La levure Saccharomyces cerevisiae est capable d’utiliser une grande variété de sucres comme source de carbone et d’énergie. La plupart des enzymes impliquées dans l’utilisation de ces sucres sont codées par des gènes issus de familles multigéniques. C’est le cas de la famille IMA identifiée comme impliquée dans l’utilisation de l’isomaltose. Cette famille comprend cinq gènes qui codent pour quatre isomaltases partageant une forte identité de séquence (de 65% à 100 %). Dans ce travail , la diversitéfonctionnelle de la famille IMA a été étudiée, en caractérisant de façon exhaustive in vitro leurs propriétés biochimiques et enzymologiques. Ima1p et Ima2p possèdent des propriétés biochimiques identiques (pH, température, et thermostabilité) mais Ima3p se distingue par rapport à ces deux protéines bien que n’ayant que trois acides de différence avec Ima2p (thermostabilité plus faible). Ima5p quant à elle, est la protéine la plus dissemblable (température optimale plus faible et demi-vie basse dès 37°C). Les quatre isomaltases sont cependant très sensibles au Tris et aux ions Fe3+. Les quatre isoenzymes présentent une préférence pour les disaccharides liés en α-1,6 (isomaltose et palatinose), avec une cinétique de type Michaëlis-Menten et une inhibition par le substrat à une concentration élevée. Les isomaltases Imap sont cependant aussi capables d'hydrolyser les disaccharides α-1,2, α-1,3 et α-1,5 ainsi que les trisaccharides portant une liaison α-1,6, ce qui met en évidence leur ambiguïté de substrat .Nos résultats ont toutefois montré de nombreuses singularités dans cette famille de protéines. Alors que Ima1p et Ima2p présentent des propriétés très semblables, l’activité catalytique de Ima3p est globalement très faible malgré sa forte ressemblance avec Ima2p. Le variant Ima3p_R279Q retrouve des niveaux d'activité proches de ceux d’Ima2p, tandis que la substitution d’une leucine par une proline à la position 240 a permis d’augmenter de manière significative la stabilité d’Ima3p confirmant le rôle des prolines dans la thermostabilité des protéines. L’hydrolyse de l’isomaltose par Ima5p réfute lesconclusions précédemment publiées sur l'exigence d'acides aminés spécifiques pour déterminer la spécificité de α-1,6 puisque le variant IMA5-MQH ne permet pas de restaurer une activité semblable à Ima1p malgré la présence des trois résidus MQH. Nous avons également trouvé qu’Ima5p est inhibé par le maltose suivant une inhibition mixte tandis qu’Ima1p est inhibée de façon compétitive à faible concentration et de manière incompétitive à forte concentration en isomaltose / Most enzymatic systems for sugar uptake and assimilation rely on multigene families in theyeast Saccharomyces cerevisiae. The IMA / MAL family has been used as a model system to study themolecular mechanisms that govern evolution of duplicated genes. The five IMA multigene familymembers encode four isomaltases sharing high sequence identity from 65% to 99%, of which IMA3and IMA4 are 100% identical to encode the same isomaltase. In this work, the functional diversity ofIMA family was further explored, with exhaustive in-vitro characterization of their biochemical andenzymological properties.Ima1p and Ima2p were similar to biochemical properties; Ima3p showed some differences fromthe two proteins; amongst them, Ima5p was the most distant protein. The four isomaltases were highlysensitive to Tris and Fe3+, but were unaffected by the addition or the removal of Ca2+ despiteconservation of the calcium binding site. Besides, four isoenzymes exhibited a preference for the α-(1,6)disaccharides isomaltose and palatinose, with Michaelis-Menten kinetics and inhibition at highsubstrates concentration. They were also able to hydrolyse trisaccharides bearing an α-(1,6) linkage,but also α-(1,2), α-(1,3) and α-(1,5) disaccharides including sucrose, highlighting their substrateambiguity. While Ima1p and Ima2p presented almost identical characteristics, the results neverthelessshowed many singularities within this protein family. In particular, Ima3p presented lower activitiesthan Ima2p despite only 3 different amino acids between these two isoforms. The Ima3p_R279Qvariant recovered activity levels of Ima2p, while the Leu-to-Pro substitution at position 240significantly increased the stability of Ima3p and supported the role of prolines inthermostability.Ima5p presented the lower optimal temperature and was also extremely sensitive to temperature. Isomaltose hydrolysis by Ima5p challenged previous conclusions about the requirement of specificamino acids for determining the specificity for α-(1,6) substrates. We finally found a mixed inhibitionby maltose for Ima5p while, contrary to a previous work, Ima1p inhibition by maltose was competitiveat very low isomaltose concentrations and uncompetitive as the substrate concentration increased.The presented Ph.D’s work provided preliminary insights into determining structural factorswithin this family, exemplifying for example the role of proline residues for thermosability. Moreover,it was illustrated that a gene family encoding proteins with strong sequence similarities can lead toenzyme with notable differences in biochemical and enzymological properties.

