Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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L’azote est un des éléments les plus importants dans la nature. Sa disponibilité limite la productivité d’un grand nombre d’écosystèmes naturels, et influencera sans doute de manière importante leurs réponses aux changements climatiques globaux. La première source d’azote dans les écosystèmes non anthropisés est la fixation biologique de l’azote. Ce processus repose sur un groupe de métallo-enzymes spécifiques, les nitrogénases, dont le cofacteur métallique contient soit du fer et un atome de molybdène, soit du fer et un atome de vanadium, soit uniquement du fer. A ce jour, seule la nitrogénase au molybdène est prise en considération dans la dynamique de l’azote dans les écosystèmes, et ce malgré de nombreux indices indiquant que la nitrogénase au vanadium pourrait avoir un rôle important. Est-ce que la nitrogénase au vanadium est utilisée dans les écosystèmes naturels et quelles sont les conditions favorisant son utilisation ? Nous avons cherché à répondre à ces questions à l’aide d’un modèle symbiotique tripartite, un lichen, association entre une algue, un champignon et une cyanobactérie fixatrice d’azote. Nous avons tout d’abord développé une méthode d’étude des contenus en métaux des différents symbiontes, puis nous avons étudié la répartition et la régulation du vanadium au sein des différents symbiontes dans différentes conditions environnementales. Nous avons pu démontrer que dans ce modèle, le vanadium possède toutes les caractéristiques d’un micronutriment essentiel à la fixation d’azote. Nous avons également démontré que la disponibilité du molybdène ainsi que les températures, telles que rencontrées en milieux boréaux, seraient deux facteurs importants contrôlant l’utilisation de la V-Nase. Les résultats présentés dans cette étude apportent une meilleure compréhension de la gestion des métaux cofacteurs de la nitrogénase au sein de la symbiose lichénique. Mais ils permettent surtout de remettre en question le paradigme de l’hégémonie du molybdène sur la fixation biologique de l’azote. Ainsi, la fixation d’azote en milieu continental repose sur un ensemble hétérogène d’enzymes, ce qui autorise aux organismes fixateurs d’azote une grande flexibilité vis-à-vis des paramètres environnementaux comme les basses températures. Cela leurs permet également une meilleure adaptation au stress métallique résultant de carences en micronutriments, notamment celle en molybdène. Ces résultats invitent également à réévaluer les modèles biogéochimiques liant les cycles des micronutriments aux cycles des macronutriments, particulièrement celui de l’azote.

La fixation biologique d’azote (réduction du N2 atmosphérique, non biodisponible, en ammonium (NH3) bioassimilable) est catalysée par la métalloenzyme nitrogénase. Cette enzyme existe sous trois isoformes chez la bactérie du sol Azotobacter vinelandii: les nitrogénases au molybdène (Mo), au vanadium (V) et au fer (Fe). L’acquisition des métaux cofacteurs constitue un paramètre d’intérêt majeur car Mo et V sont fortement complexés à la matrice (matière organique et oxydes) ce qui peut limiter leur disponibilité. Ces travaux ont montré que la présence d’acide tannique et d’oxydes de fer entraîne des changements majeurs dans la gestion des métaux cofacteurs (Mo et V) chez A. vinelandii. Les stratégies d’acquisition des métaux cofacteurs sont fortement modifiées en présence de ces complexants avec (i) un changement important de la quantité des metallophores produits ainsi que (ii) une acquisition simultanée de Mo et V dans des conditions traditionnellement considérées comme non limitantes en Mo. Ceci se traduit par un changement important dans l’utilisation des nitrogénases; les niveaux de transcrits élevés des gènes nifD et vnfD, spécifiques des nitrogénases au Mo et au V respectivement, suggèrent une utilisation simultanée de ces isoenzymes pour assurer la fixation d’azote. Ce projet a permis de mettre en évidence que face à un stress métallique, l’utilisation des isoformes de la nitrogénase par A. vinelandii est un processus plus versatile que précédemment décrit et que le coût d’acquisition des métaux dans ces conditions constitue un facteur important de la régulation de l’activité des nitrogénases. Ceci suggère que les nitrogénases alternatives pourraient contribuer à la fixation d’azote de manière plus importante que présentement admis.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote. / The atmosphere of the Earth is very rich in nitrogen (N2). However, diatomic nitrogen is very stable and therefore unusable by the majority of life forms even though it is necessary for the synthesis of a variety of organic compounds. Only diazotrophic procaryotes are capable of using N2 as nitrogen source. Their nitrogen fixation allows the production of aminated compounds from atmospheric nitrogen (78 %). However, this process is very complex and requires the biosynthesis of about twenty proteins and the consumption of a lot of energy (16 molecules of ATP per molecule of N2 fixed), thus necessitating its tight regulation. The purple non-sulfur photosynthetic bacteria are known for their ability to carry out nitrogen fixation. Studies conducted in the light, the preferred mode of growth of these bacteria (anaerobic photosynthetic), have shown that nitrogenase (the enzyme responsible for dinitrogen fixation) is