Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2002. / Titre de l'écran-titre (visionné le 24 août 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1998. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2003. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 août 2006). Publié aussi en version papier.

The main objectives of this study were to investigate the applicability of chitosan as an effective wood preservative against subterranean termites, conduct metagenomic analysis of the bacterial hindgut community of Reticulitermes flavipes exposed to chitosan-treated wood, and perform chitosanase activity assay of metagenomics suggested bacterial species potentially responsible for chitosan breakdown. Chitosan showed termiticidal effects on subterranean termites at varying retention levels. Termite mortality increased when exposed to samples treated with higher chitosan concentration solutions. Approximately 40 - 100% of chitosan retained in treated-wood was leached depending on the initial retention. Post-leaching results indicate chitosan is not suitable for protection against both subterranean termites in outdoor conditions, but should be effective in non-leaching/indoor applications. For metagenomic analysis of the bacterial hindgut community of Reticulitermes flavipes, two methods were used for sequence data interpretation. The Illumina BaseSpace program identified twenty-six bacteria phyla with significant differences in abundance between the chitosan-treated and control groups. The second method, mothur, identified fifteen bacterial phyla also with significant differences in abundance between both treatment groups. Similar bacterial taxa were uniquely assigned to samples from termites fed on chitosan-treated wood using both methods. These results suggest a treatment driven effect on the hindgut bacteria diversity. While majority of the bacterial taxa were common to both methods, inconsistencies detected using the BaseSpace program suggests that the Greengenes database in its present state is not reliable for 16S rRNA gene sequence analysis. As for chitosanase activity of bacterial species with significance abundance from chitosan-treated wood exposed termites, three bacteria species, Lactococcus raffinolactis, Lactococcus lactis, and Dysgonomonas gadei, were examined. After culturing on chitosan media plates and broth, no conclusive activity could be detected from all three species. Further studies need to be conducted to understand the mechanism of chitosan toxicity to termites and insects in general and to prevent chitosan leaching from treated wood. A comparative metatransciptomic study needs to be implemented to supplement the metagenomic study performed herein, so as to elucidate the exact bacteria species involved in chitosan breakdown and the enzymes produced. Also, other bacterial species suggested by the metagenomic data to possess chitosanase activity should be investigated.

Les actinomycètes sont des microorganismes majoritairement retrouvés dans le sol et reconnus comme étant de grands producteurs de métabolites secondaires et enzymes extracellulaires. Parmi ces enzymes extracellulaires, nous retrouvons la chitosanase qui est apte à hydrolyser le chitosane, un bio-polymère formé majoritairement de D-glucosamine. Étant donné les nombreuses applications du chitosane, celui-ci est produit de façon industrielle par désacétylation de la chitine provenant de l'exosquelette de crustacés. La chitosanase est ensuite utilisée pour produire du chitosane de différents poids moléculaires. La majorité des études portant sur les chitosanases concernent leurs propriétés biochimiques et les relations entre leur structure et leur fonction enzymatique. Aucune étude publiée n'a été portée sur leur régulation génique, ce qui apporterait de nouvelles connaissances fondamentales pouvant améliorer entre autres le rendement de production de l'enzyme.Les chitosanases d'actinomycètes les plus étudiées sont celles de Streptomyces sp. N174 (CsnN 174) et de Kitasatospora sp. N106 (CsnN106). La production endogène de ces enzymes en comparaison avec la production en contexte hétérologue chez Streptomyces lividans , a permis d'émettre comme hypothèse que la production de la chitosanase CsnN106 serait régulée au niveau de la transcription. Notre première étude a donc porté sur la régulation génique de cette chitosanase en contexte endogène. Deux interactions