transcript levels at diagnosis were significantly higher in AML with favorable cytogenetics, that is t(15;17), t(8;21), and inv(16)/t(16;16), or with NPM1 mutations, and lower in M5 FAB subtype and in case of MLL rearrangements. Pre-treatment WT1 expression level was not correlated with clinical outcome. After induction chemotherapy, low MRD-WT1 levels were associated with reduced relapse risk and longer overall survival (p<0.001). Greater log reduction in MRD-WT1 after induction also predicted a decreased risk of subsequent relapse, that remained significant when adjusted on age, white blood cell count and cytogenetic risk group (p=0.004). After completion of consolidation, MRD-WT1 level was again predictive of the risk of relapse (p=0.004). We found that WT1 mutations and MRD-WT1, but not WT1 SNP rs16754 status, significantly affect clinical outcome in AML. These results suggest that WT1 mutations and MRD-WT1 may contribute to improve prognostic assessment and therapeutic management of AML patients.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'Eucalyptus, feuillu le plus planté dans le monde, est fortement exposé au froid en raison de l'absence de dormance. Les gènes DREB sont connus comme étant les principaux régulateurs de la réponse aux stress abiotiques. Un nombre élevé de gènes DREB1/CBF (C-Repeat Factor) a été identifié chez Eucalyptus grandis. Le but de l'étude est de mieux comprendre le rôle de la voie DREB chez Eucalyptus pour le contrôle de la tolérance au stress, du développement et de la formation du bois. La présente étude a permis une annotation des gènes CBF et DREB2 dans le cadre d'un projet de sequençage partiel du génome d'E. gunnii. Une analyse complète de l'expression des genes par qRT-PCR a été réalisée sur les différents organes des deux espèces d'Eucalyptus après les traitements au stress. L'existence d'une copie de CBF supplémentaire dans le génome E. gunnii par rapport à E. grandis suggère que ce groupe est encore en évolution contrairement au groupe DREB2. Un nombre élevé de transcrits CBF chez E. gunnii, tolérant au froid, et forte une vitesse d'induction ce ces facteurs chez E. grandis, à croissance rapide, suggère que les facteurs CBF sont impliqués à la fois dans la protection au stress et la limitation de croissance. Des facteurs de transcription des familles MYB, NAC, KNOX et AP2/ERF impliqués dans le contrôle de la croissance et de la formation de la paroi cellulaire ont été identifiés comme étant des gènes putatifs cibles de CBF. Ces résultats sont en accord avec le phénotype modifié de surexpresseurs CBF. Les deux approches suggèrent un rôle central de la voie de DREB dans le compromis entre la croissance et la résistance au stress chez cette espèce ligneuse. / Eucalyptus, the most widely planted hardwood in the world, is highly exposed to the cold due to the lack of dormancy. DREB (Drought Responsive Element Binding) genes are known as master regulators of abiotic stress response. A high number of the DREB1/CBF (C-Repeat Factor) genes has been annotated in Eucalyptus grandis. The aim of the study was to better understand the role of DREB pathway in Eucalyptus for the control of stress tolerance, development and wood formation. The present study provides an annotation of the CBF and DREB2 genes from a partial draft of the E. gunnii genome sequence. A comprehensive transcriptional analysis through high-throughput qRT-PCR was carried out on different organs from the two Eucalyptus species after stress treatments. An additional CBF copy in the E. gunnii genome compared to E. grandis suggests that this group is still evolving unlike the DREB2 group. The higher CBF transcript amounts in the cold tolerant E. gunnii together with higher induction rates in the fast growing E. grandis suggest that CBF factors promote both stress protection and growth limitation. In addition, transcription factors from MYB, NAC, KNOX and AP2/ERF families involved in the control of growth and cell wall formation have been identified as putative CBF target genes. These results are in agreement with the modified phenotype of CBF overexpressors. Both approaches suggest a central role of DREB pathway in the trade-off between growth and stress resistance in this woody species.

Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est l’agent responsable de la fièvre typhoïde et cause environ 200 000 morts et 27 millions de cas annuellement. C’est un pathogène entérique dont le réservoir est restreint à l’Homme. Les raisons de cette restriction d’hôte sont méconnues et pourraient dépendre de l’expression de facteurs d’adhésion à des étapes importantes au cours de la pathogenèse. L’annotation bioinformatique du génome de S. Typhi identifie 12 fimbriae de type chaperon-placier (FCP), un curli ainsi qu’un pilus de type IV. L’objectif de ce projet de recherche est d’étudier ces systèmes d’adhésion peu caractérisés. D’abord, le niveau d’expression de ces gènes a été évalué dans différentes conditions de culture in vitro en utilisant une approche de gènes rapporteurs. L’expression des 14 systèmes d’adhésion a été détectée. Nos résultats indiquent qu’une carence en fer favorise l’expression des opérons bcf et csg. Indépendamment du fer, l’expression de bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg et sth est influencée par la richesse nutritive du milieu. L’incubation en milieu LB liquide favorise l’expression de la plupart des systèmes d’adhésion par rapport à un milieu LB liquide sans agitation ou un milieu LB solide. En somme, l’expression des systèmes d’adhésion de S. Typhi a été observée et est influencée par des conditions environnementales. Dans un second volet, nous avons tent de surexprimer les différents systèmes d’adhésion chez une souche d’E. coli ou de S. Typhi afimbriaire. Avec cette approche, nous avons été en mesure de démontrer que l’opéron tcf encode pour un fimbria fonctionnel que l’on a pu observer en microscopie électronique. L’expression de tcf chez une souche afimbriaire d’E. coli et S. Typhi a également diminué leur capacité d’adhésion à des cellules épithéliales intestinales humaines lors d’essais in vitro. Nos observations démontrent que l’expression des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi est influencée par les conditions enviroi9onnementales. Au moins un de ces systèmes est fonctionnel. Ceci suggère une contribution des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi lors de l’interaction de ce pathogène avec l’humain. / Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) is the etiological agent of typhoid fever which causes more than 200 000 deaths and 27 million cases worldwide, mostly in south Asia. This pathogen can only cause significant symptoms in humans, which are the only recognized animal reservoir. This host restriction is not clearly understood and could depend on the expression of adhesion systems during critical pathogenesis steps. Bioinformatic studies on S. Typhi predict 12 chaperone-usher fimbriae, one curli and one type IV secretion system. The aim of the project was to study those poorly described adhesion systems using two different methodologies. First, transcription levels were evaluated in different in vitro growth conditions using both gfp and β-galactosidase reporter genes. The expression of the 14 adhesion systems was detected, even if some of them were poorly expressed. The expression of bcf and csg was higher during iron-deficiency. Also, the availability of nutrients had an impact on bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg and sth expression, independently of the presence of iron. Most of the adhesion systems showed higher expression levels in liquid LB media with aeration compared to the same media without aeration or supplemented with agar. Secondly, several S. Typhi adhesion systems were cloned into an inducible expression plasmid introduced in both an afimbriated E. coli K-12 strain (ORN172) and an afimbriated S. Typhi strain (ISP1820). This approach enabled us to directly observe the presence of tcf by electron microscopy. Furthermore, the expression of tcf was correlated with a reduction of the capacity of bacteria to adhere to INT-407 human intestinal epithelial cells in an in vitro assay. In summary, this work demonstrates that the putative adhesion systems found in S. Typhi can indeed be expressed and this expression can be regulated by environmental signals. Furthermore, tcf encodes for a functional fimbria which has never before been observed. Taken together, our results suggest a significant contribution of the putative adhesion systems during normal pathogenesis.

Le génome de différents organismes contient près de 30% de séquences codantes pour des protéines membranaires. Celles-ci sont impliquées dans des processus biologiques tels que la signalisation cellulaire, la transduction énergétique ou le transport des métabolites. Cependant, leur étude structurale se heurte souvent aux problèmes de surexpression, ainsi qu'aux différents inconvénients liés à leur extraction de leur environnement natif. Le canal mécanosensible à large conductance MscL d'Escherichia coli est une protéine intrinsèque de la membrane interne de la bactérie. L'activité de cette protéine est fortement dépendante de la membrane ; en effet, le canal s'ouvre lorsque la pression au niveau de la membrane augmente, lors d'un choc hypoosmotique, relarguant de l'eau et différents substrats afin que la bactérie retrouve un état osmotique adéquat à sa survie. Il est donc essentiel de recueillir des données structurales de la protéine dans son environnement natif. Pour cela, nous proposons une étude structurale de la protéine par résonance magnétique nucléaire en phase solide. La surexpression de la protéine et son marquage aux isotopes 13C et 15N sont deux étapes clés d'un tel projet. Une surexpression bactérienne et un marquage uniforme de la protéine ont été effectués. Les données spectrales obtenues montrent une bonne résolution, mais l'imbrication des corrélations ne permet pas d'en extraire des données structurales. Afin de réduire le nombre de résidus marqués, un marquage spécifique a été appliqué par la voie de la synthèse in vitro. Le premier test a montré que l'approche permettait de réduire le temps d'acquisition, tout en diminuant la quantité d'informations. Différentes méthodes ont ensuite été appliquées pour trouver les meilleures combinaisons d'acides aminés à marquer spécifiquement en synthétisant la protéine in vitro. Ces approches utilisent les programmes de prédiction de déplacements chimiques ou l'analyse de la séquence à la recherche de paires d'acides aminés uniques. Une approche combinatoire a été également testée. Les différents échantillons synthétisés ont montré une bonne résolution, et ont permis l'identification de plusieurs corrélations. Les méthodes développées au cours de ce travail pourront aider progressivement à déterminer la structure de la protéine MscL. Elles pourront également servir à d'autres protéines membranaires pour leur étude par résonance magnétique nucléaire.

