L'hydrogène est une source d'énergie précieuse en tant que source d'énergie propre et que matière première pour des innombrables industries.Les procédés biologiques de production d'hydrogène gagnent en importance en raison de leurs avantages opérationnelles et de leur polyvalence dans les substrats utilisés (y compris les eaux usées).Dans cette thèse doctoral, on a développé une méthodologie photo-fermentative de production d'hydrogène en utilisant du lactosérum en tant que substrat pour la bactérie Rhodobacter capsulatus IR3::LacZ et B10::LacZ.Ce projet a été réalisé en trois étapes, exposées dans les différents chapitres.Dans la première étape on a identifié les facteurs pertinents pour la production de l'hydrogène avec du sérum synthétique en utilisant la méthodologie de plan d'expériences.Les résultats de cet étape on a obtenu quatre modèles statistiques et on a choisi la souche IR3::LacZ pour les expériences avec du lactosérum industriel.Le rendement volumétrique maximal et le rendement produit / substrat Y P/S obtenus pour la première étape ont été de 64 ml h-1L-1 et 2,08 mol H2 mol-1 C (“C” représente la source de carbone dans ce cas lactose et lactate) pour la solution amortissant le phosphate et 43.01 ml h-1L-1 y 2.52 mol H2 mol-1 C pour la solution Kolthoff.Dans la deuxième étape, on a évalué la production d'hydrogène avec du lactosérum industriel. On a appliqué un pré-traitement de trois étapes avant d'utiliser le lactosérum comme substrat : réduction du contenu gras, déprotéinisation et stérilisation. On a obtenu un modèle validé qui décrit la production d'hydrogène seulement pour la solution amortissant de phosphate. Le rendement volumétrique maximal et le YP/S ont été de 45.93 ml h-1L-1 et de 2.29 mol H2 mol-1 C respectivement. On a déterminé que l'addition d'une étape d’homo-fermentation au processus de prétraitement es avantageuse au rendement du processus. On a obtenu une productivité volumétrique de 69.71 ml h-1L-1 et de YP/S de 2.96 mol H2 mol-1 CLa troisième étape a été la mise à l'échelle des expériences à réacteurs de 1,5 L pour sérum synthétique et de 1L pour serum industriel. On a décelé de la contamination dû à la présence d'un processus de fermentation, lequel a généré une haute production de biogas composé exclusivement par H2 y CO2 ce dernier dans une concentration non superieur à 30% (v/v).Pour ces raisons, on a conclu que conclu que le processus de production intégré, en couplant la fermentation obscure et la photo-fermentation est une option avec un énorme potentiel pour l'utilisation de lactosérum comme substrat dans la production d'hydrogène. / Hydrogen is a valuable gas use as a clean energy source and feedstock for some industries. Biological hydrogen production processes are gaining importance due to their operational conditions and versatility in the substrates (including wastewater). A hydrogen production photo fermentative methodology was developed using cheese whey as a substrate for the bacteria Rhodobacter capsulatus strain IR3::LacZ and B10::LacZ . The project was carried out in three stages.The purpose of the first stage is to identify the relevant factors to produce hydrogen for a synthetic whey medium in a photofermentation process, using the Design of Experiments methodology. The products of this stage are four statistical models, obtained for each strain and buffer solution studied. The strain IR3::LacZ was selected for the experiments with industrial whey as substrate. The maximum volumetric yield and the product/substrate yield YP/S were 64 ml h-1L-1 and 2.08 mol H2 mol-1 C (C is the carbon source in this case lactose and lactate) and 43.01 ml h-1L-1 and 2.52 mol H2 mol-1 C for phosphate buffer and Kolthoff buffer, respectively.In the second stage the production of hydrogen with industrial whey was evaluated. A three-step pre-treatment was applied before using industrial cheese whey as substrate: fat reduction, deproteinization and sterilization. A validate statistical model describing hydrogen production was only obtained for phosphate buffer. The maximum volumetric yield and the product/substrate yield YP/S were 45.93 ml h-1L-1 and 2.29 mol H2 mol-1 C respectively. The addition of an homofermentation to the pretreatment improved the production yield, in this case a volumetric productivity of 69.71 ml h-1L-1 and a YP/S of 2.96 mol H2 mol-1 C were obtained.The third stage was the scale-up to 1.5 and 1 reactor L for synthetic whey and 1L for synthetic and industrial whey respectively. A fermentative process appeared due to a bacterial contamination, leading to a high biogas production. Biogas was exclusively composed of H2 and CO2 the last in a concentration not exceeding 30% (v/v). For this reason, it was concluded that the integrated production process coupling dark and photo fermentations) is an option with great potential for the use of whey as substrate in the production of hydrogen.