régulatrices ont été repérées au niveau de la séquence promotrice de csnN106 .L'interaction impliquée à la séquence palindromique retrouvée en amont de csnN106 a été caractérisée plus en détails.L'emplacement précis de l'interaction et son activité en présence de molécules inductrices ont été déterminés. La caractérisation a été poursuivie par la détermination de l'importance de chaque paire de base du palindrome sur l'activité de liaison protéine-ADN. Par la suite, nous avons dû changer de stratégie d'étude puisque la purification complète des régulateurs de transcription impliqués dans ces interactions s'avérait impossible à partir d'extraits cellulaires de Kitasatospora sp. N106. Nous avons donc réalisé une recherche informatique sur la présence de boîtes palindromiques homologues à celle de csnN10 6 dans les séquences publiées et génomes actinobactériens séquences (Streptomyces coelicolor A3(2) et Streptomyces avermitilis MA-4680). Mis à part la présence de cette boîte palindromique en amont d'autres gènes codant pour des chitosanases, cette séquence a été retrouvée en amont d'un gène codant pour un régulateur de transcription de la famille ROK chez S. coelicolor et S. avermitilis . Nous avons émis l'hypothèse que le régulateur de transcription produit par ces gènes homologues, était responsable de la régulation de la transcription de gènes de chitosanases. Nous avons décidé d'étudier le gène homologue ( csnR ) et son produit protéique chez S. lividans étant donné l'utilisation de ce microorganisme pour la production hétérologue de protéines et son lien de parenté étroit avec S. coelicolor . Notre deuxième étude présente la caractérisation de CsnR par des expérimentations in vitro utilisant la protéine purifiée. De plus, une souche délétée pour le gène csnR a été utilisée pour effectuer d'autres expérimentations in vivo .Les résultats obtenus ont démontré que ce régulateur de transcription est un répresseur agissant au niveau de la boîte palindromique homologue à csnN106 qui est retrouvée chez S. lividans en amont du gène csnA , codant pour une chitosanase, et en amont du gène csnR . Notre troisième étude porte sur le mécanisme de régulation génique de csnN106 en contexte hétérologue chez S. lividans .L'utilisation de la souche délétée pour csnR a permis de démontrer que csnN106 est aussi régulé négativement par CsnR. Cette souche, ayant été transformée avec un vecteur intégratif ayant csnN106 mutée à sa boîte palindromique, a permis d'élaborer un milieu de production de chitosanase sans ajout de molécules inductrices tel que du chitosane ou ses dérivés. Ce nouveau système de production est aussi efficace que le système utilisé soit S. lividans ayant csnN106 sur un vecteur à haut nombre de copies en combinaison avec un milieu de production plus onéreux, contenant du chitosane et de la D-glucosamine.Les trois études présentées forment un premier bloc de nouvelles connaissances sur la régulation génique des chitosanases. Le mécanisme de répression de la transcription par CsnR au niveau de gènes de chitosanases possédant la boîte palindromique au niveau de leur promoteur semble un mécanisme répandu chez les actinomycètes étant donné la présence de cette boîte et de gènes homologues à csnR dans le génome de plusieurs actinomycètes.

Le but de mon projet de doctorat est la recherche de chitosanases thermostables qui peuvent mener la réaction d'hydrolyse du chitosane à de hautes températures. La procédure mise au point pour isoler ces chitosanases était planifiée pour moduler l'effet antimicrobien du chitosane qui augmente avec son poids moléculaire. Les objectifs spécifiques de ce projet sont, mettre au point un nouveau dosage de Csn, purifier, caractériser et cloner le gène des chitosanases les plus thermostables sélectionnées et mettre au point un milieu de production de chitosanase. La première étape du projet est la recherche de nouvelles chitosanases thermostables, via un criblage ciblé de bactéries productrices de chitosanases. En effet, une nouvelle méthode d'enrichissement était utilisée par l'ajout de chitosane de différents poids moléculaires à notre source bactérienne, soit les composts. La deuxième étape, est la réalisation d'un dosage de l'activité chitosanase en utilisant le soluble-dyed Remazol Brillant Bleu-Chitosane (sRBB-C) qui a été mise au point pour détecter à grande échelle une activité chitosanase de manière facile et rapide. Enfin, la troisième étape