Le gène Wilms’ Tumor 1 (WT1), localisé en 11p13, code pour une protéine régulatrice de la transcription. Initialement découvert du fait de son altération dans la tumeur de Wilms, le gène WT1 s’est avéré être aussi impliqué dans les hémopathies malignes, en particulier les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Le rôle de WT1 dans les LAM a été souligné par la présence d’une surexpression de WT1 dans la majorité des LAM et de mutations de WT1 dans environ 10% des cas, mais sa contribution à la leucémogenèse reste à préciser. Evaluer la fréquence, les caractéristiques associées et l’impact pronostique des mutations de WT1 et du SNP (single nucleotide polymorphism) rs16754 de WT1 dans les LAM, et déterminer si la maladie résiduelle (minimal residual disease, MRD) utilisant l’expression de WT1 (MRD-WT1) est prédictive de l’évolution clinique. Méthodes. Les mutations des exons 7 et 9 de WT1, ainsi que le SNP rs16754, ont été recherchés sur des échantillons diagnostiques sanguins ou médullaires de 517 patients présentant une LAM de novo et traités dans les protocoles français ALFA-9801 ou ALFA-9802. L’exon 7 (incluant le SNP rs16754) et l’exon 9 de WT1 ont été amplifiés par PCR sur ADN génomique puis séquencés selon la méthode de Sanger. Les taux de transcrits de WT1 ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR) au diagnostic et au cours du suivi thérapeutique chez un total de 221 patients atteints de LAM et traités par chimiothérapie intensive. Résultats. Dans la cohorte du protocole ALFA-9802 (patients âgés de 15 à 50 ans), les mutations de WT1 ont été identifiées chez 14/268 (5%) patients. Les mutations de WT1 étaient associées à un âge plus jeune (p=0.02) et à la présence d’une duplication en tandem de FLT3 (p=0.03). Les patients mutés WT1 présentaient un risque de rechute accru (82% vs 46% à 4 ans, p<0.001) et une survie globale plus courte (22% vs 56% à 4 ans, p=0.01) que les patients non mutés. Au sein des LAM à caryotype normal (LAM-CN) (n=106), la présence d’une mutation de WT1 constituait un facteur défavorable indépendant pour le risque de rechute. Dans la cohorte du protocole ALFA-9801 (patients âgés de 50 à 70 ans), la fréquence des mutations de WT1 était seulement de 6/249 (2.5%). En raison du faible effectif de patients mutés, la valeur pronostique des mutations de WT1 n’a pas pu être étudiée dans cette tranche d’âge. L’allèle minoritaire du SNP rs16754 a été retrouvé chez 141/511 (28%) patients, à l’état hétérozygote (WT1AG) chez 123 (24%) patients et homozygote (WT1GG) chez 18 (4%) patients. Dans la cohorte globale ainsi que dans le sous-groupe de LAM-CN (n=208), le statut du SNP rs16754 n’a pas montré d’impact pronostique significatif sur l’évolution clinique. Au total, 80-90% des échantillons présentaient une surexpression de WT1 au diagnostic. Les taux de transcrits de WT1 au diagnostic étaient plus élevés dans les LAM avec cytogénétique favorable, c’est-à-dire t(15;17), t(8;21), ou inv(16)/t(16;16), et les LAM avec mutations de NPM1, et plus bas dans le sous-type FAB M5 et en cas de réarrangement du gène MLL. Le taux d’expression de WT1 au diagnostic n’était pas corrélé à l’évolution clinique. Après la chimiothérapie d’induction, un taux faible de MRD-WT1 était associé à un risque de rechute inférieur et une survie plus longue (p<0.001). La décroissance de la MRD-WT1 exprimée en log réduction était aussi significativement associée au risque de rechute, même après ajustement sur l’âge, la leucocytose initiale et la cytogénétique (p=0.004). En fin de consolidation, la MRD-WT1 était également prédictive du risque de rechute (p=0.004). Conclusion. Dans cette étude, les mutations de WT1 et la MRD-WT1, mais pas le SNP rs16754, sont significativement associées à l’évolution clinique dans les LAM. Ces résultats