La fermentation sombre est un procédé utilisant des déchets organiques dont le passage à l'échelle pilote est limité par les rendements de production d'hydrogène trop faibles ainsi que par l'utilisation des sous-produits. Cette étude a pour premier objectif d'étudier l'effet du pH, de la combinaison du pH et de la concentration en substrat, du prétraitement du substrat et de l'adaptation de l'inoculum sur la fermentation sombre de trois types de déchet différents. Il a notamment été montré que la biodégradabilité des substrats joue un rôle majeur dans le choix des paramètres opérationnels utilisés pour optimiser la production d'hydrogène. De plus, la faisabilité et la stabilité à long terme de la production d'hydrogène par le procédé de fermentation sombre ont été mises en évidence en utilisant des déchets agroalimentaires et du petit lait dans deux réacteurs thermophiliques fonctionnant en mode semi-continu. En particulier, il a été discuté l'influence de la charge organique (OLR), du temps de rétention hydraulique (HRT) et de l'addition de co-substrats (fumier de buffle) comme source d'alcalinité. Cette étude a montré que la combinaison de ces trois paramètres peut jouer un rôle important sur le pH et la stabilité de la production d'hydrogène. De plus, les sous-produits de la fermentation sombre ont été utilisés pour produire de l'hydrogène via la photo-fermentation, alors que les déchets générés par le couplage de la fermentation sombre et de la photo-fermentation ont été valorisés pour la production de méthane par digestion anaérobie. Ce concept de bioraffinerie basé sur la conversion en trois étapes des déchets agroalimentaires augmente le rendement énergétique global du procédé. Par ailleurs, il a été montré le potentiel important du procédé de photo-fermentation pour la production de polyhydroxybutyrate (polymère), parallèlement à celle d'hydrogène. De même, l'utilisation de la fermentation par voie sèche dans une bioraffinerie concept apparaît prometteuse vis à vis de la production de bioénergie et de molécules telles que les acides organiques et les alcools / Low biohydrogen (H2) yields and use of process by-products from dark fermentation (DF) of waste biomass is limiting its scaled-up application. This study aims to investigate the effects of culture pH, combination of substrate concentration and culture pH, pre-treatment of substrate and inoculum adaptation in H2 yields during the DF of three different wastes biomass. The study showed that the biodegradability of the substrates is important for the selection and application of optimum operational parameters aimed at enhancing H2 production. Moreover, long-term operational feasibility and stability of dark fermentative H2 production was demostrated using food waste and cheese whey in two semi-continuous thermophilic DF reactors. The effect of organic loading rates (OLRs), hydraulic retention times (HRTs) and co-substrates (buffalo manure) addition as a source of alkalinity on culture pH and H2 production stability was discussed. The study showed that combination of OLR, HRT and co-substrate addition could play an important role in the culture pH and stability of H2 production. Furthermore, the by-products of DF process was utilized for H2 production via photo fermentation (PF), while the waste stream generated from coupling of DF and PF processes was converted to methane in anaerobic digestion (AD). The three-step conversion of food waste in a biorefinery concept increased the total energy yields. Moreover, PF also showed a good potential for concomitant production of H2 and polyhydroxybutyrate (biopolymer). Likewise, dry fermentation could be promising to a biorefinery concept based on waste biomass for the production of bioenergy and biochemicals (organic acids and alcohols)

Production of hydrogen from biomass through the use of dark and photofermentative bacteria will be applicable in the future and a promising route. The aim of this study is to develop and to scale-up solar panel photobioreactors for the biological hydrogen production by photosynthetic purple non sulfur (PNS) bacteria on artificial substrates and on real dark fermentation effluent of molasses. The parameters studied are light intensity, temperature, feed stock, feed rate, pH, cell density, light and dark cycle and carbon to nitrogen ratio on hydrogen production. Continuous hydrogen production has been achieved on artificial medium and dark fermentor effluent of molasses containing acetate and lactate by Rhodobacter capsulatus wild type and (hup-) mutant strains in panel photobioreactors in indoor and outdoor conditions by fed batch operation. Laboratory (from 4 to 8 liters) and large scale (20 L) panel photobioreactors by using various designs and construction materials were developed. In this photobioreactors continuous hydrogen production was achieved by feeding. Na2CO3 can be used as buffer to keep the pH stable during long term operation on molasses dark fermentor effluent. The adjustment of the feedstock by dilution and buffer addition were found to be essential for the long term stability of pH, biomass and H2 production for both in indoor and outdoor applications.