est un test de thermostabilité en présence de substrat, appliqué à des chitosanases choisies, pour sélectionner les plus performantes à l'étape de la purification. Parmi le lot de chitosanases testées, la chitosanase notée Csn1794 s'est distinguée par sa thermostabilité à 70 degrés C, ainsi elle a été retenue pour des études plus approfondies. Les études biochimiques réalisées sur la Csn1794 après purification ont révélé qu'elle a un poids moléculaire de 40 kDa, un pH optimal de 4.8 et des K[indice inférieur m] et k[indices inférieurs cat] de 0.042 mg/ml et 7588 min[indices supérieurs -1] respectivement. Le temps de demi-vie de la Csn1794 en présence de chitosane est plus de 20 heures à 70 degrés C. L'activité de la Csn1794 varie légèrement avec le degré d'acétylation du chitosane, elle hydrolyse la carboxyméthyl-cellulose, mais pas la chitine. Le clonage du gène de la Csn1794 par génétique inverse a permis de déterminer sa séquence. Ce gène codé pour une protéine de 441 acides aminés. La Csn1794 appartient à la famille 8 des glycosides hydrolases (GH8). Le rang taxonomique de l'isolat produisant la Csn1794 a été déterminé par des méthodes classiques ainsi que par des tests de biologie moléculaire. Les résultats obtenus indiquent qu'il s'agit d'un isolat appartenant à une espèce non caractérisée appartenant au genre Paenibacillus qu'on a appelé Paenibacillus sp. 1794. Enfin, la méthode de plan d'expériences était utilisée pour mettre au point le milieu de production de la Csn1794. Les essais réalisés par les plans d'expériences Plackett-Burman ont permis non seulement de définir un milieu de base pour la production de la Csn1794, mais aussi les oligosaccharides et le sucrose se sont distingués comme facteurs à effet nettement positif sur la production de la Csn1794. Les essais par plans d'expérience Box-Hunter ont permis l'étude d'interactions entre les différents facteurs dont le niveau était déterminé par les plans Taguchi. Les résultats obtenus indiquent qu'en plus de milieu de base, l'ajout de 10g/l de glucosamine, 7g/l d'oligosaccharide et 4g/l de sucrose constitue la meilleure combinaison pour un milieu qui permet de produire une moyenne de 7U/ml de Csn1794 d'une manière constante. En conclusion, nous disposons d'une nouvelle chitosanase thermostable, facile à produire et à purifier, qui sera un outil adéquat pour l'application au niveau industriel. Ceci va non seulement permettre de mener le processus d'hydrolyse de chitosane à haute température, mais aussi d'utiliser de grandes concentrations de substrat sans que la viscosité ne devienne excessive. Au niveau de la recherche fondamentale, la Csn1794 peut nous apporter plus d'informations d'une part, sur la thermostabilité des enzymes et d'autre part, sur les enzymes de la famille GH8, notamment les chitosanases.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第18331号 / 農博第2056号 / 新制||農||1022(附属図書館) / 学位論文||H26||N4838(農学部図書室) / 31189 / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 植田 充美, 教授 三上 文三, 教授 小川 順 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaimundoCSF.pdf: 2059810 bytes, checksum: 4d1a84d062e046ae8304a415fa8bdd6b (MD5) Previous issue date: 2005-12-13 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / In this work a 24 factorial design with triplicate at central point was used in order to investigate the influence of chitosan concentration (substrate) (Cs), culture media temperature (CMT), aeration ratio (AR) as well as agitation (A) on chitosanase production by Aspergillus ochraceus. Experiments were carried out using the following levels to the factors: (Cs) (-1) 0.1%; (0) 0.15%; (+1) 0.2%; (TMC) (-1) 25 minutes; (0) 30 minutes; (+1) 35 minutes; (RA) (-1) 0.4; (0) 0.6; (+1) 0.8; (A) (-1) 90 rpm, (0) 120 rpm, (+1) 150 rpm. One chitosanolytic activity (U.mL-1) was defined as the enzyme necessary to produce 1.0 mmol.min-1 of glicosamine by mL of extract. Chitosanolytic assays were carried out using two extract volumes, 0.05 and 0.1 mL, respectively. Results showed that was possible to produce chitosanase of order aproximatelly 5,9 U.mL-1 by Aspergillus ochraceus and chitosanolytic activity was increased by increment on substrate concentration, aeration ratio as well as agitation while media culture temperature increment decreased activity / No presente trabalho utilizou-se um planejamento fatorial 24 com repeti??o em triplicata no ponto central, para se investigar a influ?ncia