This dissertation investigates the behavior of the Escherichia Coli mechanosensitive (MS) channel MscL, when incorporated within a droplet interface bilayer (DIB). The activity of MscL channels in an artificial DIB system is demonstrated for the first time in this document. The DIB represents a building block whose repetition can form the basis to a new class of smart materials. The corresponding stimuli-responsive properties can be controlled by the type of biomolecule incorporated into the lipid bilayer, which is in the heart of this material. In the past decade, many research groups have proven the capability of the DIB to host a wide collection of natural and engineered functional biomolecules. However, very little is known about the mechano-electrical transduction capabilities of the DIB. The research present herein specifically seeks to achieve three direct goals: 1) exploring the capabilities of the DIB to serve as a platform for mechano-electrical transduction through the incorporation of bacterial MscL channels, 2) understanding the physics of mechano-electrical transduction in the DIB through the development of theoretical models, and 3) using the developed science to regulate the response of the DIB to a mechanical stimulus. MscL channels, widely known as osmolyte release valves and fundamental elements of the bacterial cytoplasmic membrane, react to increased tension in the membrane. In the event of hypo-osmotic shocks, several channels residing in the membrane of a small cell can generate a massive permeability response to quickly release ions and small molecules, saving bacteria from lysis. Biophysically, MscL is well studied and characterized primarily through the prominent patch clamp technique. Reliable structural models explaining MscL's gating mechanism are proposed based on its homolog's crystal structure modeling, which lead to extensive experimentation. Under an applied tension of ~10 mN/m, the closed channel which consists of a tight bundle of transmembrane helices, transforms into a ring of greatly tilted helices forming an ~8 A water-filled conductive pore. It has also been established that the hydrophobicity of the tight gate, positioned at the intersection of the inner TM1 domains, determines the activation threshold of the channel. Correspondingly, it was found that by decreasing the hydrophobicity of the gate, the tension threshold could be lowered. This property of MscL made possible the design of various controllable valves, primarily for drug delivery purposes. For all the aforementioned properties and based on its fundamental role of translating cell membrane excessive tensions into electrophysiological activities, MscL makes a great fit as a mechanoelectrical transducer in DIBs. The approach presented in this document consists of increasing the tension in the lipid bilayer interface through the application of a dynamic mechanical stimulus. Therefore, a novel and simple experimental apparatus is assembled on an inverted microscope, consisting of two micropipettes (filled with PEG-DMA hydrogel) containing Ag/AgCl wires, a cylindrical oil reservoir glued on top of a thin acrylic sheet, and a piezoelectric oscillator actuator. By using this technique, dynamic tension can be applied by oscillating one droplet, producing deformation of both droplets and area changes of the DIB interface. The tension in the artificial membrane will cause the MS channels to gate, resulting in an increase in the conductance levels of the membrane. The increase in bilayer tension is found to be equal to the sum of increase in tensions in both contributing monolayers. Tension increase in the monolayers occurs due to an increase in surface area of the constant volume aqueous droplets supporting the bilayer. The results show that MS channels are able to gate under an applied dynamic tension. Interestingly, this work has demonstrated that both electrical potential and surface tension need to be controlled to initiate mechanoelectric coupling, a property previously not known for ion channels of this type. Gating events occur consistently at the peak compression, where the tension in the bilayer is maximal. In addition, the experiments show that no activity occurred at low amplitude oscillations (< 62.5um). These two findings basically present an initial proof that gating is occurring and is due to the mechanical excitation, not just a random artifact. The role of the applied potential is also highlighted in this study, where the results show that no gating happens at potentials lower that 80 mV. The third important observation is that the frequency of oscillation has an important impact of the gating probability, where no gating is seen at frequencies higher than 1 Hz or lower than 0.1 Hz. Each of the previous observations is addressed separately in this research. It was found that the range of frequencies to which MscL would respond to in a DIB could be widened by using asymmetrical sinusoidal signals to stimulate the droplets. By increasing the relaxation time and shorting the compression time, a change in the monolayer's surface area is achieved, thus higher tension increase in the bilayer. It was also found that a high membrane potential assists in the opening of MscL as the droplets are stimulated. This is due to the sensitivity of MscL to the polarity of the signal. By using the right polarity the channel could be regulated to become more susceptible to opening, even at tensions lower than the threshold. Finally, it was demonstrated, for the first time, that MscL would gate in asymmetric bilayers without the need to apply a high external potential. Asymmetric bilayers, which are usually composed from different lipids in each leaflet, generate an asymmetric potential at the membrane. This asymmetric potential is proven to be enough to cause MscL to gate in DIBs upon stimulation. / Ph. D.