subject to regulation at three levels: transcriptional regulation of NifA (activator protein for the transcription of nif genes), posttranslational regulation of the activity of NifA to activate nif gene transcription, and posttranslational regulation of nitrogenase activity when cells are subjected to an ammonium shock. The control system already described involves essentially a membrane protein, AmtB and both PII proteins, GlnK and GlnB. It has long been known that nitrogenase is regulated when light is suddenly removed from a culture, but until now it is unclear whether these systems are also involved in the regulation of nitrogen fixation in dark. Thus, one outstanding question is what are the proteins involved in the inactivation of nitrogenase when a light-grown culture is placed in the dark? An analysis of several mutant strains; amtB-, glnK-, glnB-, and amtY- under different conditions of nitrogen deficiency was used to address this question. Using measurements of nitrogenase activity and Fe protein modification by Western blotting, we were able to show that darkness causes a "switch-off” of nitrogenase due to ADP- ribosylation of Fe protein. Thus, the system that has already been described as involved in the response to a lack of ammonia, is also required for a response to a lack of light or energy (AmtB, GlnK, GlnB, DraG, and DraT, and AmtY). However, Rhodobacter capsulatus is also able to fix nitrogen and grow micro-aerobically in the dark as well as photosynthetically under anaerobic conditions, but so far its regulation in the dark has been little studied. The study of nitrogen fixation in the dark allowed us to show that the Rnf membrane complex is not required for growth of R. capsulatus in such conditions. In order to develop a way to study its regulation during this growth mode, we have attempted to identify the operating conditions (O2, [NH4+]), allowing R. capsulatus to fix nitrogen micro-aerobically. The optimization of this conditions has shown that the optimal concentration of oxygen required is 10% mixed with nitrogen.

L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance. / Nitrogen is the most abundant element in the Earth's atmosphere with a percentage of 78 %. This element is essential for the biosynthesis of cellular organic material and is unusable in its stable diatomic form (N2) by most organisms. Only bacteria called diazotrophs such as Rhodobacter capsulatus are able to fix molecular nitrogen N2 through the synthesis of the nitrogenase enzyme. The latter catalyzes the reduction of N2 to NH4 which can then be absorbed by other organisms. The synthesis and activity of nitrogenase consumes a lot of energy and therefore implies a strict regulation and its inhibition when a sufficient amount of ammonium is available. Among the proteins involved in this regulation, is the membrane transporter AmtB which is responsible for the sensing and transportation of ammonia. In R. capsulatus, it was shown that following the addition of ammonium, AmtB reversibly inhibits (switch off / switch on) nitrogenase activity by sequestering the PII protein GlnK accompanied by the addition of an ADP ribose group onto the Fe subunit of the enzyme by DraT. In addition, the formation of this complex alone would not be sufficient for this inactivation, suggesting the sequestration of a third protein, DraG is required to inhibit its action of removing the ADP ribose from the nitrogenase and therefore its reactivation. To better understand the role of the AmtB in the fixation of nitrogen, regulation and transport of ammonium at the molecular level, the first part of this study was to introduce a point mutation by directed mutagenesis in the conserved residue W237 of AmtB . Hydrogen production is another property of R. capsulatus that has been studied for a long time. This bacterium is capable of producing hydrogen from organic compounds following photofermentation and the exclusive enzymatic intervention of nitrogenase. Several studies have been undertaken to improve the production of hydrogen. Some of them were involved in determining the optimum conditions that give maximum gas production while others were interested in improving the growth of the bacterium itself. Thus, since the bio-production of H2 by fermentation is catalyzed by the nitrogenase, it is important to study the regulation of the activity of this enzyme by different mechanisms such as the switch off by ADP ribosylation. Therefore, a mutant of R. capsulatus (DG9) lacking AmtB was studied in the second part of this thesis for its nitrogenase activity, its modification by GlnK-DraG, and to see the effects of different amino acids used in the growth medium on the regulation and therefore the future use of this strain for the production of H2. The results showed a continuous and uninterrupted activity of the nitrogenase when AmtB was absent with a maximum activity when proline was used as a nitrogen source for bacterial growth. In addition, Western blots were used to demonstrate the effect of ADP ribosylation on regulation and that the expression of GlnK and DraG were unchanged between the wild –type and mutant R. capsulatus. In conclusion, nitrogenase is not modified or inhibited when mutated amtB what makes the R. capsulatus strain DG9 an ideal candidate for biohydrogen production especially when glucose and proline are respectively used as source carbon and nitrogen for growth.