By the integration of dark and photo fermentative hydrogen production processes, higher yields of hydrogen can be obtained from biomass. In the first step, biomass is utilized for hydrogen production by dark fermentation and in the second step, the effluent of dark fermentation is further utilized for hydrogen production by photofermentation using photosynthetic purple non-sulfur bacteria. The purpose of this study was to develop a solar pilot scale tubular photobioreactor (PBR) for continuous photo fermentative hydrogen production from the effluent of dark fermentation. This study demonstrated the implementation of the solar pilot tubular PBR for this new technology for the first time and successful continuous operations were performed in different seasons. Two different strains of Rhodobacter capsulatus were used for the operations. It was showed that even in winter, pure hydrogen could be produced in the pilot PBR with an average productivity of 0.3 mol H2/m3.h, when circulation of the PBR was continuous. Productivity obtained by the mutant strain was 0.2 mol H2/m3.h with periodical circulation. The integration between dark and photo fermentation was proven at pilot scales by using real dark fermenter effluents of molasses and thick juice. DFE of thick juice yielded a maximum productivity of 0.27 mol H2/m3.h whereas the maximum productivity obtained from DFE of molasses was 0.12 mol H2/m3.h. The most important factor affecting productivity is found to be the total received light energy and a yield factor (mmol H2/g dry cell weight) was correlated with total received light energy. Acetic acid consumption rates were found to be first order for daytime and zero order for nights. Furthermore acetic acid utilization for different metabolic pathways were estimated and by-product, poly- &beta / - hydroxybutyrate, specific rates of product formation were determined.

Les défis conjoints du changement climatique d'origine anthropique et la diminution des réserves de combustibles fossiles sont le moteur de recherche intense pour des sources d'énergie alternatives. Une avenue attrayante est d'utiliser un processus biologique pour produire un biocarburant. Parmi les différentes options en matière de biocarburants, le bio-hydrogène gazeux est un futur vecteur énergétique attrayant en raison de son efficacité potentiellement plus élevé de conversion de puissance utilisable, il est faible en génération inexistante de polluants et de haute densité d'énergie. Cependant, les faibles rendements et taux de production ont été les principaux obstacles à l'application pratique des technologies de bio-hydrogène. Des recherches intensives sur bio-hydrogène sont en cours, et dans les dernières années, plusieurs nouvelles approches ont été proposées et étudiées pour dépasser ces inconvénients. À cette fin, l'objectif principal de cette thèse était d'améliorer le rendement en hydrogène moléculaire avec un accent particulier sur l'ingénierie métabolique et l’utilisation de bioprocédés à variables indépendantes. Une de nos hypothèses était que la production d’hydrogène pourrait être améliorée et rendue plus économiquement viable par ingénierie métabolique de souches d’Escherichia coli producteurs d’hydrogène en utilisant le glucose ainsi que diverses autres sources de carbone, y compris les pentoses. Les effets du pH, de la température et de sources de carbone ont été étudiés. La production maximale d'hydrogène a été obtenue à partir de glucose, à un pH initial de 6.5 et une température de 35°C. Les études de cinétiques de croissance ont montré que la μmax était 0.0495 h-1 avec un Ks de 0.0274 g L-1 lorsque le glucose est la seule source de carbone en milieu minimal M9. .Parmi les nombreux sucres et les dérivés de sucres testés, les rendements les plus élevés d'hydrogène sont avec du fructose, sorbitol et D-glucose; 1.27, 1.46 et 1.51 mol H2 mol-1 de substrat, respectivement. En outre, pour obtenir les interactions entre les variables importantes et pour atteindre une production maximale d'hydrogène, un design 3K factoriel complet Box-Behnken et la méthodologie de réponse de surface (RSM) ont été employées pour la conception expérimentale et l'analyse de la souche d'Escherichia coli DJT135. Le rendement en hydrogène molaire maximale de 1.69 mol H2 mol-1 de glucose a été obtenu dans les conditions optimales de 75 mM de glucose, à 35°C et un pH de 6.5. Ainsi, la RSM avec un design Box-Behken était un outil statistique utile pour atteindre des rendements plus élevés d'hydrogène molaires par des organismes modifiés génétiquement. Ensuite, l'expression hétérologue de l’hydrogénases soluble [Ni-Fe] de Ralstonia eutropha H16 (l'hydrogénase SH) a tenté de démontrer que la mise en place d'une voie capable de dériver l'hydrogène à partir de NADH pourrait surpasser le rendement