dos fatores: concentra??o de quitosana (substrato) (Cs), temperatura de cultivo (TMC), raz?o de aera??o (RA) e agita??o (A) na produ??o da enzima quitosanase por Aspergillus ochraceus. Os ensaios foram realizados aleatoriamente utilizando-se os seguintes n?veis para os fatores: (Cs) (-1) 0,1%; (0) 0,15%; (+1) 0,2%; (TMC) (-1) 25 minutos; (0) 30 minutos; (+1) 35 minutos; (RA) (-1) 0,4; (0) 0,6; (+1) 0,8; (A) (-1) 90 rpm, (0) 120rpm, (+1) 150 rpm. Uma unidade de atividade quitosanol?tica (U.mL-1) foi definida como a quantidade de enzima necess?ria para produzir (1,0 mmol.min-1) de glicosamina por mL de extrato enzim?tico. Para o teste de atividade quitosanol?tica foram utilizados dois volumes diferentes de caldo enzim?tico 0,05 mL e 0,1 mL, respectivamente. Os resultados mostraram que foi poss?vel produzir quitosanase em concentra??o aproximada de 5,9 U.mL-1 utilizando Aspergillus ochraceus e que a atividade foi favorecida pelo aumento da agita??o (A), da raz?o de aera??o (RA) e da concentra??o de substrato (Cs), enquanto que o aumento da temperatura de cultivo (TMC) n?o favoreceu a resposta (atividade quitosanol?tica)

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaimundoCSF_TESE.pdf: 5128355 bytes, checksum: 983c8be1a2dbc05edd6e91353e650c3b (MD5) Previous issue date: 2013-04-05 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / In this work a Plackett-Burman Design with 8 factors and 12 trials in 2 levels with 3 repetitions at the center point was used in order to investigate the influence of the concentration of chitosan, peptone, yeast extract, NaNO3, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O and FeSO4 on chitosanase production by Metarhizium anisopliae. Runs were carried out using submerged discontinuous cultivation for enzyme production. The results of the Plackett & Burman Design showed that only two factors, chitosan concentration as well as FeSO4 had influence on chitosanolytic activity, while the increase in concentration of other factors not contributed significantly to the quitosanol?tica activity. Cultivation medium optimization for enzyme production was carried out using a Composite Central Design, with the most important factors for chitosanolytic activity (chitosan and FeSO4), in accordance with Plackett & Burman Design, and keeping the other nutrients in their minimum values. On this other design, it was taken the highest limit in Plackett & Burman Design as the lowest limit (-1) to FeSO4 factor. The results showed that the enzyme production was favoured by increasing the chitosan concentration and by decreasing FeSO4. Maximum production for chitosanolytic activity was about 70.0 U/L and was reached in only 18 h of fermentation, a result about twenty-eight times greater than a former study using the same microorganism (about 2.5 U/L at 48 h) / No presente trabalho utilizou-se um Planejamento Plackett & Burman, com 8 fatores e 12 ensaios em 2 n?veis e mais 3 repeti??es na condi??o do ponto central, para se investigar a influ?ncia das concentra??es de quitosana, peptona, extrato de levedura, NaNO3, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O e FeSO4 na produ??o da enzima quitosanase por Metarhizium anisopliae. Os ensaios para produ??o da enzima foram realizados em cultivo descont?nuo submerso. Os resultados para o Planejamento Plackett & Burman mostraram que a atividade quitosanol?tica foi favorecida pelo aumento da concentra??o de substrato (quitosana) e de sulfato ferroso (FeSO4), enquanto que o aumento da concentra??o dos outros fatores n?o contribuiu de forma significativa para a atividade quitosanol?tica. A otimiza??o do meio de cultura para a produ??o da enzima foi realizado por meio de um Planejamento Composto Central, com os dois fatores que mais influenciaram a atividade quitosanol?tica (quitosana e FeSO4), conforme Planejamento Plackett & Burman, mantendo-se os outros nutrientes em seus valores m?nimos. Nesse planejamento, para o fator FeSO4, tomou-se o limite inferior (-1) como sendo o limite superior do Planejamento Plackett & Burman. Os resultados mostraram que a produ??o da enzima foi favorecida pelo aumento da concentra??o quitosana e pela diminui??o da concentra??o de FeSO4. A produ??o m?xima de atividade quitosanol?tica foi da ordem de 70,0 U/L e foi atingida em apenas 18 h de fermenta??o, resultado esse vinte e oito vezes maior aos obtidos anteriormente para o mesmo microrganismo que foi 2,5 U/L em 48h