suggèrent que les mutations de WT1 et la MRD-WT1 pourraient contribuer à améliorer l’évaluation pronostique et la prise en charge thérapeutique des patients atteints de LAM. / Wilms’ tumor 1 (WT1) gene, located at chromosome band 11p13, encodes a transcriptional regulator. Originally named for its role in Wilms’ tumor, a pediatric kidney malignancy, WT1 has since been found to be implicated in several hematological malignancies, particularly in acute myeloid leukemia (AML). The role of WT1 in AML has been underlined by the finding of WT1 overexpression in the majority of AML and somatic WT1 mutations in approximately 10% of AML, but its contribution to leukemogenesis has still not been clarified. To assess the incidence, the main associated features and the prognostic significance of WT1 mutations and WT1 single nucleotide polymorphism (SNP) rs16754 in AML patients, and to determine whether minimal residual disease (MRD) based on WT1 expression (MRD-WT1) is predictive of clinical outcome. Diagnostic bone marrow or peripheral blood samples from 517 patients (15-70 years) with previously untreated primary AML enrolled on the French ALFA-9801 or ALFA-9802 trials were analyzed for the presence of WT1 exons 7 and 9 mutations and WT1 SNP 16754. WT1 exons 7 (including SNP 16754) and 9 were amplified by PCR from genomic DNA and directly sequenced using the Sanger method. (WT1 transcript levels were quantified by real-time quantitative PCR (RQ-PCR) at diagnosis and during follow-up in a total of 221 AML patients treated with intensive chemotherapy. In the ALFA-9802 cohort (patients aged 15-50 years), WT1 mutations were identified in 14/268 (5%) cases and were associated with a younger age (p=0.02) and the presence of a FLT3 internal tandem duplication (p=0.03). Patients with WT1 mutations were found to have a shorter overall survival (4-year OS: 22% vs 56%, p=0.01) and a higher risk of relapse (4-year RR: 82% vs 46%, p=0.0008) compared to wild-type cases. Within the subgroup of patients with cytogenetically normal (CN) AML (n=106), WT1 mutation was found to be an independent adverse prognostic factor for the risk of relapse. In the ALFA-9801 cohort (patients aged 50-70 years), WT1 mutations occurred in only 6/249 (2.5%) cases. Because of the small number of WT1 mutants in this age range, we could not investigate the prognostic significance of WT1 mutations in older patients. The minor allele of WT1 SNP rs16754 was found in 141/511 (28%) patients, at the heterozygous state (WT1AG) in 123 (24%) and homozygous state (WT1GG) in 18 (4%). In the whole patient cohort and within the subset of CN-AML (n=208), WT1 SNP rs16754 status showed no significant impact on clinical outcome. Overall, WT1 overexpression was found in 80-90% of diagnostic samples. WT1 transcript levels at diagnosis were significantly higher in AML with favorable cytogenetics, that is t(15;17), t(8;21), and inv(16)/t(16;16), or with NPM1 mutations, and lower in M5 FAB subtype and in case of MLL rearrangements. Pre-treatment WT1 expression level was not correlated with clinical outcome. After induction chemotherapy, low MRD-WT1 levels were associated with reduced relapse risk and longer overall survival (p<0.001). Greater log reduction in MRD-WT1 after induction also predicted a decreased risk of subsequent relapse, that remained significant when adjusted on age, white blood cell count and cytogenetic risk group (p=0.004). After completion of consolidation, MRD-WT1 level was again predictive of the risk of relapse (p=0.004). We found that WT1 mutations and MRD-WT1, but not WT1 SNP rs16754 status, significantly affect clinical outcome in AML. These results suggest that WT1 mutations and MRD-WT1 may contribute to improve prognostic assessment and therapeutic management of AML patients.