stoechiométrique en hydrogène.. L’expression a été démontrée par des tests in vitro de l'activité enzymatique. Par ailleurs, l'expression de SH a restaurée la croissance en anaérobie de souches mutantes pour adhE, normalement inhibées en raison de l'incapacité de réoxyder le NADH. La mesure de la production d'hydrogène in vivo a montré que plusieurs souches modifiées métaboliquement sont capables d'utiliser l'hydrogénase SH pour dériver deux moles d’hydrogène par mole de glucose consommé, proche du maximum théorique. Une autre stratégie a montré que le glycérol brut pourrait être converti en hydrogène par photofermentation utilisant Rhodopseudomonas palustris par photofermentation. Les effets de la source d'azote et de différentes concentrations de glycérol brut sur ce processus ont été évalués. À 20 mM de glycérol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus dans des conditions optimales, un rendement de 87% de la théorie, et significativement plus élevés que ce qui a été réalisé auparavant. En prolongement de cette étude, l'optimisation des paramètres a également été utilisée. Dans des conditions optimales, une intensité lumineuse de 175 W/m2, 30 mM glycérol et 4.5 mM de glutamate, 6.69 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus, soit un rendement de 96% de la valeur théorique. La détermination de l'activité de la nitrogénase et ses niveaux d'expression ont montré qu'il y avait relativement peu de variation de la quantité de nitrogénase avec le changement des variables alors que l'activité de la nitrogénase variait considérablement, avec une activité maximale (228 nmol de C2H4/ml/min) au point central optimal. Dans la dernière section, la production d'hydrogène à partir du glucose via la photofermentation en une seule étape a été examinée avec la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). La méthodologie de surface de réponse avec Box-Behnken a été utilisée pour optimiser les variables expérimentales de façon indépendante, soit la concentration de glucose, la concentration du glutamate et l'intensité lumineuse, ainsi que d'examiner leurs effets interactifs pour la maximisation du rendement en hydrogène moléculaire. Dans des conditions optimales, avec une intensité lumineuse de 175 W/m2, 35 mM de glucose, et 4.5 mM de glutamate,, un rendement maximal d'hydrogène de 5.5 (± 0.15) mol hydrogène /mol glucose, et un maximum d'activité de la nitrogénase de 246 (± 3.5) nmol C2H4/ml/min ont été obtenus. L'analyse densitométrique de l'expression de la protéine-Fe nitrogenase dans les différentes conditions a montré une variation significative de l'expression protéique avec un maximum au point central optimisé. Même dans des conditions optimales pour la production d'hydrogène, une fraction significative de la protéine Fe a été trouvée dans l'état ADP-ribosylée, suggérant que d'autres améliorations des rendements pourraient être possibles. À cette fin, un mutant amtB dérivé de Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) a été créé en utilisant le vecteur de suicide pSUP202. Les résultats expérimentaux préliminaires montrent que la souche nouvellement conçue métaboliquement, R. capsulatus DG9, produit 8.2 (± 0.06) mol hydrogène / mole de glucose dans des conditions optimales de cultures discontinues (intensité lumineuse, 175 W/m2, 35 mM de glucose et 4.5 mM glutamate). Le statut d'ADP-ribosylation de la nitrogénase-protéine Fe a été obtenu par Western Blot pour la souche R. capsulatus DG9. En bref, la production d'hydrogène est limitée par une barrière métabolique. La principale barrière métabolique est due au manque d'outils moléculaires possibles pour atteindre ou dépasser le rendement stochiométrique en bio-hydrogène depuis les dernières décennies en utilisant les microbes. À cette fin, une nouvelle approche d’ingénierie métabolique semble très prometteuse pour surmonter cette contrainte vers l'industrialisation et s'assurer de la faisabilité de la technologie de la production d'hydrogène. Dans la présente étude, il a été démontré que l’ingénierie métabolique de bactéries anaérobiques facultatives (Escherichia coli) et de bactéries anaérobiques photosynthétiques (Rhodobacter capsulatus et Rhodopseudomonas palustris) peuvent produire de l'hydrogène en tant que produit majeur à travers le mode de fermentation par redirection métabolique vers la production d'énergie potentielle. D'autre part, la méthodologie de surface de réponse utilisée dans cette étude représente un outil potentiel pour optimiser la production d'hydrogène en générant des informations appropriées concernant la corrélation entre les variables et des producteurs de bio-de hydrogène modifiés par ingénierie métabolique. Ainsi, un outil d'optimisation des paramètres représente une nouvelle avenue pour faire un pont entre le laboratoire