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote. / The atmosphere of the Earth is very rich in nitrogen (N2). However, diatomic nitrogen is very stable and therefore unusable by the majority of life forms even though it is necessary for the synthesis of a variety of organic compounds. Only diazotrophic procaryotes are capable of using N2 as nitrogen source. Their nitrogen fixation allows the production of aminated compounds from atmospheric nitrogen (78 %). However, this process is very complex and requires the biosynthesis of about twenty proteins and the consumption of a lot of energy (16 molecules of ATP per molecule of N2 fixed), thus necessitating its tight regulation. The purple non-sulfur photosynthetic bacteria are known for their ability to carry out nitrogen fixation. Studies conducted in the light, the preferred mode of growth of these bacteria (anaerobic photosynthetic), have shown that nitrogenase (the enzyme responsible for dinitrogen fixation) is subject to regulation at three levels: transcriptional regulation of NifA (activator protein for the transcription of nif genes), posttranslational regulation of the activity of NifA to activate nif gene transcription, and posttranslational regulation of nitrogenase activity when cells are subjected to an ammonium shock. The control system already described involves essentially a membrane protein, AmtB and both PII proteins, GlnK and GlnB. It has long been known that nitrogenase is regulated when light is suddenly removed from a culture, but until now it is unclear whether these systems are also involved in the regulation of nitrogen fixation in dark. Thus, one outstanding question is what are the proteins involved in the inactivation of nitrogenase when a light-grown culture is placed in the dark? An analysis of several mutant strains; amtB-, glnK-, glnB-, and amtY- under different conditions of nitrogen deficiency was used to address this question. Using measurements of nitrogenase activity and Fe protein modification by Western blotting, we were able to show that darkness causes a "switch-off” of nitrogenase due to ADP- ribosylation of Fe protein. Thus, the system that has already been described as involved in the response to a lack of ammonia, is also required for a response to a lack of light or energy (AmtB, GlnK, GlnB, DraG, and DraT, and AmtY). However, Rhodobacter capsulatus is also able to fix nitrogen and grow micro-aerobically in the dark as well as photosynthetically under anaerobic conditions, but so far its regulation in the dark has been little studied. The study of nitrogen fixation in the dark allowed us to show that the Rnf membrane complex is not required for growth of R. capsulatus in such conditions. In order to develop a way to study its regulation during this growth mode, we have attempted to identify the operating conditions (O2, [NH4+]), allowing R. capsulatus to fix nitrogen micro-aerobically. The optimization of this conditions has shown that the optimal concentration of oxygen required is 10% mixed with nitrogen.

La recherche de sources d’énergie fiables ayant un faible coût environnemental est en plein essor. L’hydrogène, étant un transporteur d’énergie propre et simple, pourrait servir comme moyen de transport de l’énergie de l’avenir. Une solution idéale pour les besoins énergétiques implique une production renouvelable de l’hydrogène. Parmi les possibilités pour un tel processus, la production biologique de l’hydrogène, aussi appelée biohydrogène, est une excellente alternative. L’hydrogène est le produit de plusieurs voies métaboliques bactériennes mais le rendement de la conversion de substrat en hydrogène est généralement faible, empêchant ainsi le développement d’un processus pratique de production d’hydrogène. Par exemple, lorsque l’hydrogène est produit par la nitrogénase sous des conditions de photofermentation, chaque molécule d’hydrogène constituée requiert 4 ATP, ce qui rend le processus inefficace. Les bactéries photosynthétiques non sulfureuses ont la capacité de croître sous différentes conditions. Selon des études génomiques, Rhodospirillum rubrum et Rhodopseudomonas palustris possèdent une hydrogénase FeFe qui leur permettrait de produire de l’hydrogène par fermentation anaérobie de manière très efficace. Il existe cependant très peu d’information sur la régulation de la synthèse de cette hydrogénase ainsi que sur les voies de fermentation dont elle fait partie. Une surexpression de cette enzyme permettrait potentiellement d’améliorer le rendement de production d’hydrogène. Cette étude vise à en apprendre davantage sur cette enzyme en tentant la surexpression de cette dernière dans les conditions favorisant la production d’hydrogène. L’utilisation de résidus organiques comme substrat pour la production d’hydrogène sera aussi étudiée. / The search for alternative energy sources with low environmental impact is in great expansion. Hydrogen, an elegant and simple energy transporter, could serve as means of transporting energy in the future. An ideal solution to the increasing energy needs would imply a renewable production of hydrogen. Out of all the existing possibilities for such a process, the biological production of hydrogen, also called biohydrogen, is an excellent alternative. Hydrogen is the end result or co-product of many pathways in bacterial metabolism. However, such pathways usually show low yields of substrate to hydrogen conversion, which prevents the development of efficient production processes. For example, when hydrogen is produced via nitrogenase under photofermentation conditions, each hydrogen molecule produced requires 4 molecules of ATP, rendering the process very energetically inefficient. Purple non-sulfur bacteria are highly adaptive organisms that can grow under various conditions. According to recent genomic analyses, Rhodospirillum rubrum and Rhodopseudomonas palustris possess, within their genome, an FeFe hydrogenase that would allow them to produce hydrogen via dark fermentation quite efficiently. Unfortunately, very little information is known on the regulation of the synthesis of this enzyme or the various pathways that require it. An overexpression of this hydrogenase could potentially increase the yields of substrate to hydrogen conversion. This study aims to increase our knowledge about this FeFe hydrogenase by overexpressing it in conditions that facilitate the production of hydrogen. The use of organic waste as substrate for hydrogen production will also be studied.