Le maintien de l'intégrité du patrimoine génétique est essentiel à la survie des organismes vivants. Face aux nombreuses sources de stress génotoxiques qui induisent des dommages de l'ADN, les cellules ont mis en place des mécanismes complexes capables de détecter et réparer ces lésions. Parmi ces sources, figurent les rayonnements ultraviolets (UV) contenus dans la lumière solaire, qui modifient la structure de l'ADN et peuvent conduire à l'introduction de mutations. Chez l'homme, la grande majorité des dommages de l'ADN produits par les rayonnements est éliminée par le système NER (Nucleotide Excision Repair), un système capable d'exciser les nucléotides lésés et de les remplacer. Une déficience de cette voie de réparation peut mener à l'apoptose (mort programmée des cellules), et augmente la susceptibilité de développer des maladies graves telles que le cancer. Le système NER met en œuvre de nombreuses protéines impliquées dans des mécanismes variés tels que la détection, la signalisation, ou la réparation de l'ADN. La protéine eucaryote KIN17, récemment découverte dans le noyau de la cellule humaine, semble appartenir à ce système de réparation. Cependant, son rôle précis dans la réponse aux dommages de l'ADN reste à ce jour inconnu. C'est pourquoi, nous avons entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine (domaine K2) afin d'améliorer la connaissance de ses fonctions, de ses partenaires biologiques, et de ses modes de fonctionnement. La première partie de ce manuscrit est consacrée à la préparation de l'échantillon de protéine en vue d'une analyse structurale par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Le travail a dans un premier temps consisté à choisir et optimiser le système d'expression de domaines structuraux d'une autre protéine : la proline déshydrogénase PRODH. Dans un second temps, la meilleure stratégie de préparation de l'échantillon a été appliquée à la protéine KIN17 pour produire, puis résoudre la structure tridimensionnelle du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire. Nous avons montré que la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine adopte un repliement caractéristique de la famille structurale « Winged Helix » des protéines de liaison aux acides nucléiques. Cependant, l'analyse des détails structuraux du domaine K2, la comparaison avec des protéines de fonction connue de la même classe structurale, et des études électrophorétiques, révèlent l'incapacité de ce domaine à lier l'ADN et l'ARN de manière autonome. En revanche, nous avons mis en évidence, par une étude RMN complémentaire, l'existence d'une surface ultra conservée impliquée dans des interactions de type protéine-protéine intra-moléculaires entre le motif « Winged Helix » de la région 51-160 et la région N-terminale 1-50 de KIN17 humaine.