et la production d'hydrogène à l'échelle industrielle en fournissant un modèle mathématique potentiel pour intensifier la production de bio-hydrogène. Par conséquent, il a été clairement mis en évidence dans ce projet que l'effort combiné de l'ingénierie métabolique et la méthodologie de surface de réponse peut rendre la technologie de production de bio-hydrogène potentiellement possible vers sa commercialisation dans un avenir rapproché. / The joint challenges of anthropogenic climate change and dwindling fossil fuel reserves are driving intense research into alternative energy sources. One attractive avenue is to use a biological process to produce a biofuel. Among the various biofuel options, biohydrogen gas is an attractive future energy carrier due to its potentially higher efficiency of conversion to usable power, low to non-existent generation of pollutants and high energy density. However, low yields and production rates have been major barriers to the practical application of biohydrogen technologies. Intensive research on biohydrogen is underway, and in the last few years several novel approaches have been proposed and studied to surpass these drawbacks. To this end the main aim of this thesis was to improve the molar hydrogen yield with special emphasis of metabolic engineering using the interactive effect with bioprocess independent variable. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economically viable by metabolic engineering on the facultative hydrogen producer Escherichia coli from glucose as well as various other carbon sources, including pentoses. The effects of pH, temperature and carbon source were investigated in batch experiments. Maximal hydrogen production from glucose was obtained at an initial pH of 6.5 and temperature of 35°C. Kinetic growth studies showed that the μmax was 0.0495 h−1 with a Ks of 0.0274 g L−1 when glucose was the sole carbon source in M9 (1X) minimal medium. Among the many sugar and sugar derivatives tested, hydrogen yields were highest with fructose, sorbitol and d-glucose; 1.27, 1.46 and 1.51 mol H2 mol−1 substrate respectively. In addition, to obtain the interactions between the variables important for achieving maximum hydrogen production, a 3K full factorial Box–Behnken design and response surface methodology (RSM) were employed for experimental design and analysis on a metabolically engineered Escherichia coli strain, DJT135. A maximum molar hydrogen yield of 1.69 mol H2 mol−1 glucose was obtained under the optimal conditions of 75 mM glucose, 35°C and pH 6.5. Thus, RSM with Box–Behnken design was a useful statistical tool for achieving higher molar hydrogen yields by metabolically engineered organisms. Furthermore, the heterologous expression of the soluble [Ni-Fe] hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 (the SH hydrogenase) was attempted to demonstrate the introduction of a pathway capable of deriving hydrogen from NADH to surpass the stoichiometric molar hydrogen yield. Successful expression was demonstrated by in vitro assay of enzyme activity. Moreover, expression of SH restored anaerobic growth on glucose to adhE strains, normally blocked for growth due to the inability to re-oxidize NADH. Measurement of in vivo hydrogen production showed that several metabolically engineered strains were capable of using the SH hydrogenase to derive 2 mol H2 per mol of glucose consumed, close to the theoretical maximum. Using another strategy, it was shown that crude glycerol could be converted to hydrogen, a possible future clean energy carrier, by photofermentation using Rhodopseudomonas palustris through photofermentation. Here, the effects of nitrogen source and different concentrations of crude glycerol on this process were assessed. At 20 mM glycerol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained under optimal conditions, a yield of 87% of the theoretical, and significantly higher than what was achieved previously. As a continuation of this study, multiprocess parameter optimization was also involved. Under optimal conditions, a light intensity of 175 W/m2, 30 mM glycerol, and 4.5 mM glutamate, 6.69 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained, a yield 96% of theoretical. Determination of nitrogenase activity and expression levels showed that there was relatively little variation in levels of nitrogenase protein with changes in process variables whereas nitrogenase activity varied considerably, with maximal nitrogenase activity (228 nmol of C2H4/ml/min) at the optimal central point. In the final section, hydrogen production from glucose via single-stage photofermentation was examined with the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). Response surface methodology with Box–Behnken design was used to optimize the independent experimental