Mechanosensitive (MS) channels are a class of ion channels which are gated by membrane stretch. The mechanosensitive channel of large conductance (MscL) of the bacterium E.coli has become a prototype MS channel for studying structure-function relationships in this class of ion channels. MscL homologues have commonly been found in Gram-negative and Gram-positive bacterial strains forming a sub-family of a larger family of MS class of ion channels encompassing prokaryotes (bacteria and archaea) as well as cell-walled eukaryotes (fungi and plants). MscL and its homologues have been found to play an important role in osmoregulation of bacterial cells. Though the MS channels of bacteria have been thoroughly studied, little is known about the pharmacology of these channels. This thesis has one general aim, that is, to identify compounds which are able to gate and/or alter the gating of the MS channels of bacteria in particular, the MscL of E. coli. Using the patch-clamp technique, potential compounds mostly identified via in-silico techniques were examined to observe the effects on MscL reconstituted in artificial lipid membranes and MscS in giant bacterial spheroplasts. The compounds were tested for the ability to spontaneously gate the MscL and MscS and/or alter the Boltzmann distribution parameters of the MscL, indicative of an effect on the gating of MscL. Compounds showing potential as MscL activators were then examined for in-vivo effects using different growth assays. The effects of parabens, gallates, eriochrome cyanine R, brilliant green, deoxycholic acid are reported. Of these compounds, parabens and eriochrome cyanine R showed the most encouraging results. Identification of MS channel gate ligands not only benefits structural studies as tetrodotoxin has for the voltage-sensitive sodium channel, these compounds could also V potentially serve as base compounds for novel antibiotics which would target the MS channels of bacteria. Since the MS channels of bacteria serve as safety valves for the bacterium, gating during exposure to a hypo-osmotic challenge such as rain to release excessive cellular turgor, a pharmacological agent that could impair the gating of the MS channels releasing essential cytoplasmic osmolytes, would cause the growth impairment or death of the bacterium. With the rise in multi-drug resistant bacteria, continual development of novel antibiotics is crucial.

La production hétérologue des protéines membranaires reste difficile, peut-être parce que l’insertion dans la membrane de la cellule hôte constitue une étape limitante de la production. Afin de tourner cette difficulté, deux modes de synthèse ont été envisagés: la synthèse de protéines dans un système a-cellulaire, en l’absence de membrane mais en présence de détergent, ou l’adressage forcé de la protéine vers les corps d’inclusion dans le cas d’une expression plus classique en bactérie entière. La réalisation des deux stratégies repose sur l’utilisation de protéines de fusion possédant une séquence d’entraînement en amont du gène d’intérêt, soit qu’elles améliorent la traduction du transcrit en limitant le repliement spatial de ce dernier, soit qu’elles favorisent la production de la protéine d’intérêt en corps d’inclusion. La porine OmpX et le peptide T7 ont été choisis en cas d’expression dans les systèmes bactériens. La protéine SUMO est utilisée pour la production dans un lysat eucaryote. Les différentes approches ont été testées sur la production de la pannexine1 humaine (Px1).Si les séquences d’entraînement OmpX et le peptide T7 sont correctement produites in vitro, aucune des deux, en revanche, ne favorise la production de la Px1. Seul l’entraîneur SUMO est efficace. En effet, nous avons observé que cette protéine augmente la production de la Px1 dans un lysat eucaryote de germe de blé. Par ailleurs OmpX, connue pour être largement produite in vivo dans les corps d’inclusion, n’entraîne pas la localisation de la Px1 dans ces structures. Contre toute attente, l’étiquette T7 dirige la Px1 dans les corps d’inclusion. L’étude électrophysiologique de la Px1 a donc été effectuée à partir de la protéine produite in vivo (T7his-Px1) après renaturation, ou produite sous forme soluble in vitro (his6-Px1) dans le lysat eucaryote. Dans le cas de la protéine T7his-Px1 renaturée, une activité canal qui rappelle celle qui est observée après expression dans l’ovocyte de Xénope, a été détectée en patch-clamp, mais dans trois cas seulement. Dans le cas de la protéine his6-Px1, aucune activité canal n’est clairement détectée. Dans une deuxième partie de ce travail on examine le rôle de la boucle périplasmique dans la sensibilité