Quelques régions stables ont été découvertes sur les gp d’env du VIH-1 contre lesquelles des patients produisent des anticorps neutralisants. Les épitopes les plus prometteurs se trouvent dans la MPER et sont probablement exposés durant la fusion. Alors que les peptides isolés à partir de cette région ne sont pas parvenus à induire une réaction immunogène neutralisante, des études antérieures suggèrent que la membrane lipidique joue un rôle dans la structuration des antigènes et dans la réponse immunogénique.C’est pourquoi nous étudions la structure de ces épitopes. Cela nécessite leur surexpression, leur purification et leur reconstitution dans des liposomes. Une étude de CD montre qu’ils pourraient changer de conformation, cela sera confirmé par RMN. En outre, leur immunogénicité sera vérifiée par vaccination des souris. En plus, nous trouvons que le cholestérol peut modifier l’orientation des peptides englobant le motif CRAC de la gp41. / A few stable regions have been discovered on the HIV-1 env gp against which some patients produce neutralizing antibodies. The most promising ones are located in the MPER and are probably exposed transiently during the fusion. Whereas the peptides isolated from this region failed to induce immunogenic response, previous studies suggest the lipid membrane plays a role in antigens structure and in the immunogenic response.That is why we investigate the structure of these épitopes in membrane models. This requires the production of these épitopes by bacterial overexpression, their purification and their reconstitution in liposomes. A CD study shows that they could undergo a conformational change; this will be confirmed by NMR. Also their immunogenicity will be checked by mice immunization. In addition, we find that cholesterol could change the orientation of peptides encompassing a gp41 CRAC motif.

Le VHS-1 est un modèle très utilisé pour l’étude du cycle viral et des interactions hôte-pathogène des Herpesvirdidae, en partie dû à sa capacité de se répliquer de façon rapide dans plusieurs types cellulaires. La transcription, réplication de l’ADN et la formation des capsides de ce virus se produisent dans le noyau cellulaire. Une fois les capsides formées, elles doivent sortir du noyau pour continuer le cycle. Cependant, les capsides sont trop grandes (125 nm) pour passer à travers les pores nucléaires, dont la taille d’exclusion est de 40 nm, et elles entament alors un processus d’enveloppement dé-enveloppement à travers les deux membranes nucléaires. Le complexe LINC (de l’anglais Linker of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton) est un complexe qui se retrouve dans les membranes nucléaires et l’espace périnucléaire. Il sert de liaison entre le noyau et le cytoplasme et, parmi ses fonctions on retrouve le maintien d’un espace périnucléaire constant, le positionnement du noyau et la transmission de forces entre le noyau et le cytoplasme. Le complexe LINC est composé par les protéines de la famille SUN et par les protéines de la famille KASH, qui interagissent physiquement l'une avec l'autre. L'implication du complexe LINC dans la propagation du virus de la pseudo-rage (PrV) a déjà été démontrée. Étant donné que le PrV fait partie de la même famille de virus que le VHS-1, notre hypothèse est que le complexe LINC joue aussi un rôle dans la propagation du VHS-1. Mes travaux démontrent que la surexpression d'une forme négative dominante de SUN2 ou sa déplétion montre un effet proviral sur la propagation du VHS-1. Ce résultat diffère de ce qui a été précédemment constaté pour le PrV en ce sens que SUN2 est antiviral pour le PrV. Ceci confirme notre hypothèse, mais démontre un scénario plus complexe qu'anticipé. / HSV-1 is widely used to study viral cycles and host-pathogen interactions of Herpesvirdidae, because it replicates quickly and efficiently in many cells types. The transcription, replication and capsid assembly of HSV-1 take place in the nucleus of the infected cell. The assembled HSV-1 capsid must exit the nucleus to continue the viral cycle. The nuclear membranes constitute a barrier for the nuclear egress of nucleocapsids (125 nm) given the exclusion size of the nuclear pores is approximately 40 nm. The nucleocapsids therefore pass through the nuclear membranes by an envelopement-deenvelopement process. The capsids acquire an envelope from the inner nuclear membrane when they are released into the perinuclear space. This primary viral envelope then fuses with the outer nuclear membrane, enabling the capsid to reach the cytoplasm. Situated between the two nuclear membranes is the linker of the nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex. It is involved in the maintenance of the perinuclear space, nuclear positioning and force transmission between the nucleus and the cytoplasm. The LINC complex is composed of two families of proteins, SUN and KASH proteins. SUN proteins are found in the inner nuclear membrane, their N-terminal interacts with the nucleoskeleton and the C-terminal includes a conserved domain, the SUN domain, which interacts in the perinuclear space with the conserved domain of KASH proteins. The implication of the LINC complex in the propagation of the pseudorabies virus (PrV), a member of the alphaherpesviruses, has already been demonstrated. Since PrV is part of the same family as HSV-1, we hypothesized it may also play a role in HSV-1 propagation. My work shows that overexpression of a dominant negative form of SUN2 or its depletion shows a proviral effect on HSV-1 propagation. This result differs to what has been previously found for PrV, where SUN2 displays an antiviral phenotype. This work confirms our hypothesis but reveals a more complex scenario than anticipated.