variables of glucose concentration, glutamate concentration and light intensity, as well as examining their interactive effects for maximization of molar hydrogen yield. Under optimal condition with a light intensity of 175 W/m2, 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate, a maximum hydrogen yield of 5.5 (±0.15) mol H2/mol glucose, and a maximum nitrogenase activity of 246 (±3.5) nmol C2H4/ml/min were obtained. Densitometric analysis of nitrogenase Fe-protein expression under different conditions showed significant variation in Fe-protein expression with a maximum at the optimized central point. Even under optimum conditions for hydrogen production, a significant fraction of the Fe-protein was found in the ADP-ribosylated state, suggesting that further improvement in yields might be possible. To this end an AmtB- derivative of Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) was created by conjugating in amtB::Km using the suicide vector pSUP202. Preliminary experimental results showed that the newly metabolically engineered strain, R. capsulatus DG9, produced 8.2 (±0.06) mol hydrogen/mole of glucose under optimal conditions in batch cultures (light intensity, 175 W/m2; 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate). Western blot analyses of the ADP-ribosylation status of the nitrogenase Fe-protein were investigated on metabolically engineered strain R. capsulatus DG9. In brief, the progress on hydrogen production technology has been limited due to the metabolic barrier. The major metabolic barrier is due to lacking of potential consistent molecular tools to reach or surpass the stochiometric biohydrogen yield since last decades using microbes. To this end a novel approach “metabolic engineering” seems very promising to overcome this constraint towards industrialization to ensure the feasibility of hydrogen production technology. In this present study it has been shown that metabolically engineered facultative (Escherichia coli) anaerobe and photosynthetic bacteria (Rhodobacter capsulatus and Rhodopseudomonas palustris) can produce hydrogen as a major product through fermentative mode by metabolic redirection toward potential energy generation. On the other hand, response surface methodology has depicted in this study as another potential tool to statistically optimize the hydrogen production by generating suitable information concerning interactive correlation between process variables and metabolically engineered biohydrogen producers. Thus, multi process parameter optimization tool has been creating a novel avenue to make a crosslink between lab scale and pilot scale hydrogen production by providing potential mathematical model for scaling up biohydrogen production using metabolically engineered biohydrogen producers. Therefore, it has been clearly revealed in this project that combined effort of metabolic engineering and response surface methodology can make biohydrogen production technology potentially feasible towards its commercialization in near future.

The movement towards a more sustainable energy economy may require not only the generation of cleaner fuel sources, but the conversion of waste streams into value-added products. Phototrophic purple non-sulfur bacteria are capable of metabolizing VFAs (volatile fatty acids)and generate hydrogen as a byproduct of nitrogen fixation using energy absorbed from light. VFAs are easily produced from dark anaerobic fermentation of food, agricultural, and municipal wastes, which could then be fed into photobioreactors of purple bacteria for hydrogen production. The process of photofermentation by purple bacteria for hydrogen production remains attractive due to the capability of reaching high substrate conversions under mild operating conditions, but increasing the efficiency of converting light energy into hydrogen remains challenging. Purple bacteria cannot utilize the entire solar spectrum, and the dominant region of absorption lies in the near-infrared region above 800 nm. In this work, the model purple non-sulfur bacteria Rhodopseudomonas palustris was used to study different strategies to increase light utilization and hydrogen production. Near-infrared LED arrays were selected to match the target bacteriochlorophyll absorption range, and were tested to be used as a sole illumination source for photofermentation. Additionally, plasmonic nanoparticles with resonant frequencies matching bacterial absorbance were added in solution to increase light utilization through scattering and near field electric enhancement effects at intensities around 100 W/m2 . Both of these approaches proved to increase cellular growth rate and hydrogen production, which opens the door to utilizing more advanced photonic structures for use in bacterial phototrophic processes.