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) dérivent de progéniteurs hématopoïétiques dans lesquels se sont accumulés des événements génétiques conduisant à leur transformation. En établissant la hiérarchie clonale de multiples lésions récurrentes, nous démontrons que les événements impliquant les régulateurs de l'épigénétique sont les premiers événements dans le clone. A l'inverse, les mutations régulant la prolifération se produisent tardivement. Les événements précoces sont quasi constamment détectables en rémission complète. Les clones qui persistent servent de réservoir pour les rechutes, avec une variation qui augmente avec la durée de la rémission. Après xénogreffe, les échantillons de patients porteurs de lésions épigénétiques sont capables de repopulation hématopoïétique, ce qui est la signature fonctionnelle des événements pré-leucémiques. Cette hiérarchie est observée chez la majorité des patients. Cependant dans 1/3 des cas, il n'est pas retrouvé d'événement épigénétique, et on observe notamment des prédispositions germinales aux LAM, ou des mutations acquises de TP53. Chez 3 patients avec des LAM de novo, les mutations de TP53 sont associées à des mutations de DNMT3A dans un même clone. Cela suggère que les mutations de DNMT3A et de TP53 sont complémentaires pour obtenir une dominance clonale pré leucémique. En conclusion, dans la majorité des LAM, des hiérarchie clonales récurrentes, initiées par des lésions pré-leucémiques variées vont promouvoir l'expansion ou la variation clonale, jusqu'à l'émergence de la maladie. Ces données sont essentielles pour le développement de nouvelles stratégies personnalisées de suivi de la maladie résiduelle. / Acute myeloid leukaemia (AML) emerge from haematopoietic stem/progenitor cells that acquiregenomic or chromosomal aberrations, some being considered as pre-leukemic lesions. Here, byestablishing the chronological hierarchy of multiple driver lesions in AML, we show that most eventsaffecting epigenetic regulators - DNMT3A, TET2, ASXL1 mutations, as well as MLL and chromosome20q rearrangements - are the first lesions in the clone. In contrast to late mutations involving signallingpathways such as FLT3 or RAS, these early lesions are frequently detectable in complete remissionsample. By studying late relapses, we show that persistent clones behave as long-term relapsereservoirs, and variegate increasingly with delay to relapse. Cells from patients with early epigeneticdefects can repopulate bone marrow of xenotransplanted NOD/SCID/IL-2Rgc-null (NSG) mice withleukemic or non leukemic engraftment, a functional signature of pre-leukemic events. This genetichierarchy is observed in most patients but in one third of them lesions in epigenetic regulators are notthe first events. Some of these patients have genetic predisposition, or somatic mutations in TP53. Inthree de novo AMLs, but not in three secondary or therapy-related AMLs, these TP53 mutations wereaccompanied by DNMT3A mutations in a unique clone. This suggests that DNMT3A mutations maycomplement TP53 mutations to generate a dominant pre-leukemic clone. We conclude that in mostAMLs recurrent genetic hierarchies, initiated by distinct pre-leukemic lesions, promote progressiveclonal expansion or variegation, leading to the development of a full blown disease. These data areessential for the development of new personalised strategies for MRD evaluation.

La cryoconservation de tissu ovarien peut être proposée, avant traitements hautement gonadotoxiques, à des patientes afin de préserver leur fertilité. L'autogreffe de tissu ovarien est actuellement la seule méthode de réutilisation du tissu ovarien disponible, mais en cas de pathologie néoplasique, elle présente un risque de réintroduction d'éventuelles cellules malignes via le greffon. L'objectif de ce travail a été de développer une méthode pour détecter la maladie résiduelle (MRD) dans le tissu ovarien par cytométrie en flux multicouleurs (CMF) en cas de leucémie aiguë. Une technique de dissociation de cortex ovarien a été mise au point à partir de tissu ovarien de référence provenant de résections percoelioscopiques. Un modèle expérimental de détection de la MRD a été validé et consistait à ajouter des cellules de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) ou myéloïde (LAM) à une suspension de cellules ovariennes isolées de référence. La méthode a ensuite été utilisée pour rechercher la MRD dans le tissu ovarien cryoconservé de 11 patientes atteintes de leucémie aiguë (7 LAL et 4 LAM).Le modèle expérimental a permis de