à la pression du MscL, un canal mécanosensible bactérien devenu un système modèle dans l’étude de la mécanosensibilité. Presque toutes les études fonctionnelles sur ce canal ont été réalisées sur le canal de E.coli, alors que la structure a été obtenue à partir de l’homologue de M. tuberculosis. Une étude fonctionnelle a montré que le MscL de M. tuberculosis est difficile à ouvrir : son ouverture requiert l’application d’une pression double de celle qui est nécessaire chez E.coli. Les deux homologues diffèrent principalement par la longueur de leur unique boucle périplasmique. De manière à examiner le rôle de la boucle, on a comparé l’activité du canal MscL de E.coli, celle du canal de M. tuberculosis et celle d’une protéine chimère constituée de la protéine de M. tuberculosis dans laquelle la boucle a été changée pour celle de la protéine de E.coli. De manière inattendue, nous avons constaté que les canaux de E.coli et de M. tuberculosis ont la même sensibilité à la pression. La protéine chimère n’avait pas d’activité canal. Si ce travail ne permet pas de conclure quant au rôle de la boucle, il montre sans ambigüité que contrairement à ce qui a été rapporté les canaux MscL de E.coli et de M. tuberculosis ne diffèrent pas sensiblement sur le plan fonctionnel / The production of heterologous membrane protein is notoriously difficult; this might be due to the fact that insertion of the protein in the membrane host is a limiting step. To by-pass this difficulty, two modes of synthesis were tested: 1) production in a cell-free system devoid of biological membrane but supplemented with detergent or liposomes, 2) production in bacteria, with targeting of the membrane protein to inclusion bodies. Both strategies were tested for the production of the human pannexin 1 channel (Px1). The gene coding the protein was fused with an “enhancer” sequence resulting in the addition of a peptide or short protein at the N terminus of the protein of interest. This enhancer sequence which is well produced in vitro or in vivo is supposed to facilitate the translation of the protein of interest. Three enhancer sequences were chosen: 1) the small porin OmpX of E. coli, which, in addition, should target the protein to inclusion bodies when the protein is expressed in bacteria 2) a peptide of phage T7 for expression in E.coli lysate or E.coli cells 3) the small protein SUMO for production in a wheat germ cell-free system. In a bacterial cell-free system, neither OmpX nor T7 promoted Px1 production. Px1 is only produced when the SUMO enhancer sequence is used in the wheat germ system. In bacteria, OmpX, known to form inclusions bodies did not promote the targeting of the fusion protein to inclusion bodies. Unexpectedly, the peptide T7 was able to do it.Px1 obtained from inclusion bodies (T7his-Px1) was renatured and reconstituted in liposomes. Similarly his6-Px1 produced in wheat germ system was reconstituted in liposomes. Both preparations were used for electrophysiological studies (patch-clamp and planar bilayers). With the refolded T7his-Px1, channel activity reminiscent of that observed with Px1 expressed in Xenope oocyte (Bao et al., 2004) could be detected, but only in three cases. In the case of his6-Px1, no clear channel activity could be observed. The second part of this work deals with the involvement of the periplasmic loop of the bacterial mechanosensitive channel MscL in its sensitivity to pressure. Mscl has become a model system for the investigation of mechanosensisity. Nearly all functional studies have been performed on MscL from E.coli while the structure of the protein has been obtained from the Mycobacterium tuberculosis homologue. In one functional study it was shown that MscL from M. tuberculosis is extremely difficult to open, gating at twice the pressure needed for E.coli MscL The periplasmic loop is the most variable sequence between the two homologues, being longer in E.coli than in M. tuberculosis. In order to assess the role of the periplamic loop in the sensitivity to pressure, we compared the activity of the E.coli and M. tuberculosis MscL and of a chimeric protein made of the M. tuberculosis protein in which the periplasmic loop has been exchanged for that of the E. coli channel. Unexpectedly, M. tuberculosis and E .coli MscL were observed to gate at a similar applied pressure. The chimeric protein had no functional activity. In conclusion, this study does not allow any conclusion as to the role of the loop in the sensitivity to pressure, but it shows clearly that, in contrast to the results of a previous study, there is no functional difference between E. coli and M. tuberculosis MscL.