One of the most important parameters affecting hydrogen production in photofermentation process is the type of carbon and nitrogen sources. For this reason in this research, the effect of different nitrogen sources (5mM ammonium chloride and 2mM glutamate) and acetate concentrations (40

Biological hydrogen production through integration of dark and photo-fermentation by using biomass is a promising alternative for energy supply problems. The main purpose of this study was to investigate photobiological H2 production by the purple non-sulfur (PNS) bacteria Rb. capsulatus on dark fermentation effluent of sugar beet thick juice (DFESBTJ). Presence of NH4+ in effluents is an important parameter since NH4+ inhibit the nitrogenase enzyme activity. Therefore, the influence of different NH4+ concentrations in the DFESBTJ by removing using natural zeolite clinoptilolite on photofermentative H2 production were studied using Rb. capsulatus DSM1710 and Rb. capsulatus YO3 (hup-). Also, the effect of EtOH concentrations (between 6.25 and 200 mM) in the defined medium on H2 production were studied using both bacterial strains since EtOH is a possible by-product of dark fermentation process. The experiments were carried out in small scale bottle photobioreactors (PBRs) and outdoor panel PBR (4 L). H2 productivity of 1.12 mmol/Lc/h was attained over 15 days of operation for panel PBR. The results showed that the zeolite was effective in removing NH4+ from the DFESBTJ as its concentration decreased by 95% after treatment. In both bacterial strains, an increase in the maximum productivities and molar H2 yields was observed with the decrease in NH4+concentrations. There was no significant effect of EtOH on H2 production except the inhibition at 200 mM. The main conclusions were that both bacterial strains could effectively utilize the DFESBTJ for growth and H2 production, therefore facilitating the integration of the dark and photo-fermentation for sustainable biohydrogen production.

La recherche de sources d’énergie fiables ayant un faible coût environnemental est en plein essor. L’hydrogène, étant un transporteur d’énergie propre et simple, pourrait servir comme moyen de transport de l’énergie de l’avenir. Une solution idéale pour les besoins énergétiques implique une production renouvelable de l’hydrogène. Parmi les possibilités pour un tel processus, la production biologique de l’hydrogène, aussi appelée biohydrogène, est une excellente alternative. L’hydrogène est le produit de plusieurs voies métaboliques bactériennes mais le rendement de la conversion de substrat en hydrogène est généralement faible, empêchant ainsi le développement d’un processus pratique de production d’hydrogène. Par exemple, lorsque l’hydrogène est produit par la nitrogénase sous des conditions de photofermentation, chaque molécule d’hydrogène constituée requiert 4 ATP, ce qui rend le processus inefficace. Les bactéries photosynthétiques non sulfureuses ont la capacité de croître sous différentes conditions. Selon des études génomiques, Rhodospirillum rubrum et Rhodopseudomonas palustris possèdent une hydrogénase FeFe qui leur permettrait de produire de l’hydrogène par fermentation anaérobie de manière très efficace. Il existe cependant très peu d’information sur la régulation de la synthèse de cette hydrogénase ainsi que sur les voies de fermentation dont elle fait partie. Une surexpression de cette enzyme permettrait potentiellement d’améliorer le rendement de production d’hydrogène. Cette étude vise à en apprendre davantage sur cette enzyme en tentant la surexpression de cette dernière dans les conditions favorisant la production d’hydrogène. L’utilisation de résidus organiques comme substrat pour la production d’hydrogène sera aussi étudiée. / The search for alternative energy sources with low environmental impact is in great expansion. Hydrogen, an elegant and simple energy transporter, could serve as means of transporting energy in the future. An ideal solution to the increasing energy needs would imply a renewable production of hydrogen. Out of all the existing possibilities for such a process, the biological production of hydrogen, also called biohydrogen, is an excellent alternative. Hydrogen is the end result or co-product of many pathways in bacterial metabolism. However, such pathways usually show low yields of substrate to hydrogen conversion, which prevents the development of efficient production processes. For example, when hydrogen is produced via nitrogenase under photofermentation conditions, each hydrogen molecule produced requires 4 molecules of ATP, rendering the process very energetically inefficient. Purple non-sulfur bacteria are highly adaptive organisms that can grow under various conditions. According to recent genomic analyses, Rhodospirillum rubrum and Rhodopseudomonas palustris possess, within their genome, an FeFe hydrogenase that would allow them to produce hydrogen via dark fermentation quite efficiently. Unfortunately, very little information is known on the regulation of the synthesis of this enzyme or the various pathways that require it. An overexpression of this hydrogenase could potentially increase the yields of substrate to hydrogen conversion. This study aims to increase our knowledge about this FeFe hydrogenase by overexpressing it in conditions that facilitate the production of hydrogen. The use of organic waste as substrate for hydrogen production will also be studied.

La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.