valider une sensibilité de 10"4 et une spécificité élevée tant pour les LAL que pour les LAM. Lorsqu'un marqueur moléculaire était disponible pour la recherche de la MRD, nous avons observé une bonne corrélation entre la CMF et la PCR quantitative. La détection par CMF de la MRD dans le tissu ovarien des patientes leucémiques était positive chez 3 des 11 patientes étudiées.Cette technique est essentielle pour évaluer le risque carcinologique avant de proposer la réutilisation du tissu ovarien cryoconservé par technique d'autogreffe. / Ovarian cryopreservation together with autograft of frozen/thawed ovarian tissue is a real option to preserve and restorefertility in cancer patients. However in cases of leukemia, there is a real concern regarding the presence of metastaticcells in the ovarian tissue, which could lead to the recurrence of the primary disease. The aim was to validate multicolorflow cytometry (MFC) as an original technique for minimal residual disease (MRD) detection in ovarian cortex fromacute leukemia patients.We developed an experimental model which consisted in adding serial dilutions of leukemic cells into isolated ovariancell suspensions obtained from healthy cortex. The modelization was validated for acute lymphoblastic leukemia (ALL)and acute myeloid leukemia (AML). Then the method was applied to MRD detection of leukemic cells in cryopreservedovarian cortex from 11 leukemia patients (7 ALL and 4 AML).This experimental model made it possible to obtain a high specificity and a robust sensitivity of 10~4 for MRD detectionby MFC for both types of acute leukemic cells. When a molecular marker was available, we observed a good correlationbetween CMF and quantitative PCR. Ovarian MRD was positive by MFC in one T-ALL and 2 AML patients.MRD detection in the ovarian cortex is essential to evaluate the risk of cancer reseeding before ovarian tissue autograft.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes hétérogènes déclenchées, dans la plupart des cas, par des anomalies génétiques (mutations, translocations ou inversions). Elles se caractérisent par un blocage de la différenciation de certains progéniteurs ou précurseurs hématopoïétiques (blastes) et leur prolifération clonale incontrôlée provoquant leur accumulation dans la moelle osseuse. Le traitement actuel de ces patients repose essentiellement sur l’utilisation d’agents de chimiothérapie (cytarabine associée à une anthracycline) permettant d’éliminer les cellules leucémiques et d’obtenir une rémission complète (RC) (définie morphologiquement comme une moelle osseuse normale avec moins de 5% de blastes). Cette RC est obtenue chez une majorité des patients mais plus d’un patient sur deux va rechuter quelques mois après l’arrêt du traitement. Ces rechutes attestent de la persistance de cellules leucémiques résiduelles après le traitement, que l’on appelle maladie résiduelle mesurable (MRD). Celle-ci a été mise en évidence grâce au développement de technologies performantes et sensibles tels que la cytométrie en flux multi-paramétrique et la PCR en temps réel (qPCR) permettant ainsi la détection de profils d’expression ou d’anomalies génétiques associés aux LAM. A ce jour, plusieurs mécanismes ont été décrits pour expliquer la présence de cette MRD. Celle-ci peut être causée par une résistance au traitement de certains sous-clones leucémiques (anomalies génétiques intrinsèques leur conférant une résistance ou un phénotype quiescent) ou par la présence de cellules souches leucémiques (naturellement quiescentes). Le système immunitaire pourrait également jouer un rôle en induisant la quiescence de certaines cellules les rendant résistantes aux chimiothérapies conventionnelles, ou en contrôlant leur croissance tumorale par l’établissement d’un état d’équilibre entre leur prolifération et leur lyse. Les modèles murins de LAM actuellement utilisés permettent d’étudier la leucémogenèse et l’efficacité thérapeutique de certains composés mais font abstraction du rôle de la réponse immunitaire dans ces processus du fait de leur immunodéficience. De plus, aucun modèle murin de MRD leucémique n’existe pour étudier les causes de la persistance cancéreuse après traitement par chimiothérapie. Ainsi, le but de cette thèse a été de développer un modèle murin syngénique et immunocompétent de MRD leucémique sur-exprimant ou non le gène Wilms’ Tumor 1 (WT1). WT1 est un des rares antigènes décrits dans les LAM et une réponse lymphocytaire cellulaire et humorale dirigée contre cette protéine a été décrite chez ces patients. La création de ce