J'ai mis au point une méthodologie pour annoter les superfamilles d'enzymes, en décrire l'histoire et les replacer dans l'évolution de leurs voies métaboliques. J'en ai étudié trois : (1) les amidohydrolases cycliques, dont les DHOases (dihydroorotases, biosynthèse des pyrimidines), pour lesquelles j'ai proposé une nouvelle classification. L'arbre phylogénétique inclut les dihydropyrimidinases (DHPases) et allantoïnases (ALNases) qui ont des réactions similaires dans d'autres voies (dégradation des pyrimidines et des purines respectivement). (2) L'étude de la superfamille des DHODases (qui suivent les DHOases) montre une phylogénie semblable aux DHOases, avec également des enzymes d'autres voies, dont les DHPDases (qui suivent les DHPases). De cette observation est né le concept de module réactionnel, qui correspond à la conservation de l’enchaînement de réactions semblables dans différentes voies métaboliques. Cela a été utilisé lors de (3) l'étude des carbamoyltransférases (TCases) qui incluent les ATCases (précédant les DHOases). J'ai d'abord montré l'existence d'une nouvelle TCase potentiellement impliquée dans la dégradation des purines et lui ai proposé un nouveau rôle en utilisant le concept de module réactionnel (enchaînement avec l'ALNase). Dans ces trois grandes familles j'ai aussi mis en évidence trois groupes de paralogues non identifiés qui se retrouvent pourtant dans un même contexte génétique appelé « Yge » et qui formeraient donc un module réactionnel constitutif d'une nouvelle voie hypothétique. Appliqué à diverses voies, le concept de modules réactionnels refléterait donc les voies métaboliques ancestrales dont ils seraient les éléments de base. / I designed a methodology to annotate enzyme superfamilies, explain their history and describe them in the context of metabolic pathways evolution. Three superfamilies were studied: (1) cyclic amidohydrolases, including DHOases (dihydroorotases, third step of the pyrimidines biosynthesis), for which I proposed a new classification. The phylogenetic tree also includes dihydropyrimidinases (DHPases) and allantoinases (ALNases) which catalyze similar reactions in other pathways (pyrimidine and purine degradation, respectively). (2) The DHODases superfamily (after DHOases) show a similar phylogeny as DHOases, including enzymes from other pathways, DHPDases in particular (after DHPases). This led to the concept of reaction module, i.e. a conserved series of similar reactions in different metabolic pathways. This was used to study (3) the carbamoyltransferases (TCases) which include ATCases (before DHOases). I first isolated a new kind of TCase, potentially involved in the purine degradation, and I proposed a new role for it in the light of reaction modules (linked with ALNase). In those three superfamilies I also found three groups of unidentified paralogs that were remarkably part of the same genetic context called “Yge” which would be a reaction module part of an unidentified pathway. The concept of reactions modules may then reflect the ancestral metabolic pathways for which they would be basic elements.