Le génome de différents organismes contient près de 30% de séquences codantes pour des protéines membranaires. Celles-ci sont impliquées dans des processus biologiques tels que la signalisation cellulaire, la transduction énergétique ou le transport des métabolites. Cependant, leur étude structurale se heurte souvent aux problèmes de surexpression, ainsi qu'aux différents inconvénients liés à leur extraction de leur environnement natif. Le canal mécanosensible à large conductance MscL d'Escherichia coli est une protéine intrinsèque de la membrane interne de la bactérie. L'activité de cette protéine est fortement dépendante de la membrane ; en effet, le canal s'ouvre lorsque la pression au niveau de la membrane augmente, lors d'un choc hypoosmotique, relarguant de l'eau et différents substrats afin que la bactérie retrouve un état osmotique adéquat à sa survie. Il est donc essentiel de recueillir des données structurales de la protéine dans son environnement natif. Pour cela, nous proposons une étude structurale de la protéine par résonance magnétique nucléaire en phase solide. La surexpression de la protéine et son marquage aux isotopes 13C et 15N sont deux étapes clés d'un tel projet. Une surexpression bactérienne et un marquage uniforme de la protéine ont été effectués. Les données spectrales obtenues montrent une bonne résolution, mais l'imbrication des corrélations ne permet pas d'en extraire des données structurales. Afin de réduire le nombre de résidus marqués, un marquage spécifique a été appliqué par la voie de la synthèse in vitro. Le premier test a montré que l'approche permettait de réduire le temps d'acquisition, tout en diminuant la quantité d'informations. Différentes méthodes ont ensuite été appliquées pour trouver les meilleures combinaisons d'acides aminés à marquer spécifiquement en synthétisant la protéine in vitro. Ces approches utilisent les programmes de prédiction de déplacements chimiques ou l'analyse de la séquence à la recherche de paires d'acides aminés uniques. Une approche combinatoire a été également testée. Les différents échantillons synthétisés ont montré une bonne résolution, et ont permis l'identification de plusieurs corrélations. Les méthodes développées au cours de ce travail pourront aider progressivement à déterminer la structure de la protéine MscL. Elles pourront également servir à d'autres protéines membranaires pour leur étude par résonance magnétique nucléaire.

Les canaux mécanosensibles de large conductance (MscL) sont des protéines membranaires intégrales permettant à la bactérie de survivre lors de chocs hypo-osmotiques. Leur principale caractéristique est de s'ouvrir en réponse à un stress mécanique : une tension de la membrane. <br />La compréhension de leur mode d'activation est un prérequis pour élaborer un modèle global du mécanisme de sensibilité à la tension membranaire. <br />Nous avons étudié ici les premières étapes du mécanisme d'ouverture du MscL induites par une diminution de l' épaisseur membranaire, ainsi que les interactions gouvernant ces changements conformationnels par des simulations de dynamique moléculaire. La comparaison de l'analyse en composante principale des tra jectoires et des directions données par l'analyse en modes normaux nous a permis de mettre en évidence l'influence de la membrane sur la dynamique intrinsèque du canal. Nous avons ensuite étudié des canaux MscL issus de différents organismes et présentant des sensibilité mécaniques différentes. Des différences significatives entre les comportements des deux systèmes plongés dans des membranes d' épaisseur variable ont été mises en évidence. <br />Ces différences nous ont conduit à explorer le rôle des différentes régions et notamment le rôle des boucles périplasmiques en construisant des canaux hybrides par combinaison de régions issues d'organismes différents. Les résultats obtenus confirment le rôle primordial des boucles periplasmiques dans la sensibilité du MscL.