modèle sur-exprimant ou non WT1 permettra ainsi d’étudier le rôle de la réponse immunitaire spécifique de celui-ci dans la persistance leucémique. Pour développer ce modèle nous avons, dans un premier temps, caractérisé phénotypiquement et génotypiquement des sous-clones isolés de la lignée leucémique C1498 capable d’induire une LAM de type myélo-monocytaire chez des souris immunocompétentes C57BL/6J. Dans un deuxième temps, certains sous-clones ont été sélectionnés pour leur sensibilité à la cytarabine et transfectés de manière à exprimer stablement une protéine fluorescente (ZsGreen) en association ou non avec la protéine WT1. Enfin, ce modèle de MRD leucémique a été obtenu en modulant la quantité de cellules leucémiques injectée ainsi que la cinétique et la dose d’injection de la cytarabine. La MRD a été suivie par cytométrie en flux (expression ZsGreen) et par qPCR (expression ZsGreen et/ou de Wt1) dans le sang et la moelle osseuse des souris survivantes grâce au traitement [...]. / Acute myeloid leukemia (AML) is a genetic disorder leading to a blockade of differentiation and a clonal expansion of hematopoietic progenitors or precursors (called blasts) which accumulate in the bone marrow and then invade the blood stream. Conventional treatment relies on the use of chemotherapy agents (cytarabine in combination with an anthracycline) to eliminate leukemia cells and achieve complete remission (defined as normal bone marrow morphology with less than 5% blasts). This complete remission is achieved in a majority of patients but more than 50% of them will relapse several months after the treatment. These relapses indicate the presence of residual leukemic cells after treatment, known as measurable residual disease (MRD). It has been highlighted by the development of efficient and sensitive molecular biology technologies such as multi-parameter flow cytometry and real-time PCR allowing the detection of AML-associated expression patterns and genetic abnormalities. Several mechanisms have been described that can explain the presence of this MRD. It may be caused by the resistance to treatment of certain leukemic sub-clones (resistance-conferring mutations or quiescent phenotype) or the presence of leukemic stem cells. Finally, the immune system could also induce the quiescence of certain leukemic cells rendering them resistant to conventional chemotherapies, or control their growth leading to a state of equilibrium between their proliferation and lysis. Several AML mouse models allow the study of leukemogenesis and the testing of new therapeutic agents for leukemic cells eradication. However, they are mostly based on the transfer of human leukemic cells in immune-deficient mice and do not provide information about the role of the immune system in the leukemic cell survival, sub-clonal expansion or persistence. Moreover, there is still no available leukemia MRD mouse model allowing the study of leukemic cell persistence after chemotherapy treatment. According to these findings, the aim of this thesis was to develop a syngeneic and immune-competent mouse model of leukemia MRD overexpressing or not the Wilms' Tumor 1 (WT1) gene. The WT1 protein is described as an antigen associated with AML and is targeted by specific lymphocyte cellular and humoral responses in AML-affected patients. Creating a syngeneic and immune-competent leukemia MRD mouse model overexpressing or not this antigen will allow determining the role of this specific immune response in the cancer cell persistence. To set up this model, we first phenotyped and genotyped sub-clones isolated from the murine C1498 leukemic cell line able to induce a myelo-monocytic AML in immune-competent C57BL/6J mice. In a second step, certain sub-clones were selected for their sensitivity to cytarabine treatment and transfected to stably express the fluorescent ZsGreen protein with or without the WT1 antigen. Lastly, the MRD mouse model was obtained after modulation of various parameters such as the amount of leukemic cells administered, the kinetics and injection doses of chemotherapy. The leukemia MRD was monitored by flow cytometry (expression of the ZsGreen protein) and by real-time PCR (expression of the ZsGreen and/or Wt1 genes) in the peripheral blood and the bone marrow of treated and surviving mice. Thus, we generated a syngeneic and immune-competent leukemia MRD mouse model useful to study the immune mechanisms involved in the persistence of leukemic cell after treatment and to test new (immune)-therapeutic strategies targeting these residual cells.